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Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule Killer naturali nel contesto delle cellule tumorali epatiche

Published: February 22, 2020 doi: 10.3791/60714
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Alabama at Birmingham

Summary

L'evasione dell'eradicazione mediata da cellule naturali (NK) da parte delle cellule tumorali è importante per l'inizio e la progressione del cancro. Qui, presentiamo due protocolli non basati sulla radioattività per valutare la citotossicità mediata dalla cellula NK verso le cellule tumorali epatiche. Inoltre, viene presentato un terzo protocollo per analizzare la migrazione delle celle NK.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) sono un sottoinsieme della popolazione citotocita citocita del sistema immunitario innato e partecipano come prima linea di difesa eliminando le cellule infettate da patogeni, maligne e stressate. La capacità delle cellule NK di sradicare le cellule tumorali le rende uno strumento importante nella lotta contro il cancro. Diverse nuove terapie basate sul sistema immunitario sono allo studio per il trattamento del cancro che si basano sul miglioramento dell'attività delle cellule NK o sull'aumento della sensibilità delle cellule tumorali all'eradicazione mediata dalle cellule NK. Tuttavia, per sviluppare efficacemente questi approcci terapeutici, sono necessari anche analisi in vitro convenienti per monitorare la citotossicità e la migrazione mediate dalle cellule NK. Qui, presentiamo due protocolli in vitro che possono monitorare in modo affidabile e riproducibile l'effetto della citotossicità delle cellule NK sulle cellule tumorali (o altre cellule bersaglio). Questi protocolli non sono basati sulla radioattività, semplici da configurare e possono essere adattati per lo screening ad alta velocità. Presentiamo anche un protocollo basato sulla citometria di flusso per monitorare quantitativamente la migrazione delle cellule NK, che può anche essere scalata per lo screening ad alta velocità effettiva. Collettivamente, questi tre protocolli possono essere utilizzati per monitorare gli aspetti chiave dell'attività delle cellule NK che sono necessari per la capacità delle cellule di sradicare le cellule bersaglio disfunzionali.

Introduction

La capacità del corpo umano di identificare oggetti estranei non autoeditto è fondamentale per la sopravvivenza umana contro patogeni e neoplasie1. La risposta immunitaria umana svolge il ruolo più importante in questo processo2,3,4. Sulla base delle caratteristiche e delle funzioni chiave, il sistema immunitario umano può essere ampiamente classificato in due principali gruppi funzionali: il sistema immunitario adattivo e il sistema immunitario innato. Il sistema immunitario adattivo è in genere specifico per un determinato agente patogeno e ha memoria immunologica e, pertanto, è duraturo e reattivo alla futura reinfezione da parte dello stesso agente patogeno5,6,7,8,9. Al contrario, l'immunità innata è molto più ampia nell'eradicazione del suo obiettivo e relativamente non specifica. Pertanto, in genere, la risposta immunitaria innata serve come prima linea di difesa immunologica10. Le cellule killer naturali (NK) appartengono al sistema immunitario innato e rappresentano il 10-15% dei linfociti circolanti totali11. Le cellule NK sradicano le cellule bersaglio attraverso due meccanismi principali. In primo luogo, dopo il legame alle cellule bersaglio che esprimono ligandi attivando, le cellule NK rilasciano la proteina perforin che interrompe la membrana perforin e le granzie della proteasi serina attraverso l'esocitosi, che inducono congiuntamente l'apoptosi nelle cellule bersaglio12,13,14,15. Inoltre, le cellule NK che esprimono il FasL e l'apoptosi del fattore tumorale (TRAIL) interagiscono con le cellule bersaglio che esprimono i recettori della morte (Fas/CD95), portando all'apoptosi16dipendente dalla caspase. Ancora più importante, le cellule NK non richiedono la prestimolazione, come la presentazione dell'antigene, per sradicare le cellule infette o maligne patogene; così, di solito sono in uno stato pronto per uccidere17,18. Al fine di inibire lo sviluppo e la progressione del tumore e sradicare le cellule tumorali, le cellule NK devono migrare verso il sito tumorale e, una volta nel microambiente tumorale, identificare e attaccare le cellule bersaglio.

