Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

I topi sono serviti come il classico organismo modello per lo studio delle malattie umane, compresa la malignità. Come mammiferi, condividono molte somiglianze con gli esseri umani. Il loro alto grado di somiglianza genetica ha permesso la manipolazione transgenica del genoma del topo per fornire enormi informazioni sul controllo genetico delle malattie umane¹. Un'ampia esperienza nella gestione e sperimentazione dei topi ha portato al loro essere il modello di scelta per la ricerca biomedica. Tuttavia, oltre alle preoccupazioni etiche e scientifiche riguardanti i modelli murini, possono anche essere piuttosto costose e dispendiose in termini di tempo^2,3. Lo sviluppo dei tumori può richiedere settimane o addirittura mesi. L'alloggiamento in un'istituzione tipica da solo può funzionare in centinaia a migliaia di dollari mentre i tumori si stanno sviluppando. Il cancro ovarico è un esempio di questo inconveniente perché la sua crescita nei modelli murini può facilmente richiedere mesi. I ritardi nei progressi della ricerca hanno un potenziale impatto sul tasso di sopravvivenza a 5 anni dei pazienti affetti da cancro ovarico, pari solo al 47% (ossia un aumento della sopravvivenza di appena il 10% in 30 anni)⁴. Allo stesso modo, i tumori urologici (cancro del rene, della prostata e della vescica) costituiscono il 19% di tutti i casi di cancro negli Stati Uniti e l'11% dei decessi correlati al cancro⁴. Così, un nuovo approccio in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici potrebbe far risparmiare a un laboratorio molto tempo, lavoro e denaro, anche se questo modello viene applicato solo agli esperimenti di screening iniziali. Inoltre, la conseguente accelerazione dei risultati della ricerca potrebbe avere un impatto significativo i 177.000 individui diagnosticati con questi cancri ogni anno.

Il modello CAM di pollo offre molti vantaggi che affrontano i problemi di cui sopra. Un modello popolare per studiare l'angiogenesi^5,6, invasione delle cellule tumorali^7,8, e metastasi^7,9, il modello CAM embrione pulcino è già stato utilizzato per studiare molte forme di cancro, tra cui glioma^10,11,12, testa e collo carcinoma a cellule squamose^13,14, leucemia^15,16, cancro al pancreas¹⁷, cancro colorettale¹⁸. Inoltre, sono stati generati modelli CAM per neuroblastoma¹⁹, linfoma Burkitt²⁰, melanoma²¹e fibrosarcoma felino²². Studi precedenti hanno anche presentato l'innesto di cancro della vescica²³ e linee cellulari del cancro alla prostata²⁴, ma con dettagli di protocollo limitati. Non solo le uova sono molto più economiche dei topi, ma producono anche risultati altamente riproducibili^25,26. Essi mostrano lo sviluppo di vascolatura veloce, e l'afflusso di tumore può verificarsi in più rapidamente come pochi giorni ed essere visualizzato longitudinalmente attraverso la finestra aperta. Con il periodo di tempo di 21 giorni tra la fecondazione ovula e la schiusa, gli esperimenti possono essere completati in poche settimane. Inoltre, il basso costo, le limitate esigenze abitative e le piccole dimensioni consentono facilmente esperimenti su larga scala che sarebbero proibitivi per gli studi sui topi.

Pertanto, abbiamo cercato di ottimizzare il modello CAM per l'innesto di tumori ginecologici e urologici. A causa dello stato immunocompromesso del primo embrione di pollo²⁷, sia le cellule del topo che quella umana possono essere facilmente impiantate. Come tale, abbiamo innestato con successo tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Per ciascuno di questi tipi di tumore, la CAM accetta prontamente le linee cellulari del topo e/o del tumore umano. È importante sottolineare che i tessuti tumorali primari appena raccolti possono anche innestare cellule digerite o pezzi di tessuto solido con alti tassi di successo. Ognuno di questi tipi di cancro e fonti cellulari richiede ottimizzazione, che condividiamo qui.

Tutti gli esperimenti qui presentati sono stati esaminati e approvati dai comitati etici competenti dell'Università della California, Los Angeles (UCLA). L'uso di tumori umani primari e identificati è stato approvato dall'UCLA Institutional Review Board (numeri di protocollo 17-000037, 17-001169 e 11-001363). All'UCLA, la revisione del Comitato per la ricerca sugli animali non è necessaria per gli esperimenti che utilizzano embrioni di pollo; l'approvazione del protocollo è necessaria solo quando le uova saranno covate. Tuttavia, le migliori pratiche, come le linee guida AVMA per l'eutanasia degli animali, sono state utilizzate per gestire gli embrioni di pollo in modo etico ed evitare il più possibile il dolore. I ricercatori sono invitati a verificare i requisiti di supervisione presso il loro istituto prima di iniziare gli studi utilizzando modelli CAM.

