Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

Recenti studi hanno dimostrato una notevole cellula immunitaria, e in particolare cellule B, fenotipica e eterogeneità funzionale a seconda della localizzazione cellulare^1,2,3,4,5. Le cellule B-1a sono una di queste popolazioni con capacità eterogenea di produrre anticorpi IgM protettivi; Le cellule del midollo osseo B-1a secernono IgM in modo costitutivo e contribuiscono in modo significativo al plasma IgM titers⁶, mentre le cellule peritoneali B-1a hanno una secrezione IgM di basso livello all'omeostasi e possono invece essere attivate attraverso il recettore innato del toll-like (TLR) o la segnalazione di citokine mediata a proliferare rapidamente, migrare, e secernere IgM^7,8,9,10. Gli anticorpi IgM delle cellule B-1a riconoscono gli epitopi specifici dell'ossidazione (OSE) presenti su patogeni, cellule apoptotiche e LDL ossidati, e il legame IgM all'OSE possono prevenire la segnalazione a valle in malattie come l'aterosclerosi infiammatoria¹¹. Pertanto, le strategie per aumentare la produzione di IgM attraverso l'aumento della migrazione cellulare B-1a peritoneale a siti come il midollo osseo possono essere terapeuticamente utili. Tuttavia, è importante che tali strategie siano mirate e specifiche del tipo di cellula, poiché gli effetti off-target possono avere un impatto negativo sulla funzione o sulla salute del sistema immunitario.

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione mirata e a lungo termine di CXCR4 nelle cellule primarie murine B-1a e il successivo trasferimento adottivo per visualizzare la migrazione delle cellule e la produzione funzionale di anticorpi IgM (Figura 1). La manipolazione genetica delle cellule B primarie è limitata da basse efficienze di trasfezione rispetto alla trasfezione di linee cellulari trasformate. Tuttavia, poiché le linee cellulari trasformate possono deviare significativamente dalle cellule primarie^12,13, è probabile che l'uso di cellule primarie fornisca risultati più strettamente allineati alla fisiologia normale. Sono state descritte diverse tecniche per il trasferimento genico nelle cellule primarie del murino B, tra cui trasduzione retrovirale, trasduzione adenovirale, lipofezione o trasfezione basata sull'elettroporazione, che hanno diversi livelli di efficienza, transitorietà e impatto sulla salute cellulare^13,14,15. Il seguente metodo ha utilizzato la trasduzione retrovirale in quanto ha prodotto un'adeguata efficienza di trasferimento genico di >30%, con un impatto minimo sulla vitalità cellulare. Il retrovirus espresso CXCR4 è stato generato utilizzando il costrutto retrovirale descritto in precedenza per il virus della cellula staminale murine, l'ingresso interno del sito-proteina fluorescente verde (MSCV-IRES-GFP; MigR1)¹⁶, in cui il gene CXCR4 del topo era sub-clonato⁴. Le particelle retrovirali MigR1 (control(Ctl)-GFP) e CXCR4-GFP sono state generate utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio, come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza^4,14.

Le cellule B-1a trasdotte con successo sono state poi trasferite per via endovenosa nei topi Rag1^{-/-mitragliati} carenti di linfocite. Sia i topi donatori che quelli riceventi contenevano inoltre l'eliminazione del gene dell'apolipoproteina E (ApoE), che si traduce in un aumento dell'accumulo di OSE e dell'aterosclerosi, fornendo così un modello per l'attivazione cellulare B-1 in vivo e la produzione di IgM. Inoltre, i topi donatori e ricittori differivano nell'allotipo CD45; Le cellule del donatore B-1 provenivano da^topi CD45.1 e sono stati trasferiti nei^destinatari Rag1^-/- CD45.2. Ciò ha permesso la differenziazione del donatore CD45.1 dalle cellule CD45.2 B del ricevente dopo il trasferimento senza la necessità di macchiare ulteriormente i marcatori di cellule B durante l'analisi della citometria di flusso. I risultati forniti qui dimostrano che la sovraespressione mirata di CXCR4 sulle cellule B-1a si associa alla maggiore capacità delle cellule B-1a di migrare verso il midollo osseo, che associa a un aumento del plasma anti-OSE IgM. Forniamo inoltre un metodo per l'arricchimento delle cellule B-1 peritoneali attraverso la selezione negativa e dimostriamo il requisito dell'attivazione delle cellule B-1 per una trasduzione efficiente. Questo metodo può essere adattato per altri costrutti retrovirali per studiare l'effetto della sovraespressione proteica sulla migrazione, sul fenotipo o sulla funzione delle cellule B-1a. Inoltre, l'uso della distinzione di allotipo CD45.1 rispetto a CD45.2 potrebbe teoricamente consentire il trasferimento in altri modelli murini immunosufficienti contenenti cellule B endogene.

Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università della Virginia.

1. Separazione magnetica e arricchimento delle cellule B-1 peritoneali

1. Eutanasia un topo di 12-14 settimane, maschio, CD45.1^-ApoE^{-/- utilizzando} CO₂.
2. Fare un taglio superficiale nell'addome utilizzando forbici chirurgiche dritte e staccare la pelle utilizzando forbici curve per esporre la parete peritoneale. Sciacquare la cavità peritoneale con un mezzo RPMI-1640 da 37 ml utilizzando una siringa da 10 mL e un ago da 25 G. Agitare il mouse per disinserire le cellule afferrando la coda e muovendo il mouse da un lato all'altro accuratamente per 15-20 s.
   NOTA: Massaggiare il peritoneo lavaged può anche massimizzare il recupero cellulare.
3. Raccogliere il liquido peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL e un ago da 25 G elaborando il liquido nella parte inferiore destra del peritoneo appena sopra il livello dell'anca, vicino all'intestino. Evitare di interrompere depositi di grasso epidydimici e organi sottostanti. Evitare di disegnare liquido dal lato sinistro del mouse come il grasso omentale può essere facilmente attratto nella siringa.
4. Una volta raccolti 6,7 mL di liquido, erogare in un tubo conico da 50 mL posto sul ghiaccio. Successivamente, elevare il mouse verticalmente tenendo la parete peritoneale sopra il diaframma utilizzando pinze in modo che qualsiasi liquido rimanente rimanga nella parte inferiore della cavità peritoneale. Fare un piccolo taglio nella parete peritoneale utilizzando forbici chirurgiche sopra il fegato (assicurarsi di non tagliare il fegato) e raccogliere qualsiasi fluido peritoneale rimanente utilizzando un tubo di vetro e bulbo.
5. In pool le cellule di lavaggio peritoneali di tutti i topi CD45.1^-ApoE^-/- (n - 15-20) in tubi conici da 50 mL, e conservate sul ghiaccio.
   NOTA: Per calcolare il numero di topi necessari: le cellule B-1a costituiscono il 5-10% della popolazione peritoneale totale e producono circa 2,5 x 5 x 10⁵ cellule B-1a per topo nelle mani degli autori. L'efficienza della trasduzione è del 30-40%, come mostrato di seguito.
6. Contare le cellule vive utilizzando un colorante di viabilità come il blu trypan e un emocitometro (campioni diluiti 1:5 in blu trypan e caricare 10 L nella camera emocitometrica). Celle da biliardo fino a 1 x 10⁸ celle per tubo. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, quindi aspirare supernatant.
7. Risospendere fino a 1 x 10⁸ cellule in 1 mL di anticorpo anti-CD16/CD32 (Tabella dei materiali) diluito 1:50 nel buffer di analisi (1x fosfato bufferta salina [PBS], 0.5% bovine siero albumin [BSA], 2 mM EDTA) al fine di bloccare i recettori Fc. Ridimensionare in base alle esigenze in base al numero di celle. Incubare sul ghiaccio per 10 min a 4 gradi centigradi.
8. Preparare un mix master 2x degli anticorpi biotinylati (Tabella 1) in buffer di saggio per l'esaurimento. Il master mix 2x rappresenta il volume del liquido in cui si trovano già le cellule durante l'incubazione con anti-CD16/CD32. Ad esempio, se le cellule sono incubate in 500 gradi di anticorpi diluiti anti-CD16/CD32, aggiungere 500 l di 2x master mix contenenti 10 l di Ter119 biomutato, Gr-1, CD23 e NK1.1 e 25 l degli anticorpi biotinylati F4/80 per ottenere le concentrazioni finali date nella tabella 1. Aggiungete 2x master mix alle celle e colorate per 20 min a 4 gradi centigradi.
9. Lavare le cellule con 5 mL di tampone di analisi e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato.
10. Risospendere e incubare le cellule con microsfere anti-biotina (Tabella dei materiali) diluite nel buffer di analisi in base alla concentrazione e al protocollo raccomandati dal produttore.
11. Lavare con 5 mL di tampone di analisi e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Aspirare supernatante e risospendere fino a 1 x 10⁸ celle in 500 : L di buffer di assay.
12. Prime colonne di selezione magnetica (Tabella dei materiali) con 3 mL di buffer di analisi. Trasferire le cellule su colonne di selezione magnetica innescate e raccogliere l'eluente contenente cellule B-1 arricchite in un tubo conico da 15 mL sul ghiaccio. Lavare la colonna di selezione magnetica con buffer di analisi aggiuntivo fino a quando il volume complessivo raccolto è di 10 mL.
    NOTA: un'aliquota delle frazioni cellulari pre-purificate e post-purificate deve essere analizzata separatamente dalla citometria di flusso per l'efficienza di purificazione mediante la colorazione per le celle CD19 e B, i macrofagi F480 e le celle T CD5, come illustrato nella Figura 2.
13. Contare la frazione di cella post-purificata (l'eluente contenente celle B-1 arricchite) contando le celle vive come nel passaggio 1.6, e risospendere a 1 x 10⁶ cellule/mL nel mezzo di coltura cellulare B (RPMI-1640, 10% siero bovino fetale inattivato dal calore [FBS], 10 m HEPES, 1x aminoacidi non essenziali, 1 mM di pyruvate di sodio, 50 g/mL gentamicin, 55M -mercaptoetanolo).