In passato, le funzioni degli efquali ciclabili erano monitorate principalmente da degranate e citotossicii sinistri19,20,21. La citotossicità delle cellule NK può anche essere misurata con 51prova di rilascio di cromo22,23,24,25. Tuttavia, questo saggio ha alcuni requisiti specifici, tra cui la necessità di un contatore gamma, ed è basato sulla radioattività, che richiede una formazione nella gestione e nello smaltimento di materiali radioattivi e pone un livello di rischio per l'utente. Pertanto, sono stati sviluppati e impiegati diversi nuovi saggi non basati sulla radioattività per studiare l'attività delle cellule NK.

Qui, descriviamo due protocolli di questo tipo, il disidrogeno lattico colorimetrico (LDH) basato sulla misurazione della citotossicità delle cellule NK e l'eliminazione microscopica a base di colorazione della calceina (AM) per misurare l'eradicazione delle cellule tumorali mediate da cellule NK. Questi saggi non richiedono l'uso di radioisotopi, sono semplici, sensibili e identificano in modo riproducibile i fattori che modulano la funzione delle cellule NK. Inoltre, poiché la funzione delle cellule NK non può essere valutata completamente senza monitorare i cambiamenti nella migrazione delle cellule NK, presentiamo anche un metodo quantitativo basato sulla citometria di flusso per monitorare la migrazione delle cellule NK.

Protocol

1. Preparazione del mezzo di coltura per le cellule NK e le cellule tumorali epatiche

  1. Utilizzare cellule killer naturali umane (ad esempio, NK92MI) e la linea cellulare del cancro del fegato umano (ad esempio, SK-HEP-1).
  2. Preparare il mezzo di coltura delle cellule NK per le cellule NK umane NK92MI aggiungendo i seguenti componenti a 500 mL di alfa aquila media minima essenziale senza ribonucleosides e deoxyribonucleosides alle concentrazioni finali indicate: 0,02 mM di acido folico (100 -L di acido folico di 100 mm), 0,2 mm mioinositolo (500 ml di 200 mmyolo), 0 1 mM-mercaptoetanolo (3,5 M di 14,3 M-mercaptoetanolo), 2 mM L-glutamina (5 mL di 200 mM L-glutamina), 1% di penicillina/streptomicina (5 mL di penicillina 100x), 12,5% siero (FBS) e il 12,5% di siero di cavallo. Mescolare e filtrare la sterilizzazione utilizzando un'unità di filtrazione sterile di 0,22 m e conservare a 4 gradi centigradi.
  3. Preparare il mezzo di coltura per la linea cellulare tumorale epatica SK-HEP-1 aggiungendo 10% FBS e 1% penicillina / streptomicina al mezzo Eagle modificato (DMEM) di alto livello di glucosio contenente 2 mM L-glutamina.

