Articolo metodologico

Analisi quantitativa del Lipidome cellulare di Saccharomyces Cerevisiae Utilizzando la cromatografia Liquida Accoppiata con la Spettrometria di Massa Tandem

DOI:

10.3791/60616

⸱

8 marzo 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vi presentiamo un protocollo che utilizza la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem per identificare e quantificare i principali lipidi cellulari in Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto per una valutazione quantitativa delle principali classi lipidiche all'interno di una cellula di lievito è versatile, robusto e sensibile.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I lipidi sono molecole anfipatiche strutturalmente diverse che sono insolubili in acqua. I lipidi sono contributori essenziali all'organizzazione e alla funzione delle membrane biologiche, dello stoccaggio e della produzione di energia, della segnalazione cellulare, del trasporto vescicolare delle proteine, della biogenesi dell'orgelli e della morte cellulare regolata. Poiché il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae è un euaryote unicellulare che consente di analizzare molecolari approfondite, il suo uso come organismo modello ha contribuito a scoprire meccanismi che collegano il metabolismo dei lipidi e il trasporto intracellulare a complessi processi biologici all'interno di cellule eucariotiche. La disponibilità di un metodo analitico versatile per una valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata delle principali classi di lipidi all'interno di una cellula di lievito è fondamentale per ottenere informazioni approfondite su questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per utilizzare la cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae. Il metodo LC-MS/MS descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di numerose specie (comprese diverse forme isobariche o isomeriche) all'interno di ciascuna delle classi di 10 lipidi. Questo metodo è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcune specie di lipidi a concentrazioni a partire da 0,2 pmol/L. Il metodo è stato applicato con successo alla valutazione dei lipidomi delle cellule intere del lievito e dei loro organelli purificati. L'uso di additivi alternativi di fase mobile per la spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray in questo metodo può aumentare l'efficienza della ionizzazione per alcune specie lipidiche e può quindi essere utilizzato per migliorarne l'identificazione e la quantitazione.

Introduzione

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Un insieme di prove indica che i lipidi, una delle principali classi di biomolecole, svolgono un ruolo essenziale in molti processi vitali all'interno di una cellula eucarome. Questi processi includono l'assemblaggio di bistrati lipidici che costituiscono la membrana plasmatica e le membrane che circondano gli organelli cellulari, il trasporto di piccole molecole attraverso le membrane cellulari, la risposta ai cambiamenti nell'ambiente extracellulare e la trasduzione del segnale intracellulare, la generazione e lo stoccaggio dell'energia, l'importazione e l'esportazione di proteine confinate a diversi organelli, il traffico vescicolare di proteine all'interno del sistema endomembrana e della segreteria delle proteine, e diversi modi regolati di morte cellulare1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.

Il lievito in erba S. cerevisiae, un organismo eucariotico unicellulare, è stato utilizzato con successo per scoprire alcuni dei meccanismi alla base dei ruoli essenziali dei lipidi in questi processi cellulari vitali4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae è un organismo modello prezioso per scoprire questi meccanismi perché è suscettibile di biochimica completa, genetica, cellula biologica, biologica chimica, sistema biologica, e microfluidica dissezione analisi21,22,23,24,25. Ulteriori progressi nella comprensione dei meccanismi attraverso i quali il metabolismo lipidico e il trasporto intracellulare contribuiscono a questi processi cellulari vitali richiedono tecnologie sensibili di spettrometria di massa per la caratterizzazione quantitativa del lipidome cellulare, la comprensione della complessità molecolare lipidoma e l'integrazione della lipidomica quantitativa in una piattaforma multidisciplinare della biologia dei sistemi1,2,3,26, 27,28,29,30.

