Articolo metodologico

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

DOI:

10.3791/60616

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8 marzo 2020

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1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Abstract

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I lipidi sono molecole anfipatiche strutturalmente diverse che sono insolubili in acqua. I lipidi sono contributori essenziali all'organizzazione e alla funzione delle membrane biologiche, dello stoccaggio e della produzione di energia, della segnalazione cellulare, del trasporto vescicolare delle proteine, della biogenesi dell'orgelli e della morte cellulare regolata. Poiché il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un euaryote unicellulare che consente di analizzare molecolari approfondite, il suo uso come organismo modello ha contribuito a scoprire meccanismi che collegano il metabolismo dei lipidi e il trasporto intracellulare a complessi processi biologici all'interno di cellule eucariotiche. La disponibilità di un metodo analitico versatile per una valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata delle principali classi di lipidi all'interno di una cellula di lievito è fondamentale per ottenere informazioni approfondite su questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae. Il metodo LC-MS/MS descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di numerose specie (comprese diverse forme isobariche o isomeriche) all'interno di ciascuna delle classi di 10 lipidi. Questo metodo è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcune specie di lipidi a concentrazioni a partire da 0,2 pmol/L. Il metodo è stato applicato con successo alla valutazione dei lipidomi delle cellule intere del lievito e dei loro organelli purificati. L'uso di additivi alternativi di fase mobile per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray in questo metodo può aumentare l'efficienza della ionizzazione per alcune specie lipidiche e può quindi essere utilizzato per migliorarne l'identificazione e la quantitazione.

Introduzione

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Un insieme di prove indica che i lipidi, una delle principali classi di biomolecole, svolgono un ruolo essenziale in molti processi vitali all'interno di una cellula eucarome. Questi processi includono l'assemblaggio di bistrati lipidici che costituiscono la membrana plasmatica e le membrane che circondano gli organelli cellulari, il trasporto di piccole molecole attraverso le membrane cellulari, la risposta ai cambiamenti nell'ambiente extracellulare e la trasduzione del segnale intracellulare, la generazione e lo stoccaggio dell'energia, l'importazione e l'esportazione di proteine confinate a diversi organelli, il traffico vescicolare di proteine all'interno del sis....

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Protocollo

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1. Preparazione di supporti sterili per la coltura del lievito

  1. Preparare 90 mL di un mezzo YP completo che contiene 1% (w/v) di estratto di lievito e 2% (w/v) bactopeptone.
  2. Preparare 90 mL di un mezzo YNB minimo sintetico contenente 0,67% (w/v) base di azoto di lievito senza aminoacidi, 20 mg/L L-histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L L-lisina, e 20 mg/L uracile.
  3. Dividere 90 mL del mezzo YP completo equamente in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
  4. Dividere 90 mL del mezzo yNB minimo sintetico in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
  5. Autoclave i flaastri con....

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Risultati

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Il nostro metodo per una valutazione quantitativa dei principali lipidi cellulari all'interno di una cellula di lievito con l'aiuto di LC-MS/MS era versatile e robusto. Ci ha permesso di identificare e quantificare 10 diverse classi di lipidi nelle cellule S. cerevisiae coltivate nel mezzo YNB minimo sintetico inizialmente contenente il 2% di glucosio. Queste classi lipidiche includono acidi grassi liberi (non esterificati) (FFA), CL, fitoceramide (PHC), fitosphingosine (PHS), PC.......

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Discussione

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Le seguenti precauzioni sono importanti per la corretta implementazione del protocollo descritto di seguito:

1. Il cloroformio e il metanolo sono tossici. Estraggono in modo efficiente varie sostanze dalle superfici, tra cui plasticware di laboratorio e la pelle. Pertanto, gestire questi solventi organici con cautela evitando l'uso di materie plastiche in passaggi che comportano il contatto con cloroformio e/o metanolo, utilizzando pipette di vetro borosilicato per questi passaggi e risciacqua.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa e il Centro per la genomica strutturale e funzionale (entrambe all'Università di Concordia) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482) e del Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. è stato sostenuto dal Concordia University Merit Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in teflonPYREX05-550
Fiale per campioni in vetro da 2 mL con tappi rivestiti in teflon FisherScientific60180A-SV9-1P
2-propanoloFisher ScientificA461-500
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Agilent 1100 series LC systemAgilent TecnologieG1312A
Piastra a pozzetti Agilent1100Agilent TechnologiesG1367A
Acetato di ammonioFisher ScientificA11450
Bicarbonato di ammonioSigma9830
Formiato di ammonioFisher ScientificA11550
Idrossido di ammonioFisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinaAvanti Lipidi polari750332
Centra CL2 centrifuga clinicaThermo Scientific004260F
CeramideAvanti Lipidi polari860517
cloroformioFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardAcque186006944Sistema a pre-colonna
Acidi grassi liberi (19:0)Matreya1028
Perle di vetro (lavate con acido, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
GlucosioFisher ScientificD16-10
EmatocitometroFisher Scientific267110
L-istidinaSigmaH8125
Software di ricerca lipidica (V4.1)Fisher ScientificV4.1Software di analisi LC-MS/
MSL-leucinaSigmaL8912
L-lisinaSigmaL5501
MetanoloFisher ScientificA4564
FosfatidilcolinaAvanti Lipidi polari850340
FosfatidiletanolamminaAvanti Lipidi polari850704
FosfatidilgliceroloAvanti Lipidi polari
FosfatidilinositoloAvanti Lipidi polariLM1502
FosfatidilserinaAvanti Lipidi polari840028
Colonna di fase inversa CSH C18Acque186006102
SfingosinaAvanti Lipidi polari860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricilgliceroloLarodan, MalmöTAG Miscelato FA
Sonicatore ad ultrasuoniFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific 2215365
Estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-2
Lievito base azotata senza aminoacidiFisher ScientificDF0919-15-3
Ceppo di lievito BY4742DharmaconYSC1049
840446

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
  2. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8)....

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Analisi del lipidomaEstrazione dei lipidiColtura cellulare di lievitoColonna C18 a fase inversaIonizzazione elettrosprayAdditivi della fase mobileDissociazione indotta da collisione

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