2. Analisi della citotossicità mediata da NK Cell, basata su LDH

  1. Coltiva le cellule SK-HEP-1 fino a una confluenza del 70-80% in una parabola Petri coltivata a cellule 100 mm in 5% di CO2 a 37 gradi centigradi in un incubatore di CO2. Generare una sospensione a singola cellula lavando le prime cellule di lavaggio con 5 mL di 1x salina tampone fosfato (PBS) seguita da incubazione con 1 mL dello 0,25% trypsin-EDTA in 5% CO2 a 37 s C in un incubatore di CO2 fino a quando non viene generata una singola sospensione cellulare.
    NOTA: L'attività delle cellule NK può essere indotta dalle cellule tumorali stressate a causa di cambiamenti nell'espressione del ligando che attiva le cellule NK nelle cellule tumorali. Pertanto, le cellule tumorali sane e sub-confluenti devono essere utilizzate per risultati accurati. È anche importante notare che i recettori delle cellule NK e i ligandi possono essere sensibili alla prova26,27. Pertanto, il protocollo di trypsinization deve essere attentamente ottimizzato ed eccessiva provapsinizzazione dovrebbe essere evitato.
  2. Dopo la prova, aggiungere 10 mL di SK-HEP-1 coltura medio e centrifugare a 160 x g per 3 min in un tubo di centrifuga conica sterile 15 mL. Lavare il pellet cellulare con 5 mL di 1x PBS e risospendere in 5 mL di mezzo di coltura.
  3. Parallelamente, centrifugare le cellule NK92MI a 160 x g per 3 min in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Lavare il pellet cellulare con 5 mL di 1x PBS e risospendere in 5 mL di NK92MI cell coltura medio.
    NOTA: le cellule NK92MI sono coltivate nel mezzo di coltura cellulare NK e ottenute in modo simile come descritto nel passaggio 2.1.
  4. Contare le cellule SK-HEP-1 e NK92MI utilizzando un emocitometro o qualsiasi contatore cellulare automatizzato disponibile.
  5. Aggiungete le celle SK-HEP-1 (cellule bersaglio) (1 x 104/100 - postato) e le celle NK92MI (cellule effettrici) (1 x 105/100 l/po) nel rapporto di 1:10 target:effector e seme in triplicati in una piastra di 96 pozze.
  6. Incubare la piastra 96 a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 95% di aria e del 5% di CO2 per 3 h. Dopo l'incubazione, centrifugare piastra a 450 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  7. Senza disturbare il pellet cellulare, raccogliere 100 l'una di supernatante da ogni pozzo e trasferire in un pozzo in un nuovo 96 bene piastra.
  8. Aggiungere 50 -L di substrato LDH, mescolare bene e incubare la piastra per 20 min a temperatura ambiente al buio.
  9. Fermare la reazione aggiungendo 50 l di soluzione di arresto (50% dimetilformamide e 20% solfato di sodecyl di sodio al pH 4.7). Misurare immediatamente l'assorbimento della piastra a 490 nm e 680 nm utilizzando un lettore di lamiere.
  10. Sottrarre l'assorbimento a 680 nm dall'assorbimento a 490 nm. Calcolare la percentuale (%) NK citotossicità cellulare utilizzando la formula qui sotto.

    dove l'LDH sperimentale (effettore e cellule bersaglio) è l'assorbimento delle cellule NK92MI e delle cellule SK-HEP-1, le cellule effettori LDH sono l'assorbimento delle sole cellule NK92MI, LDH spontanea è l'assorbimento delle cellule SK-HEP-1 da solo, e l'litorale massimo è l'assorbimento di SK-HEP-1 cellule con tampone di lisi.
    NOTA: per ridurre l'interferenza del siero, utilizzare sempre i seguenti controlli: solo cellule bersaglio (SK-HEP-1), celle esegettive da sole (NK92MI), celle di destinazione con buffer di lisi come controllo completo della lisi, mezzo cellulare di destinazione, supporto NK92MI, nonché supporto cellulare di destinazione e NK92MI medio in un rapporto 1:1.

3. Metodo microscopico basato sulla colorazione calceina AM per misurare la citotossicità mediata da NK Cell

  1. Coltura SK-HEP-1 cellule a 70-80% di confluenza. Generare una sospensione a cella singola mediante le prime celle di lavaggio con 5 mL di 1x PBS seguite da incubazione con 1 mL dello 0,25% trypsin-EDTA.
  2. Centrifuga SK-HEP-1 cellule in un tubo di centrifuga sterile da 1 mL a 160 x g per 3 min. Risospendere il pellet in 3 mL di DMEM senza sieri.
  3. Aggiungere 1,5 litri di calceinam soluzione AM (10 mM) alle cellule SK-HEP-1 e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Centrifuga calceina cellule SK-HEP-1 con etichettatura AM a 160 x g per 3 min in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL.
  4. Lavare le cellule due volte con 5 mL di 1x PBS per rimuovere la tintura calceinAM in eccesso.
  5. Parallelamente, centrifugare le cellule NK92MI a 160 x g per 3 min in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL. Lavare il pellet cellulare una volta con 5 mL di 1x PBS e risospendere in 5 mL di supporto cellulare NK92MI.
  6. Contare calceincellule SK-HEP-1 con etichetta AM e cellule NK92MI utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
  7. Risospendere le cellule SK-HEP-1 in mezzo di coltura a 1 x 105 celle /mL e NK92MI a 1 x 106 celle / mL nel mezzo di cellule NK.
  8. Calcein a piastre con etichettatura delle cellule SK-HEP-1 (cellule bersaglio) (1 x 104/100 -L/pozzetto) con cellule NK92MI (cellule etsuologi) (1 x 105/100 l/po) (1:10 target:effector ratio) per pozzo in triplicati in una piastra di 96 pozzetti.
  9. Incubare la piastra 96 a 37 gradi centigradi in un'atmosfera del 95% di aria e del 5% di CO2 per 4 h. Dopo l'incubazione, catturare le immagini a fluorescenza delle cellule con etichetta su AM calceina utilizzando un microscopio a fluorescenza a ingrandimento 10x. Cattura almeno 10 diversi campi di ogni replica per ogni condizione di trattamento.
  10. Selezionare casualmente 10 immagini per ogni replica e conteggio calcein cellule bersaglio positive AM incubate con o senza cellule NK92MI. Calcolare la % citotossicità utilizzando la formula riportata di seguito.