1. Preparazione delle uova

1. Prima di ricevere le uova, assemblare ed eclantizzare l'incubatrice di uova a 37,8 gradi centigradi con 60-70% di umidità seguendo le istruzioni del produttore.
   NOTA: per ridurre al minimo i rischi di contaminazione, l'acqua autoclava può essere utilizzata per controllare l'umidità.
2. Dopo aver ricevuto le uova di gallina rossa del Rhode Island da un fornitore di uova di laboratorio certificato, pulisci a secco la superficie delle conchiglie con asciugamani di carta. Un tovagliolo di carta leggermente smorzato può essere utilizzato per rimuovere il materiale aderito. Asciugare immediatamente.
   NOTA: Bagnare il guscio con liquidi al di sotto di 43,3 gradi centigradi può introdurre batteri nell'uovo. Se si sceglie di lavare o disinfettare le uova, la temperatura del liquido deve essere compresa tra 43,3 e 48,9 gradi centigradi. Temperature più elevate possono far bollire le uova. La scelta del disinfettante deve essere effettuata in base ai microrganismi che destano preoccupazione.
3. Utilizzare una matita o un pennarello per etichettare la data sull'uovo. Questo è considerato giorno di sviluppo 0.
4. Mettere le uova nell'incubatrice di uova e incubare per almeno 7 giorni con rotazione per consentire lo sviluppo della CAM. Può essere utilizzato un rotatore automatico, o le uova possono essere ruotate di 180 s 2-3 volte al giorno.

2. Aprire le uova

NOTA: L'apertura delle uova deve essere effettuata quando il CAM si è completamente sviluppato. Questo è in genere il giorno di sviluppo 7 o 8.