Gli attuali metodi per la lipidomica quantitativa assistita dalla spettrometria di massa delle cellule di lievito e delle cellule di altri organismi eucarioti non sono sufficientemente versatili, robusti o sensibili. Inoltre, questi metodi attualmente utilizzati non sono in grado di distinguere varie specie di lipidi isobarici o isomeriche l'una dall'altra. Qui descriviamo un metodo versatile, robusto e sensibile che permette l'uso di cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei principali lipidi cellulari di S. cerevisiae.

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Protocollo

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1. Preparazione di supporti sterili per la coltura del lievito

  1. Preparare 90 mL di un mezzo YP completo che contiene 1% (w/v) di estratto di lievito e 2% (w/v) bactopeptone.
  2. Preparare 90 mL di un mezzo YNB minimo sintetico contenente 0,67% (w/v) base di azoto di lievito senza aminoacidi, 20 mg/L L-histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L L-lisina, e 20 mg/L uracile.
  3. Dividere 90 mL del mezzo YP completo equamente in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
  4. Dividere 90 mL del mezzo yNB minimo sintetico in due flaconi Erlenmeyer da 250 mL (cioè 45 mL ciascuno).
  5. Autoclave i flaastri con supporti YP e YNB a 15 psi/121 s per 45 min prima dell'uso.

2. Ceppo di lievito

  1. Utilizzare il ceppo di tipo selvaggio BY4742(MAT- 1 leu2 - 0 lys2 - 0 ura30).

3. Lievito di coltura nel mezzo YP completo con glucosio

  1. Autoclave una soluzione di riserva del 20% (w/v) di glucosio a 15 psi/121 C per 45 min prima dell'uso.
  2. Aggiungere 5 mL della soluzione sterile 20% (w/v) di glucosio a ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YP sterile per una concentrazione finale di 2% glucosio (w/v).
  3. Utilizzare un ciclo microbiologico per inoculare le cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742 in ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YP con glucosio.
  4. Coltura le cellule durante la notte a 30 s con agitazione rotazionale a 200 rpm.
  5. Prendete una aliquota di cultura del lievito. Utilizzare un emocitometro per determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura.

4. Trasferire il lievito e coltivarli nel mezzo YNB minimale sintetico con glucosio

  1. Aggiungere 5 mL della soluzione sterile 20% (w/v) di glucosio a ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YNB sterile ad una concentrazione finale del 2% di glucosio (w/v).
  2. Utilizzare una pipetta sterile per trasferire un volume della coltura di lievito overnight che contiene il numero totale di 5,0 x 107 cellule in ciascuno dei due flaconi Erlenmeyer contenenti il mezzo YNB con glucosio.
  3. Coltura le cellule per almeno 24 h (o più, se l'esperimento richiede) a 30 gradi centigradi con scosse rotazionali a 200 giri/min.

5. Preparazione di reagenti, labware e attrezzature per l'estrazione dei lipidi

  1. Preparare quanto segue: 1) di alto livello (>99,9%) cloroformio; 2) grado elevato (>99,9%) metanolo; 3) 28% (v/v) soluzione di idrossido di ammonio in acqua nano-pura; 4) perline di vetro (lavate con acido, 425-600 M); 5) un vortice con adattatore appropriato; 6) tubi di centrifuga di vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene; 7) 17:1 e 2:1 miscele di cloroformio e metanolo; 8) una miscela di cloroformio/metanolo (2:1) con 0,1% di idrossido di ammonio (v/v); 9) Soluzione ABC (155 mM di bicarbonato di ammonio, pH - 8,0); 10) una miscela di norme interne in materia di lipidi preparate in una miscela 2:1 di cloroformio e metanolo, come indicato nella tabella 1; e 11) 2 mL di campioni di vetro con tappi foderati in politetrafluoretilene per l'estrazione dei lipidi cellulari.