    NOTA: come controlli, utilizzare le celle di destinazione senza cellule NK92MI e celle bersaglio completamente lised come controllo completo della lisi. Per una lissi completa, incubare le cellule in 0,5% Triton X-100 per 1 h (20 - L of 5% Triton X-100 in 200 - L di supporti di coltura).

4. Analisi della migrazione delle cellule NK

  1. Coltivare cellule NK92MI e centrifugare le cellule a 160 x g per 3 min in un tubo di centrifuga sterile da 15 mL.
  2. Lavare il pellet cellulare due volte con 5 mL di 1x PBS e risospendere le cellule in 3 mL di supporto cellulare NK92MI senza sè. Contare le cellule NK92MI usando un emocitometro o un contatore cellulare automatizzato.
  3. Piastra NK92MI celle (2,5 x 105 celle/100 -l/po) nel vano superiore della camera permeabile transwell (inserto da 6,5 mm di diametro e dimensione dei pori di 5 m).
  4. Nella camera inferiore aggiungere 0,6 mL di mezzo senza siero contenente materiale da testare per le proprietà chemioattraenti delle cellule NK (ad esempio, mezzo condizionato, chemiochine, citochine).
    NOTA: Quando si prepara un mezzo condizionato, utilizzare un mezzo a siero ridotto senza siero aggiunto per eliminare le interferenze dalle proteine del siero nell'analisi di migrazione.
  5. Incubare le 24 camere ben permeabili a 37 gradi centigradi per 4 ore. Dopo 4 h, raccogliere le cellule NK92MI non aderenti e migrati dalla camera inferiore e trasferirle in tubi di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ulteriori analisi.
    NOTA: Il tempo di coltura può variare a seconda del tipo di cellule bersaglio, nonché della quantità e della cinetica delle chemiochine prodotte dalle cellule bersaglio. Pertanto, questa volta dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni tipo di cellula, chemiochine e esperimento.
  6. Aggiungere un numero predeterminato di perline di conteggio per la citometria di flusso in un volume di 50 gradi a ogni tubo contenente cellule NK migrate. Valutare il volume di 300 s/pozza di sospensione cellulare con 300 celle con qualsiasi citometro a flusso in grado di automatizzare il conteggio delle celle basato su FACS.
    NOTA: Mescolare o vortice-mescolare le perline di conteggio per citometria di flusso accuratamente ogni volta prima dell'uso per garantire che un numero costante di perline viene utilizzato per ridurre al minimo la variabilità sperimentale. Il pipettaggio inverso è consigliato con perline di conteggio per mantenere la precisione. Utilizzare solo celle NK e perline di conteggio per la citometria di flusso come controlli di analisi FACS. Gli autori raccomandano di leggere almeno 10.000 perline - cellule NK combinate, una quantità che ha funzionato bene. Tuttavia, questo numero può variare a seconda delle condizioni sperimentali. Pertanto, il numero combinato di perline - cellule NK dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni tipo di esperimento. Inoltre, è importante eseguire esperimenti utilizzando triplicati biologici per ottenere risultati statisticamente significativi e tenere conto della variabilità tra diversi conteggi di cellule.
  7. Calcolare il numero assoluto di celle NK92MI migrate utilizzando questa formula:

    dove A - numero di celle, B e il numero di perline, C - assegnato il numero di perline del lotto (numero di perline di conteggio per la citometria di flusso/50 , in questo esempio 49.500), e D - volume del campione (L).
    NOTA: Se per l'analisi FACS viene utilizzato 300 l di volume di campione (celle migrate) con 50 l di perline di conteggio per la citometria di flusso, il numero assoluto di celle migrate è pari a 1.700 celle /3.300 perline x 49.500 perline/300 celle l/L. Il calcolo deve essere corretto se il campione viene diluito o se viene utilizzato un volume diverso di perline di conteggio FACS.