1. Disinfettare un armadio di biosicurezza con il 70% di etanolo. Allo stesso modo disinfettare e posizionare nell'armadio biosicurezza un portauovo, candela uovo, marcatore, strumento rotativo cordless con una pietra di macinazione carbide in silicio e ruota di taglio circolare, 18 G ago, controller pipet con tubo sottovuoto, nastro di imballaggio, ufficio forbici, forbici curve, pinze Semken (o simili), batuffoli di cotone e pellicole trasparenti da 6 x 7 cm. Quando possibile, utilizzare strumenti sterili, usa e getta o autoclaved.
2. Spegni il rotatore dell'uovo. Mettere circa 1-3 uova nell'armadietto della biosicurezza sul rack delle uova. Mentre al buio, posizionare il candelare uovo contro il guscio d'uovo per identificare la cella d'aria. Contrassegnare la posizione della cella d'aria.
   NOTA: L'intensità dell'illuminazione dal candelae è fondamentale per visualizzare l'interno dell'uovo. Se la cella d'aria o la vascolatura è costantemente difficile da vedere, provare a sostituire le batterie a candela d'uovo.
3. Spostare il candelare uovo sopra il guscio per trovare una grande rete di vasi sanguigni. Ruotare l'uovo se necessario. Una vascolatura ideale sarà ramificazione vicino al centro dell'uovo. Utilizzare un pennarello per disegnare sulla vascolatura da utilizzare per l'impianto.
4. Accendere la luce nel cofano. Utilizzando uno strumento rotativo cordless dotato di una pietra di macinazione in carbide in silicio, praticare un piccolo foro nel guscio direttamente sopra il centro della cella d'aria. Forare fino a quando la maggior parte del guscio è stato rimosso, ma la membrana interna bianca è intatta.
   NOTA: La perforazione sulla cella d'aria prima di colpire la vascolatura consente di determinare lo spessore di quel particolare guscio d'uovo sulla cella d'aria piuttosto che sulla CAM e sulla vascolatura. Se il CAM o la vascolatura viene interrotta, l'uovo non è utilizzabile per l'impianto.
5. Forare e aprire un altro piccolo foro in cui la finestra vascolare verrà aperta come è stato fatto per la cella d'aria (passaggio 2.4).
6. Utilizzando un ago da 18 G, perforare delicatamente attraverso la membrana interna bianca sopra la cella d'aria e la vascolatura. Se non è possibile penetrare il guscio, quindi forare con attenzione un po 'di più. Assicurarsi che la membrana interna bianca (ma non il CAM) venga interrotta per tutta l'area forata. La rimozione del pezzo di membrana non è necessaria.
   NOTA: Se il CAM o la vascolatura viene interrotta durante questa fase, eliminare l'uovo. Il danno è evidente se c'è sangue o albumina che fuoriesce da un foro forato.
7. Spegnere la luce del cofano. Utilizzando il candeladino a uovo, verificare che la cella d'aria sia stata trasferita dalla fine dell'uovo all'area sopra la vascolatura. Se necessario, posizionare il tubo sottovuoto inserito in un controller di pipet intorno al foro sopra la cella d'aria originale e applicare delicatamente l'aspirazione in brevi raffiche per spostare la cella d'aria.
8. Utilizzare un marcatore per delineare la nuova posizione della cella d'aria di circa 0,5 cm all'interno del contorno aria-CAM. Appisci un pezzo di nastro da imballaggio appena sopra la nuova cella d'aria. Se necessario, utilizzare le forbici da ufficio standard per tagliare il nastro a una dimensione appropriata.
   NOTA: Il nastro può interrompere il flusso d'aria attraverso il guscio e non deve essere più grande del necessario per coprire completamente la cella d'aria.
9. Riportare le uova all'incubatrice a riscaldarsi senza rotazione con la nuova cella d'aria rivolta verso l'alto. Ripetere i passaggi da 2,2 a 2,9 per aprire le uova rimanenti.
   NOTA: il protocollo potrebbe essere sospeso qui. Se non si è sicuri della qualità dello sviluppo CAM, un piccolo numero di uova dovrebbe procedere attraverso la fase 2.16 prima di aprire le uova rimanenti.
10. Collocare circa 1-3 uova con celle d'aria ricollocate sul rack delle uova nell'armadietto della biosicurezza.
    NOTA: Occorre prestare attenzione per evitare di introdurre contaminazione nell'uovo aperto. Pertanto, sempre aprire le uova all'interno di un armadio di biosicurezza, e utilizzare strumenti sterili e attrezzature quando possibile.
11. Utilizzando uno strumento rotativo cordless dotato di una ruota di taglio circolare, tagliare una piccola linea sopra il contorno della cella d'aria disegnato nel passaggio 2.8. Assicurarsi che si tratti di circa 0,5 cm all'interno del limite aria-CAM effettivo per evitare di interrompere il CAM o la vascolatura. Tagliare completamente attraverso il guscio, ma fare attenzione a non penetrare abbastanza profondamente da interrompere la CAM o la vascolatura.
12. Utilizzando le forbici curve, tagliare intorno alla cella d'aria rimanente per creare una finestra nel guscio.
    NOTA: Se sangue o membrana è presente sul guscio rimosso, l'uovo non è adatto per l'impianto. Se un'alta percentuale delle uova non viene aperta in modo pulito, prendere in considerazione l'attesa di almeno 1 giorno aggiuntivo per aprire le uova rimanenti per consentire una migliore formazione del CAM. Se i gusci delle uova rimanenti non sono stati forati, la rotazione delle uova all'interno dell'incubatrice deve essere ripresa.
13. Verificare la vitalità dell'embrione. Gli embrioni vitali mostreranno un'ampia vascolatura, albumina chiara, movimento degli embrioni o un battito cardiaco visibile.
14. Utilizzando pinze Semken, estrarre piccoli pezzi di cotone da un batuffolo di cotone sterile. Asciugare delicatamente la superficie CAM per rimuovere la polvere e i detriti del guscio.
    NOTA: La rimozione dei detriti deve essere eseguita lo stesso giorno in cui le uova vengono aperte.
15. Coprire l'apertura del guscio con un pezzo di pellicola trasparente di un quarto di pellicola trasparente di 6 x 7 cm.
16. Riportare le uova all'incubatrice. Assicurarsi che l'uovo si sieda saldamente con la finestra aperta rivolta verso l'alto e il CAM non toccare la pellicola trasparente. Utilizzare un pezzo di cremagliera uovo, il bordo del rotatore uovo, o un altro elemento adatto per puntellare tutte le uova che continuano a rotolare.
17. Ripetere i passaggi da 2,10 a 2,16 per aprire tutte le uova rimanenti.
    NOTA: l'apertura delle uova non deve essere completata lo stesso giorno dell'impianto. Aspettare almeno 1 giorno può aiutare a eliminare le uova la cui vitalità è stata compromessa aprendo il guscio.

3. Preparazione della sospensione delle cellule tumorali per il trapianto (opzione 1)

NOTA: Questo deve essere completato appena prima dell'impianto, che dovrebbe idealmente avvenire tra i giorni 7 e 10. Si prega di consultare le note all'inizio dei passaggi 5 o 6 per ulteriori informazioni sulla data di impianto. Questo approccio è stato utilizzato per tutte le linee cellulari e digeristi tumorali del cancro del rene coltivati.

