Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

Aditi Upadhye; Melissa Marshall; James  C. Garmey; Timothy  P. Bender; Coleen McNamara

doi:10.3791/61003

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Articolo metodologico

Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

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DOI:

10.3791/61003

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31 maggio 2020

Aditi Upadhye¹ , Melissa Marshall² , James C. Garmey² , Timothy P. Bender³ , Coleen McNamara²

¹Department of Microbiology, Immunology, Cancer Biology, University of Virginia, ²Cardiovascular Research Center, University of Virginia, ³Beirne B. Carter Center for Immunology Research, University of Virginia

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l'analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.

Abstract

Poiché la funzione cellulare è influenzata da fattori specifici della nicchia nel microambiente cellulare, i metodi per sezionare la localizzazione e la migrazione delle cellule possono fornire ulteriori informazioni sulla funzione cellulare. Le cellule B-1a sono un sottoinsieme di cellule B univoco nei topi che producono anticorpi IgM naturali protettivi contro gli epitopi specifici dell'ossidazione che sorgono durante la salute e la malattia. La produzione di IgM a cellule B-1a varia a seconda della posizione delle cellule B-1a, e quindi diventa utile da un punto di vista terapeutico indirizzare la localizzazione B-1a a nicchie a sostegno della produzione di anticorpi ad alta. Qui descriviamo un metodo per indirizzare la migrazione delle cellule B-1a al midollo osseo per sovraespressione retrovirale del recettore chemiochina C-X-C 4 (CXCR4). L'induzione genica nelle cellule murine B primarie può essere difficile e in genere produce basse efficienze di trasfezione del 10-20% a seconda della tecnica. Qui dimostriamo che la trasduzione retrovirale delle cellule murine B-1a primarie si traduce in un'efficienza di trasduzione del 30-40%. Questo metodo utilizza il trasferimento di cellule adottive di cellule B-1a trasdotte in topi destinatari carenti di cellule B in modo che sia possibile visualizzare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a del donatore B-1a. Questo protocollo può essere modificato per altri costrutti retrovirali e può essere utilizzato in diversi saggi funzionali di trasferimento post-adozione, compresa l'analisi della cellula donor o della funzione della cellula ospite, o l'analisi di fattori solubili secreti dopo il trasferimento di cellule B-1a. L'uso di distinti topi donatori e riceventi differenziati da allotipi CD45.1 e CD45.2 e la presenza di un reporter GFP all'interno del plasmide retrovirale potrebbero anche consentire il rilevamento di cellule donatrici in altri modelli murini immunosufficienti contenenti popolazioni di cellule B endogene.

Introduzione

Recenti studi hanno dimostrato una notevole cellula immunitaria, e in particolare cellule B, fenotipica e eterogeneità funzionale a seconda della localizzazione cellulare¹^,²^,³^,⁴^,⁵. Le cellule B-1a sono una di queste popolazioni con capacità eterogenea di produrre anticorpi IgM protettivi; Le cellule del midollo osseo B-1a secernono IgM in modo costitutivo e contribuiscono in modo significativo al plasma IgM titers⁶, mentre le cellule peritoneali B-1a hanno una secrezione IgM di basso....