Representative Results

I saggi di citotossicità delle cellule NK e il saggio di migrazione delle cellule NK sono stati eseguiti utilizzando la linea cellulare epatica SK-HEP-1 come sistema modello. Per misurare la citotossicità delle cellule NK usando l'analisi LDH, le cellule SK-HEP-1 che esprimono uno shRNA non specifico (NS) o uno shRNA mirante all'attivazione del fattore di trascrizione 4 (ATF4) sono state incubate con cellule NK92MI in una piastra da 96 pozze per 3 h (Figura 1A). L'ATF4 ha precedentemente dimostrato di regolare la citotossicità delle cellule NK regolando il ligando attivante ULBP128. L'attività LDH associata all'uccisione delle cellule bersaglio mediata dalle cellule NK è stata misurata in modo metrico e la percentuale di citotossicità calcolata utilizzando la formula descritta nel protocollo 1. Il knockdown di ATF4 ha ridotto significativamente la citotossicità mediata da cellule NK rispetto alle cellule NK che esprimono SHRNA NS (Figura 1B-D). Abbiamo anche misurato la citotossicità delle cellule NK usando un saggio basato sulla colorazione di calceina. A tal fine, le cellule SK-HEP-1 che esprimono shRNA NS o ATF4-targeting shRNA sono state etichettate con calcein AM e incubate con cellule NK92MI in 96 pozzetti per 4 h come illustrato nella Figura 2A. Dopo l'incubazione, le immagini delle cellule calceina AM-positive sono state catturate dalla microscopia a fluorescenza utilizzando un filtro FITC/GFP. Le cellule uccise dalle cellule NK non vengono rilevate da questo approccio perché non conservano più il coloranti calcein AM. Come illustrato nella Figura 2B,C, il numero di celle SK-HEP-1 positive da calceina viene ridotto dopo la co-coltura con celle NK92MI rispetto alle cellule SK-HEP-1 coltivate senza cellule NK92MI. Tuttavia, come previsto, il knockdown ATF4 tramite shRNA ha ridotto l'uccisione di cellule NK mediate da cellule SK-HEP-1, osservata da un maggior numero di cellule calceina AM-positive (Figura 2B,C). Pertanto, sia i test basati su LDH che i test AM di calceinam hanno mostrato risultati coerenti e hanno confermato che il knockdown di ATF4 riduce la citotossicità delle cellule tumorali mediata da NK. Uno di questi saggi è sufficiente per valutare la citotossicità mediata dalle cellule NK; tuttavia, si consiglia di utilizzare entrambi i metodi per aumentare sia la severità e la fiducia nei risultati.

Presentiamo anche i risultati di un test sulla migrazione delle cellule NK di 24 pozzi. Le celle NK92MI sono state risospese in mezzo NK92MI senza siero nella camera superiore, e la chemiochina, il motivo CC, il ligando 2 (CCL2) è stato aggiunto alla camera permeabile inferiore. La migrazione delle celle NK è stata descritta come descritto nella sezione 3(Figura 3A). Il numero di cellule NK92MI migrate è stato quantificato aggiungendo perline di conteggio per la citometria di flusso e seguite dall'analisi FACS. Come illustrato nella figura 3B-C, si è verificato un aumento significativo del numero di celle NK92MI che erano migrate verso il supporto contenente CCL2 rispetto al supporto di controllo.