1. Scongelare la soluzione a matrice extracellulare sul ghiaccio.
2. Utilizzando la digestione meccanica e/o ezimatica, ottenere una sospensione a cella singola utilizzando un metodo appropriato per il tipo di cellula in fase di impiantazione.
3. Risospendere il numero totale di cellule da impiantare in un mezzo appropriato per l'impianto. Gli impianti di 1-2 x 10⁶ celle per uovo sono tipici.
   NOTA: Il mezzo utilizzato per l'impianto delle linee cellulari è in genere il mezzo completo utilizzato per la coltura delle cellule, contenente FBS o sostituzione del siero. L'impianto di digerimento del tumore in genere utilizza il mezzo completo utilizzato per la coltura di linee cellulari dello stesso tipo di cancro. Tuttavia, le regolazioni alla formulazione media possono essere apportate se necessario sperimentalmente. Gli effetti sullo sviluppo e la crescita del tumore dovrebbero essere determinati empiricamente.
4. Pellet le cellule utilizzando una velocità di centrifuga e il tempo appropriato per le cellule utilizzate. Le velocità tipiche sono 250-300 x g, e i tempi sono 5-10 min.
5. Rimuovere il supernatante dalle celle pellettate tramite pipettaggio. Risospendere meccanicamente le cellule nel mezzo residuo tramite sfarfallio o pipettaggio. Mettere sul ghiaccio per raffreddare. Misurare il volume delle celle e del mezzo utilizzando un pipet di dimensioni appropriate.
6. Calcolare i volumi di impianto in modo che 1-2 x 10⁶ cellule siano impiantate in un volume di 20-100 l per uovo con una concentrazione di matrice extracellulare finale di 2,7-4 mg/mL. Aggiungere medio, eventuali fattori di crescita desiderati o additivi, e soluzione matrice extracellulare secondo questo calcolo. Mantenere sul ghiaccio fino a quando pronto per l'impianto.
   NOTA: Per i calcoli nei passaggi 3.3 e 3.6, deve essere incorporato un volume extra di almeno mezzo impianto di uova per garantire un volume adeguato per tutte le uova del gruppo. Per l'impianto delle linee cellulari del cancro ovarico (ad esempio, SKOV3 e ID8), sono state impiantate 10⁶ cellule per uovo. Per l'impianto della linea cellulare del carcinoma a cellule renali RENCA, cellule coltivate derivate da carcinoma a cellule renali primarie digerito, linee cellulari del cancro alla prostata (ad esempio, CWR, C4-2 e MyC-CaP) e linee cellulari tumorali della vescica (cioè, HT-1376 e T24), 2 x 10⁶ cellule sono state impiantate.

4. Preparazione di pezzi tumorali per l'impianto (opzione 2)

NOTA: Questo deve essere completato appena prima dell'impianto, che dovrebbe idealmente avvenire tra i giorni 7 e 10. Si prega di consultare le note all'inizio dei passaggi 5 o 6 per ulteriori informazioni sulla data di impianto. I tumori primari delle ovaie e della vescica sono stati impiantati come pezzi di tumore.

1. Scongelare la soluzione a matrice extracellulare sul ghiaccio. Diluire a una concentrazione proteica finale di 2,7-4 mg/mL in un mezzo appropriato contenente eventuali fattori di crescita o additivi desiderati. Tieniti sul ghiaccio.
   NOTA: L'impianto di pezzi di tumore utilizza in genere il mezzo completo utilizzato per coltivare linee cellulari dello stesso tipo di cancro. Tuttavia, gli adeguamenti alla formulazione media possono essere effettuati se necessario sperimentalmente. Gli effetti sull'innesto e sulla crescita del tumore dovrebbero essere determinati empiricamente.
2. Utilizzando un bisturi o forbici, pezzi di accisa dal tumore fresco. Le dimensioni ideali variano da 2 a 5 mm su ciascun lato. Mantenere i tessuti immersi nel mezzo fino a quando non sono pronti per l'impianto.

5. Impianto con un anello antiaderente (opzione 1)

NOTA: Le cellule possono essere impiantate a partire dal giorno di sviluppo 7 se il CAM è completamente sviluppato. L'impianto può avvenire in qualsiasi momento prima della schiusa che consente un tempo adeguato per lo sviluppo del tumore e l'esperimento desiderato, ma si noti che le cellule immunitarie dell'embrione iniziano ad essere presenti intorno al giorno 10 postfezazione²⁷. Il tasso di crescita del tumore varia considerevolmente in base al tipo di cellula e deve essere determinato empiricamente per il tipo di frequenza cellulare. Il cancro ovarico e le cellule tumorali della prostata sono stati impiantati utilizzando il metodo dell'anello antiaderente. Si noti che quando un anello antiaderente non è disponibile, una punta del pipet può essere tagliata a dimensioni simili e utilizzata.

1. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare un armadio di biosicurezza e tutti gli strumenti necessari: un rack di uova, pinze a iride curva, anelli antiaderenti (1/4 di diametro interno), asta di asta di agitazione del vetro, tubi di volume appropriati e punte, pellicola trasparente 6 x 7 cm, forbici da ufficio e pennarello o matita. Quando possibile, devono essere utilizzati strumenti sterili, usa e getta o autoclaved.
2. Posizionare le uova da impiantare su un porta uova in un armadietto di biosicurezza. Selezionare un numero gestibile di uova. Fino a sei è tipico. Evitare di lasciare che le uova si raffreddino sostanzialmente mentre si lavora con loro.
3. Rimuovere la medicazione trasparente della pellicola dal guscio facendo rotolare i bordi verso la finestra aperta per evitare di estrarre pezzi di guscio. Verificare che le uova siano vitali e sane. Uova ideali avranno una grande nave al centro della zona aperta con vasi più piccoli ramificazione da esso.
4. Utilizzando pinze a iride curve, posizionare un anello sterile e antiaderente sulla CAM sopra il recipiente, idealmente su un punto di diramazione. Utilizzare un'asta sterile di mescolare il vetro per abradere delicatamente la CAM.
5. Pipet la sospensione cellulare dal passo 3.6 nel centro dell'anello antiaderente. In alternativa, utilizzare le pinze per posizionare un pezzo di tumore dal punto 4.2 al centro dell'anello antiaderente e coprire con 20-50 l della soluzione a matrice extracellulare generata nel passaggio 4.1.
6. Sigillare l'apertura con un pezzo di pellicola trasparente di un quarto di pellicola trasparente da 6 x 7 cm. Etichettare le uova con una designazione appropriata dell'impianto.
   NOTA: la numerazione delle uova all'interno di un gruppo facilita le osservazioni longitudinali.
7. Riportare l'uovo nell'incubatrice. Assicurarsi che l'apertura del guscio si sieda in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.
   NOTA: Le uova possono essere restituite a un'incubatrice di uova senza rotazione. In alternativa, è possibile ottenere un'elevata vitalità postimpianto utilizzando un'incubatrice a celle 37-38 gradi con CO₂ disattivata e un igrometro per monitorare l'umidità, che dovrebbe essere del 50%-80%.

6. Impianto senza anello antiaderente (opzione 2)

NOTA: Le cellule possono essere impiantate a partire dal giorno di sviluppo 7 se il CAM è completamente sviluppato. L'impianto può avvenire in qualsiasi momento prima della schiusa che consente un tempo adeguato per lo sviluppo del tumore e l'esperimento desiderato, ma si noti che le cellule immunitarie dell'embrione iniziano ad essere presenti intorno al giorno 10 postfezazione²⁷. Questo metodo è stato utilizzato per l'impianto delle cellule carcinoma a cellule renali e delle cellule tumorali della vescica.

1. Utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare un armadio di biosicurezza e tutti gli strumenti necessari: pipet e punte di volume appropriati, sterili piatti per la coltura dei tessuti di 10 cm, cremaperla uovo, medicazione per pellicole trasparente 6 x 7 cm, forbici da ufficio e pennarello.
2. Aspirati un volume di inoculazione della sospensione cellulare generato al punto 3.6 in una punta di pipet di dimensioni appropriate (200 - L è tipico). Tenendo la parte superiore della punta, espellere con attenzione la punta del pipet e posizionare orizzontalmente in uno sterile piatto di coltura dei tessuti di 10 cm.
3. Ripetere il passaggio 6.2 per tutti i campioni all'interno di un gruppo con un piatto per ogni gruppo.
4. Mettete le punte in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 15-30 min per consentire alla matrice extracellulare di polimerizzare parzialmente.
5. Dopo 15 min di incubazione, iniziare a controllare la polimerizzazione. Una piccola quantità di liquido fuoriesce in genere dalla punta quando viene posizionata sul piatto. La polimerizzazione di questo liquido può essere utilizzata per stimare l'estensione della polimerizzazione del liquido all'interno della punta.
6. Posizionare le uova da impiantare su un porta uova in un armadietto di biosicurezza. Selezionare un numero gestibile di uova. Fino a sei è tipico. Evitare di lasciare che le uova si raffreddino sostanzialmente mentre si lavora con loro.
7. Rimuovere la pellicola trasparente dal guscio facendo rotolare i bordi verso la finestra aperta. Questo evita di tirare via pezzi di guscio.
8. Verificare che le uova siano vitali e sane. Uova ideali avranno una grande nave al centro della zona aperta con vasi più piccoli ramificazione da esso.
9. Posizionare una punta di pipetta su un pipet di dimensioni appropriate. Deprimere lo stantuffo per forzare la sospensione cellulare parzialmente polimerizzata sul CAM su un vaso grande e ben sviluppato, idealmente su un punto di diramazione.
10. Sigillare l'apertura con un pezzo di pellicola trasparente di un quarto di pellicola trasparente da 6 x 7 cm.
11. Etichettare l'uovo con una designazione appropriata dell'impianto.
    NOTA: la numerazione delle uova all'interno di un gruppo facilita le osservazioni longitudinali.
12. Riportare l'uovo nell'incubatrice. Assicurarsi che l'apertura del guscio si sieda in posizione verticale e che l'uovo sia sicuro.
    NOTA: Le uova possono essere restituite a un'incubatrice di uova dedicata senza rotazione. In alternativa, è possibile ottenere un'elevata vitalità postimpianto utilizzando un'incubatrice a celle 37-38 gradi con CO₂ disattivata e un igrometro per monitorare l'umidità, che dovrebbe essere del 50%-80%.