6. Preparazione di reagenti, labware e attrezzature per LC

  1. Preparare la seguente miscela: 1) acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5); 2) un vortice con adattatore appropriato; 3) un sonicatore ad ultrasuoni; 4) fiale di vetro con inserti per un pozzo; 5) un sistema LC dotato di una pompa binaria, degasser e un autocampionatore; 6) una colonna C18 in fase inversa (2,1 mm; 75 mm; dimensione dei pori 130 e gamma di pH di 1-11) accoppiato a un sistema pre-colonna; 7) miscela A: acetonitrile/acqua (60:40); e 8) miscela B: isopropanolo/acetonitrile (90:10).

7. Estrazione di lipidi dalle cellule di lievito

  1. Prendete una aliquota di cultura del lievito. Utilizzare un emocitometro o misurare OD600 per determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura.
  2. Prendere un volume di coltura lievito che contiene un numero totale di 5,0 x 107 celle (3,3 unità OD600). Collocare questo volume di coltura in un tubo di microcentrifuga prechilled da 1,5 mL.
  3. Raccogliere le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
  4. Aggiungere 1,5 mL di acqua nanopura ghiacciata e lavare le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
  5. Aggiungere 1,5 mL di soluzione ABC ghiacciata e lavare le cellule con centrifugazione a 16.000 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato. Il pellet cellulare può essere conservato a -80 gradi centigradi prima dell'estrazione dei lipidi.
  6. Per iniziare l'estrazione dei lipidi, scongelare il pellet cellulare sul ghiaccio.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 200 o più acqua nano-pura ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifugatura superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 mL con un cappuccio foderato in politetrafluoroetilene. Aggiungere quanto segue a questo tubo: 1) 25 - L della miscela di standard lipidici interni preparati in cloroformio/metanolo (2:1) miscela; 2) 100 L l di 425-600 M di perline di vetro lavate con acido; e 3) 600 l di cloroformio/metanolo (17:1).
  8. Vorticare il tubo ad alta velocità per 5 min a temperatura ambiente (RT) per disturbare le cellule.
  9. Vorticare il tubo a bassa velocità per 1 h a RT per facilitare l'estrazione di lipidi.
  10. Incubare il campione per 15 min sul ghiaccio per promuovere la precipitazione proteica e la separazione delle fasi acquose e organiche l'una dall'altra.
  11. Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 5 min a RT. Questa fase di centrifugazione permette di separare la fase acquosa superiore dalla fase organica inferiore, che contiene tutte le classi lipidiche.
  12. Utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore (400 dollari l) ad un altro tubo di centrifuga superiore a vite in vetro ad alta resistenza da 15 mL con un cappuccio foderato in politetrafluoroetilene. Non interrompere le perline di vetro o la fase acquosa superiore durante tale trasferimento. Mantenere la fase organica inferiore sotto il flusso di gas di azoto.
  13. Aggiungere 300 l of cloroformina-metanolo (2:1) miscela alla fase acquosa superiore rimanente per consentire l'estrazione di sphingolipids e PA, PS, PI e CL. Vorticare vigorosamente il tubo per 5 min a RT.
  14. Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 5 min a RT.
  15. Utilizzare una pipetta di vetro borosilicato per trasferire la fase organica inferiore (200 gradi centigradi) formata dopo la centrifugazione nella fase organica raccolta al punto 7.13.
  16. Utilizzare il flusso di gas di azoto per far evaporare il solvente nelle fasi organiche combinate. Chiudere i tubi contenenti la pellicola lipidica sotto il flusso di gas di azoto. Conservare questi tubi a -80 gradi centigradi.