Figure 1
Figura 1: Saggio di citotossicità mediata da cellule NK basate sull'attività LDH color colorimetrica. (A) Schematico raffigurante i passi chiave del saggio di citotossicità delle cellule NK colormetrica basato sull'attività LDH. (B, C) L'espressione ATF4 è stata analizzata in cellule SK-HEP-1 che esprimono shRNA non specifico (NS) o shRNA mirati all'ATF4 mediante RT-PCR quantitativo e gonfiore occidentale. (B) Il livello di mRNA ATF4 relativo viene mostrato dopo la normalizzazione al livello ACTINB nelle cellule SK-HEP-1 che esprimono SHRNA NS o ATF4 shRNA. (C) Livelli di proteine ATF4 e ACTINB nelle cellule SK-HEP-1 che esprimono shRNA NS o ATF4 shRNA. (D) La citotossicità mediata dalle cellule NK è stata analizzata nelle cellule SK-HEP-1 che esprimono shRNA NS o ATF4 con il metodo LDH. Percentuale (%) Viene mostrata la citotossicità mediata da cellule NK. I dati sono presentati come media : SEM; ns, non significativo; < 0,01, < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Metodo microscopico basato sulla colorazione Calcein AM per misurare la citotossicità mediata da cellule NK. (A) Schematico raffigurante i passaggi chiave della calceina AM metodo microscopico basato sulla colorazione per misurare la citotossicità mediata dalle cellule NK. (B) La citotossicità mediata dalle cellule NK è stata analizzata nelle cellule SK-HEP-1 che esprimono shRNA NS o ATF4 utilizzando il metodo calcein AM. Vengono visualizzate le immagini rappresentative. Barra della scala: 200 m. (C) Percentuale di celle calceinAM-positive per l'esperimento presentato nel pannello B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: analisi della migrazione quantitativa delle cellule NK basata su FACS. (A) Schematico raffigurante le fasi chiave del saggio sulla migrazione delle cellule NK basate su FACS. (B, C) Il progetto di migrazione delle cellule NK è stato effettuato dopo aver aggiunto 50 ng di CCL2 alla camera inferiore del pozzo 24. (B) Vengono mostrati i lotti di migrazione delle cellule NK rappresentative per il controllo o il mezzo di coltura trattato con CCL2. (C) I dati relativi alla migrazione delle cellule NK (media e SEM) vengono presentati per l'esperimento illustrato nel pannello B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I metodi di citotossicità e migrazione descritti qui possono essere utilizzati per valutare la citotossicità delle cellule NK alle cellule tumorali e i meccanismi di evasione immunitaria mediati dalle cellule NK nei tumori maligni, nonché per identificare agenti terapeutici che miglioreranno l'attività/funzione delle cellule NK. I protocolli sono semplici, sensibili, riproducibili e preferibili alternative al classico esordio del cromo basatosulla radioattività. I protocolli sono stati specificamente progettati per essere facilmente adattabili per l'uso nella maggior parte dei laboratori, con semplici letture colorimetriche, microscopiche o basate su FACS, facili da interpretare, consentendo ai ricercatori di raggiungere conclusioni affidabili. Tutti sono scalabili per approcci basati su screening ad alta velocità. Anche se i protocolli sono presentati nel contesto di una singola linea cellulare tumorale epatica, possono essere facilmente adattati ad altri tipi di cellule tumorali e/o ad altre cellule bersaglio non cancerose.

Mentre tutti i metodi presentati sono robusti e riproducibili, la variazione intersperimentale potrebbe verificarsi con diversi lotti di cellule tumorali e cellule NK. Per garantire che i risultati supportino con precisione le conclusioni degli esperimenti, è consigliabile ripetere l'esperimento almeno due volte utilizzando triplicati biologici.

Una limitazione di questo metodo è che il tasso di crescita delle cellule NK92MI può essere lento. Pertanto, per gli esperimenti con 50 o più campioni, è necessario crescere in anticipo un numero sufficiente di NK92MI per evitare ritardi. Inoltre, tutti i controlli descritti nei protocolli devono essere implementati per evitare risultati spuri e non riproducibili. Un'altra limitazione del saggio sulla citotossicità dell'NK è che il rapporto tra NK e cellule tumorali, così come il tempo di incubazione, deve essere ottimizzato per ogni cellula bersaglio. Ad esempio, abbiamo testato vari rapporti di cellule tumorali con cellule NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80) per le linee cellulari del cancro epatico, così come più tempi di incubazione (2, 3, 4, 5 e 6 h). Sulla base dei nostri risultati abbiamo osservato risultati più coerenti con 1:10 e 1:20 rapporti di cellule tumorali alle cellule NK e incubazione per 3 h.