7. L'imaging bioluminescenza della luciferasi delle lucciole

NOTA: Se le cellule impiantate sono state correttamente tradursi con la codifica genica luciferasi della lucciola o altri fattori di imaging, i tumori risultanti possono essere visualizzati utilizzando l'imaging della bioluminescenza. L'imaging a fluorescenza non è raccomandato sulle uova intatte a causa dell'alto sottofondo dal guscio d'uovo. Questa è l'analisi degli endpoint, poiché l'apertura del guscio riduce drasticamente la sopravvivenza. I tumori possono essere immagine in qualsiasi momento che è appropriato per esigenze sperimentali e la velocità di crescita del tumore. Tuttavia, in media, le uova si schiudono 21 giorni dopo la fecondazione. Pertanto, il giorno di sviluppo 18 è un endpoint appropriato per evitare il tratteggio indesiderato.

1. Se necessario, trasportare le uova all'impianto di imaging. Uova a nastro su piatti di coltura tissutale di 10 cm. Riportarli a un incubatore di uova da 37,8 gradi con il meccanismo di rotazione rimosso o disattivato. L'umidità non è fondamentale per il trasporto e l'imaging.
2. Utilizzando pinze a iride curve, spingere delicatamente il CAM lontano dal guscio fino a quando il CAM è a filo con l'albumina e l'embrione. Utilizzando pinze provino a punta larga, rompere pezzi del guscio per espandere l'apertura del guscio adeguatamente per la visualizzazione del tumore.
3. Iniettare nell'albumina delle uova un minimo di 50 - L di 30 mg/mL D-lucidferina. Un volume simile di D-lucidferin può anche essere convogliato nell'anello antiaderente o sulla superficie del CAM nell'area contenente le cellule impiantate. Ciò garantisce una bioluminescenza ottimale in assenza di un apporto vascolare ideale. Incubare per 8 min.
4. Iniettare 20-50 l di isoflurane nell'albumina dell'uovo per anesizzare l'uovo. Incubazione per ulteriori 2 min. In alternativa, l'uovo può essere collocato in una camera di induzione contenente 2-2,5% di isoflurane vaporizzato. Un'adeguata profondità di anestesia si ottiene quando il movimento embrionale cessa.
   NOTA: Per eutanasia l'uovo è possibile utilizzare volumi maggiori di isoflurane (100 oL).
5. Inserire le uova in un dispositivo di imaging a bioluminescenza e in un'immagine utilizzando le impostazioni appropriate, come indicato dalle istruzioni del produttore. Per questo studio, è stato utilizzato un tempo di esposizione di 1 min.
6. Per immaginare il CAM rimanente e l'embrione, aprire l'uovo in un piatto di coltura tissutale di 10 cm.
   1. Afferra l'uovo con le dita di entrambe le mani sulla parte inferiore dell'uovo vicino al centro dell'uovo e i pollici su entrambi i lati dell'apertura del guscio.
   2. Tirare delicatamente a parte le due metà dell'uovo con i pollici mentre si preme delicatamente nell'uovo con le dita.
   3. Quando il guscio è circa mezzo separato dal CAM e dall'embrione, capovolgere l'uovo a testa in giù su un piatto di coltura tissutale di 10 cm.
   4. Continuare a separare le metà del guscio. Se il CAM si attacca all'interno del guscio, utilizzare delicatamente le dita per spingere il CAM lontano dal guscio.
   5. Se lo si desidera, l'embrione può essere capovolto in un altro piatto.
   6. Se necessario, è possibile somministrare ulteriori isoflurane come nel passaggio 7.4.

8. Raccolta dei tumori

NOTA: I tumori possono essere raccolti in qualsiasi momento che sia appropriato per le esigenze sperimentali e la velocità di crescita del tumore. Tuttavia, in media, le uova si schiudono 21 giorni dopo la fecondazione. Pertanto, il giorno di sviluppo 18 è un endpoint appropriato per evitare il tratteggio indesiderato.

1. Afferra il tumore con le pinze. Utilizzando forbici (forbici a molla funzionano bene) o un bisturi, accuratamente accise tumore da CAM.
2. Se il tumore è stato trasdotto con il gene luciferasi della lucciola, può essere eseguito il reimaging per verificare la rimozione di tumori difficili da visualizzare.
   NOTA: I tumori eccitati possono essere analizzati con qualsiasi metodo appropriato per un particolare esperimento. I tumori possono anche essere reimpiantati in CAM o topi. Per confermare l'identità del tumore, i tumori possono essere fissati, paraffina incorporato, ed esaminati con ematossialina e eosina o colorazione immunoistochimica.