8. Separazione dei lipidi estratti da LC

  1. Aggiungere 500 l di miscela di acetonitrile/2-propanol/nano-pura (65:35:5) a un tubo contenente la pellicola lipidica ottenuta al punto 7.16. Vortice il tubo 3x per 10 s a RT.
  2. Sottoporre il contenuto del tubo alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 min. Vortex il tubo 3x per 10 s a RT.
  3. Prendere 100 l di un campione dal tubo e aggiungerlo a una fiala di vetro con un inserto utilizzato per un pozzo. Eliminare le bolle d'aria nell'inserto prima di scorrendo nella piastra.
  4. Utilizzare un sistema LC per separare diverse specie di lipidi su una colonna C18 in fase inversa CSH accoppiato a un sistema pre-colonna (vedere Tabella dei materiali). Durante la separazione, mantenere la colonna a 55 gradi centigradi e ad una portata di 0,3 mL/min.
  5. Utilizzare le fasi mobili costituite dalla miscela A (acetonitrile/acqua [60:40 (v/v)]) e dalla miscela B (isopropanolo/acetonitrile [90:10 (v/v)]). Per una modalità positiva di rilevamento degli ioni genitori creata utilizzando la sorgente iossioni a ionizzazione elettrospray (ESI), la modalità ESI, le fasi mobili A e B contengono il formato di ammonio alla concentrazione finale di 10 mM. Per una modalità negativa di rilevamento degli ioni dei genitori, la modalità ESI (-), le fasi mobili A e B contengono acetato di ammonio alla concentrazione finale di 10 mM.
  6. Per l'iniezione, utilizzare un volume campione di 10 -L per l'iniezione sia in modalità ESI che in modalità ESI (-).
  7. Separare diverse specie lipidiche da LC utilizzando il seguente gradiente LC: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 10-21 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
  8. Eseguire gli spazi vuoti di estrazione come primo campione, tra ogni quattro campioni e come ultimo campione. Sottrarre lo sfondo per normalizzare i dati.
  9. Un cromatogramma iografico totale rappresentativo dai dati LC/MS dei lipidi estratti dalle cellule del ceppo di tipo selvaggio BY4742 è mostrato nella Figura 1.

9. Analisi spettrometrica di massa dei lipidi separati da LC

  1. Utilizzare uno spettrometro di massa dotato di una fonte di ioni HESI (ionizzazione elettrospray riscaldata) per analizzare i lipidi separati da LC. Utilizzare le impostazioni fornite nella tabella 2.
  2. Utilizzare l'analizzatore di trasformazioni Fourier per rilevare gli ioni padre (MS1) con una risoluzione di 60.000 e all'interno dell'intervallo di massa di 150-2.000 Da.
  3. Utilizzare le impostazioni fornite nella tabella 3 per rilevare gli ioni secondari (MS2).

10. Identificazione e quantificazione di diverse classi e specie lipidiche mediante l'elaborazione di dati grezzi da LC-MS/MS

  1. Consultare la Tabella dei materiali per il software per eseguire l'identificazione e la quantificazione di diversi lipidi da file LC-MS/MS grezzi. Questo software utilizza il più grande database lipidico, contenente più di 1,5 milioni di precursori di ioni lipidi (MS1) e i loro ioni di frammento previsti (MS2). Il software utilizza anche picchi MS1 per la quantitazione lipidica e MS2 per l'identificazione dei lipidi. Un cromatogramma rappresentativo di due forme di fosfatidilserina isomeriche (34:0) che hanno lo stesso valore m/z ma tempi di conservazione diversi, nonché i relativi spettri MS1 e MS2, sono mostrati rispettivamente nella Figura 2, Figura 3e Figura 4.
  2. Cerca nei file non elaborati LC-MS contenenti dati MS1 full-scan e dati MS2 dipendenti dai dati per acidi grassi (FFA) gratuiti (non esterificati), cardiolipina (CL), fitoceramide (PHC), fitosphingosina (PHS), fosfatidylcholine (PC), fosfatidylelethano lamina mina (PE), il fosofilylglycerolo (PG), il fosofatidiylinositolo (PI), la fossphatidylserine (PS) e le classi di lipidi triacylglycerolo (TAG) utilizzando una tolleranza m/z di 5 ppm per gli ioni precursori e 10 ppm per gli ioni di prodotto. Altri parametri di ricerca sono riportati nella tabella 4. Seguire le istruzioni fornite nel manuale dell'utente del software. Le identità degli standard lipidici interni e delle specie lipidiche con composizione insolita di acidi grassi devono essere verificate manualmente.
  3. Per identificare e quantificare diverse classi e specie di lipidi con l'aiuto di alternative open source liberamente disponibili per il software Lipid Search, utilizzare il software Lipid Data Analyzer (http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml), M'mine 2 (http://mzmine.github.io/) o XCMS (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html) per elaborare dati non elaborati da LC-MS/MS.