Inoltre, le cellule tumorali derivate da tumori solidi si attaccheranno e cresceranno sulla superficie della piastra di coltura, mentre le cellule NK crescono in sospensione. Se il tempo di incubazione è più lungo di 3 h, si consiglia di utilizzare l'attaccamento ultrabasso 96 piastre di pozzo, che migliorerà la coerenza e la riproducibilità tra esperimenti e repliche biologiche. È anche importante notare che i saggi di citotossicità indotta dalle cellule NK possono essere eseguiti anche utilizzando cellule NK primarie isolate da cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC). Tuttavia, ci sono diverse limitazioni con tali esperimenti. In primo luogo, questi esperimenti non possono essere scalati con la stessa facilità delle cellule NK92MI. In secondo luogo, la variazione batch-batch dell'attività citotossico delle cellule NK isolate dai PMBC può essere problematica in termini di riproducibilità e interpretazione dei risultati. Allo stesso modo, altre linee cellulari umane NK sono descritte nella letteratura e potrebbero essere utilizzate in questi tipi di esperimenti, comprese le cellule NKL29; tuttavia, a differenza delle cellule NK-92MI, le cellule NKL sono dipendenti da IL-2 e non sono disponibili in commercio.

Quando si considerano gli esperimenti calcein AM descritti, è importante notare che calcein AM rimane in corpi apoptotici dopo la morte cellulare30. Pertanto, la quantificazione della colorazione calceinAM deve essere eseguita con attenzione, in quanto può portare a una sottovalutazione della citotossicità NK.

Simile alla citotossicità mediata dalle cellule NK, la modulazione della migrazione delle cellule NK da parte delle citochine e di altri chemioattraenti svolge un ruolo importante nella regolazione della funzione delle cellule NK. Il test sulla migrazione delle cellule NK descritto qui fornisce una semplice piattaforma per valutare la migrazione delle cellule NK nel contesto di uno stimolo come una chemiochina o una chemioattractant. Questo test può essere utilizzato per valutare gli agenti che possono promuovere o interferire con la migrazione delle cellule NK - quindi, identificando stimolatori e repressori della migrazione delle cellule NK. Questo metodo può anche essere utile per studiare la capacità normativa sulla migrazione delle cellule NK a seguito di alterazioni genetiche/epigenetiche (upregulation o downregulation) o derivanti da un trattamento farmacologico.

Per misurare con precisione la migrazione delle cellule NK, è necessario seguire alcuni passaggi critici. Per tutti gli esperimenti che utilizzano mezzi condizionati, è importante che il mezzo condizionato equivalente sia da condizioni di controllo che di trattamento per ottenere misurazioni accurate. Il tempo di incubazione sarà variato con chemoattraenti purificate e mezzo condizionato. Infine, i saggi di trasndimento della migrazione sono ben consolidati e considerati un ottimo metodo per valutare la migrazione delle cellule NK; tuttavia, le monocolture omogenee impiegate nei saggi non hanno la complessa fisiologia dei tessuti o anche le colture 3D che potrebbero imitare più accuratamente il microambiente tumorale.

Così, anche se ci sono alcune limitazioni ai saggi di citotossicità delle cellule NK e al saggio sulla migrazione NK presentati in questo articolo, questi saggi sono applicabili a una vasta gamma di studi immunologici e forniscono quindi metodi importanti e affidabili per valutare le cellule NK e le terapie immunitarie modulatori delle cellule NK.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo con gratitudine le sovvenzioni dei National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) e 1R01 CA218008-01A1 (NW). Riconosciamo anche il finanziamento del Dipartimento della Difesa W81XWH1910480 e W81XWH-18-1-0069 a NW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute counting beads Thermo Fisher Scientific C36950
Alpha-MEM Sigma-Aldrich M4256
Amicon ultra Centrifugal filters Millipore UFC900324
Calcein AM dye Sigma-Aldrich 17783
DMEM Gibco 11965-092
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079
Folic Acid Sigma-Aldrich F8758
Horse Serum Gibco 16050114
L-Glutamine (200 mM) Gibco 2530081
LDH cytotoxic assay Kit Thermo Fisher Scientific 88953
myo-Inositol Sigma-Aldrich I5125
NK92MI cells ATCC CRL-2408
Opti-MEM Gibco 31985070
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417
SKHEP-1 Cells ATCC HTB-52
Transwell permeable chambers Costar 3241
Trypsin EDTA solution Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina Numero 156 Cellule NK Cancro migrazione citotossicità fattori di trascrizione citometria di flusso
Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule Killer naturali nel contesto delle cellule tumorali epatiche
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Chava, S., Bugide, S., Gupta, R.,… More

Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (156), e60714, doi:10.3791/60714 (2020).

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