Finora, abbiamo trovato questo metodo di impianto per avere successo per i tumori ovarici, renali, prostatici e della vescica. Ognuna è stata ottimizzata per identificare condizioni specifiche per l'impianto, anche se ci può essere flessibilità. Tra i tipi di tumore testati, la crescita del cancro ovarico era molto meno pronunciata e in genere non visibile senza l'assistenza dell'imaging a bioluminescenza (Figura 1). Tuttavia, un irrigidimento della CAM potrebbe essere sentito con pinze nell'area di impianto. Questo può aiutare a identificare la possibile crescita del tumore in assenza di imaging di bioluminescenza, anche se sarebbe necessaria un'ulteriore convalida tramite istologia o un altro metodo adatto. Abbiamo raggiunto l'innesto di successo di linee cellulari umane e murine che mostrano morfologie coerenti con quelle osservate in altri modelli in vivo (Figura 1A e 1B). Inoltre, l'impianto di pezzi di tumore era possibile (Figura 1C, freccia blu indica tumore). Il tumore impiantato in questo caso proveniva da un paziente con carcinoma seroso di alto grado, metastatico e ovarico. I tumori risultanti assomigliavano morfologicamente ai loro tumori di origine ed esprimevano proteine specifiche per l'uomo, come la citokeratina 8/18, che consentono prontamente la loro differenziazione dai tessuti embrionali di pollo CAM e di pollo.

Quando si ottimizza l'innesto e la crescita del tumore, possono essere aggiunti fattori di crescita o ormoni appropriati al momento dell'impianto. Ad esempio, un sottile, aumento non significativo della dimensione del tumore (misurato dal flusso di radianza totale) è stato osservato nelle cellule ID8 quando integrato con tre unità (U) di follicolo umano stimolante ormone (FSH) al momento dell'impianto (Figura 1D). La selezione di FSH per la crescita del cancro ovarico derivava dall'espressione del recettore FSH nelle cellule ID8 e dagli alti livelli di FSH che si trovano tipicamente nelle donne in postmenopausa, che costituiscono la maggior parte dei casi di cancro ovarico. Approcci simili possono essere adottati per altri tipi di cancro difficili da coltivare per migliorare l'utilità del modello CAM. Inoltre, la FSH è stata aggiunta solo al momento dell'impianto cellulare. Rifornire il fattore di crescita o l'ormone potrebbe essere realizzato pipettando una quantità appropriata dell'additivo nel mezzo nell'anello antiaderente ad intervalli appropriati, che potrebbe migliorare l'effetto.

Per il cancro del rene, l'impianto di 2 x 106 cellule carcinomie renali evidenti da linee cellulari stabilite, come RENCA, ha prodotto una formazione tumorale rapida e robusta, anche se possono essere utilizzate dosi cellulari più basse(Figura 2A, 10 giorni di postimplantation). I tumori risultanti assomigliavano morfologicamente a quelli ottenuti attraverso i modelli standard in vivo28. L'impianto di cellule RENCA contrassegnate con luciferasi lucciole consentito l'imaging di bioluminescenza. Possono anche essere impiantati tumori umani primari. I pezzi di tumore persistevano e reclutavano la vascolatura senza mostrare una crescita significativa. L'impianto di cellule digerite provenienti da un carcinoma a cellule renali primarie e chiare che sono state espanse in vitro, tuttavia, è cresciuto in modo simile alle linee cellulari stabilite (Figura 2B). Le cellule carcinoma a cellule renali possono essere semiate utilizzando il metodo dell'anello antiaderente o il metodo senza l'anello antiaderente.

Sono state testate multiple linee cellulari di cancro della prostata umana e murina per l'innesto di CAM (Figura 3). Ognuna è cresciuta bene quando 2 x 106 cellule sono state impiantate utilizzando l'anello antiaderente. La valutazione istologica dei tumori risultanti era coerente con le aspettative per ogni linea cellulare. Inoltre, l'impianto di cellule contrassegnate stabilmente con luciferasi lucciole consentiva l'identificazione del tumore con imaging bioluminescenza (Figura 3A).

Il cancro della vescica è stato stabilito nel modello CAM da linee cellulari stabilite e pezzi di tessuto umano primario (Figura 4). Le linee cellulari sono cresciute bene quando sono state impiantate con 2 x 106 cellule senza l'anello antiaderente (Figura 4A e 4B), anche se l'impianto con l'anello ha avuto successo. Il tumore umano primario può essere impiantato da pezzi di tessuto (Figura 4C). Il caso presentato ha avuto origine da un paziente con carcinoma di alto grado, non muscolo-invasivo, urothelial. L'impianto di cellule digerite non è ancora stato tentato a causa dell'ottimizzazione della digestione tumorale in corso. Le cellule tumorali dei tumori CAM risultanti mantennero la morfologia del tumore originale, ma con una componente stromatale alterata. La crescita del tumore è stata inferiore a quella del carcinoma a cellule renali e del cancro alla prostata, anche se ancora prontamente visibile.