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Risultati

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Il nostro metodo per una valutazione quantitativa dei principali lipidi cellulari all'interno di una cellula di lievito con l'aiuto di LC-MS/MS era versatile e robusto. Ci ha permesso di identificare e quantificare 10 diverse classi di lipidi nelle cellule S. cerevisiae coltivate nel mezzo YNB minimo sintetico inizialmente contenente il 2% di glucosio. Queste classi lipidiche includono acidi grassi liberi (non esterificati) (FFA), CL, fitoceramide (PHC), fitosphingosine (PHS), PC...

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Discussione

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Le seguenti precauzioni sono importanti per la corretta implementazione del protocollo descritto di seguito:

1. Il cloroformio e il metanolo sono tossici. Estraggono in modo efficiente varie sostanze dalle superfici, tra cui plasticware di laboratorio e la pelle. Pertanto, gestire questi solventi organici con cautela evitando l'uso di materie plastiche in passaggi che comportano il contatto con cloroformio e/o metanolo, utilizzando pipette di vetro borosilicato per questi passaggi e risciacqua...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa e il Centro per la genomica strutturale e funzionale (entrambe all'Università di Concordia) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482) e del Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. è stato sostenuto dal Concordia University Merit Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in teflonPYREX05-550
Fiale per campioni in vetro da 2 mL con tappi rivestiti in teflon FisherScientific60180A-SV9-1P
2-propanoloFisher ScientificA461-500
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Agilent 1100 series LC systemAgilent TecnologieG1312A
Piastra a pozzetti Agilent1100Agilent TechnologiesG1367A
Acetato di ammonioFisher ScientificA11450
Bicarbonato di ammonioSigma9830
Formiato di ammonioFisher ScientificA11550
Idrossido di ammonioFisher ScientificA470-250
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CardiolipinaAvanti Lipidi polari750332
Centra CL2 centrifuga clinicaThermo Scientific004260F
CeramideAvanti Lipidi polari860517
cloroformioFisher ScientificC297-4
CSH C18 VanGuardAcque186006944Sistema a pre-colonna
Acidi grassi liberi (19:0)Matreya1028
Perle di vetro (lavate con acido, 425-600 μ M)Sigma-AldrichG8772
GlucosioFisher ScientificD16-10
EmatocitometroFisher Scientific267110
L-istidinaSigmaH8125
Software di ricerca lipidica (V4.1)Fisher ScientificV4.1Software di analisi LC-MS/
MSL-leucinaSigmaL8912
L-lisinaSigmaL5501
MetanoloFisher ScientificA4564
FosfatidilcolinaAvanti Lipidi polari850340
FosfatidiletanolamminaAvanti Lipidi polari850704
FosfatidilgliceroloAvanti Lipidi polari
FosfatidilinositoloAvanti Lipidi polariLM1502
FosfatidilserinaAvanti Lipidi polari840028
Colonna di fase inversa CSH C18Acque186006102
SfingosinaAvanti Lipidi polari860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
TricilgliceroloLarodan, MalmöTAG Miscelato FA
Sonicatore ad ultrasuoniFisher Scientific15337416
UracilSigmaU0750
VortexFisher Scientific 2215365
Estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-2
Lievito base azotata senza aminoacidiFisher ScientificDF0919-15-3
Ceppo di lievito BY4742DharmaconYSC1049
840446

Riferimenti

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