Per garantire un numero elevato di uova vitali e assibili all'endpoint, è necessario prestare attenzione durante l'incubazione e l'apertura delle uova. Se le condizioni dell'incubatrice sono non ottimali prima o dopo l'impianto, la vitalità dell'embrione può essere compromessa. Se si verifica una significativa morte embrionale, risolvere i problemi relativi alle condizioni dell'incubatore in base alle istruzioni del produttore. Nella nostra esperienza, la temperatura e la stabilità dell'umidità sembrano essere più cruciali dei loro valori esatti. Pertanto, abbiamo scoperto che l'incubazione delle uova inoculate in un incubatore modificato, a coltura cellulare, di CO2 ha raggiunto una redditività superiore rispetto al trattenere le uova in piccole incubatrici di uova dedicate che richiedono un'apertura più frequente per ricostituire l'acqua che controlla l'umidità. Ridurre al minimo la frequenza con cui le uova inoculate vengono rimosse per l'esame del tumore può anche migliorare la vitalità dell'embrione.

Un'ulteriore preoccupazione dell'impianto DI CAM è l'integrità del CAM all'inoculazione. Se il CAM non è intatto dopo l'apertura del guscio, l'anello antiaderente e le cellule impiantate affonderanno nell'albumina dell'embrione (vedere la nota dopo il passaggio 2.12). Questo causa la dispersione delle cellule tumorali. Alcuni tumori possono ancora formarsi, ma i tumori che ricevono una crescita significativa e la segnalazione di sopravvivenza dalle cellule tumorali vicine, come il cancro ovarico, non formeranno in modo affidabile tumori in tali condizioni. Se gli anelli antiaderenti vengono utilizzati per l'impianto, il guasto della CAM può essere identificato dall'affondamento dell'anello nell'albumina. Questo deve essere distinto dai casi in cui l'anello e le cellule impiantate sono stati spostati sul fondo dell'uovo per movimento embrionale. In questi casi, l'anello si troverà tra il CAM e la parte inferiore del guscio. Il movimento embrionale non può essere controllato. Tuttavia, il posizionamento degli anelli può rendere più difficile per l'embrione interrompere le cellule impiantate. Gli anelli posizionati ai bordi della tasca dell'aria generati al punto 2.7 hanno maggiori probabilità di essere spostati dall'embrione rispetto a quelli posizionati al centro del campo.

Figura 1: Sviluppo del tumore rappresentativo da cancro ovarico. Le cellule tumorali ovariche impiantate con successo includono: (A) la linea cellulare umana SKOV3, (B) la linea cellulare ID8 murina e i tumori primari (C). La colorazione rappresentativa dell'ematossia e dell'eosina viene presentata insieme all'imaging della bioluminescenza, a seconda dei casi. Per il tumore della CAM risultante dall'impianto di un pezzo di tumore primario (C) sono incluse le macchie di ematosina e di eosina del tumore CAM e del tumore primario, insieme alla colorazione della citokeratina 8/18 (CK 8/18) del tumore CAM risultante. La freccia blu nel primo pannello indica il tumore. (D) Dimensione del tumore degli impianti ID8 con e senza 3U FSH, calcolata come flusso totale risultante dall'imaging a bioluminescenza (n - 3 per non trattato e n - 4 per l'efentità FSH). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sviluppo tumorale rappresentativo da carcinoma a cellule renali a cellule chiare. Tumori derivanti dall'impianto di (A) della linea cellulare carcinoma a cellule renali murine, RENCA o(B)derivata da un tumore primario umano digerito. La scala di misurazione adiacente al tumore asfornato in (B) mostra segni di 1 mm. L'istologia corrispondente in (A) e (B) mostra la colorazione dell'ematossia e dell'eosina. In (A), viene mostrata anche l'imaging di bioluminescenza rappresentativa delle cellule RENCA marcate con lucciola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Sviluppo del tumore rappresentativo dalle linee cellulari del cancro alla prostata. Tumori rappresentativi ed ematossialina e colorazione eosina risultante dall'impianto delle linee cellulari del cancro della prostata umana (A) CWR e(B)C4-2 insieme alla linea cellulare murina (C) MyC-CaP. L'imaging di bioluminescenza dei tumori risultanti da cellule CWR marcate di lucciole è mostrato in (A). La scala di misurazione adiacente ai tumori ascisi mostra segni di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sviluppo del tumore rappresentativo dal cancro della vescica. Tumori rappresentativi derivanti dall'impianto delle linee cellulari cellulari del cancro della vescica umana stabilite (A) HT-1376, (B) T24 e (C)tumore primario della vescica umana. In (C), vengono mostrate la colorazione eosina e eosina del tumore CAM risultante e del tumore primario. La scala di misurazione adiacente ai tumori ascisi mostra segni di 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.