2. Stimolazione cellulare B-1 peritoneale

1. Dividi cellule raggruppate per le due condizioni trasdotte (Ctl-GFP e CXCR4-GFP), mettendo da parte e placcando almeno 10 x 10⁶ celle per un controllo non transddetto.
2. Piastra fino a 150 l (150.000 cellule) per bene in piastre rotonde-basso 96-pozzo.
3. Aggiungere 100 nM TLR9 agonisto ODN1668 a tutti i pozzi per stimolare la proliferazione cellulare.
4. Incubare per 16/18 h a 37 gradi centigradi, 5% CO₂.

3. Trasduzione retrovirale delle cellule B peritoneali

1. Generare particelle retrovirali Ctl-GFP (MigR1) e CXCR4-GFP utilizzando la trasfezione di fosfato di calcio come descritto nei protocolli pubblicati in precedenza¹⁴.
   NOTA: Questo richiederà diversi giorni, in modo da preparare e titer scorte retrovirali e memorizzare aliquote a -80 c prima di iniziare questo protocollo.
2. Scongelare le scorte di retrovirus sul ghiaccio. Utilizzare immediatamente e non ricongelare come titer virus diminuisce significativamente durante i cicli di congelamento-disgelo. Aggiungere acelle la supernessificatrice retrovirale Ctl-GFP o CXCR4-GFP a 20:1 molteplicità di infezione (MOI), in presenza di 8 polibrene sg/mL e di mercaptoetanolo fresco di mercaptoetanolo a 55 m di concentrazione finale. Non aggiungere scorte virali alle cellule accantonanti per il controllo non transciso.
3. Eseguire la spinfezione da piastre centrifugaa a 800 x g per 90 min a temperatura ambiente.
4. Incubare piastre con retrovirus a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ per altri 3 h.
5. Raccogliere e rifare le cellule nel mezzo di cellule B fresche e incubare a 37 gradi centigradi, il 5% di CO₂ durante la notte.

4. Smistamento cellulare di cellule B-1a trasdotte

1. Raccogliere cellule coltivate e pool in tre tubi conici da 50 mL separati per ogni condizione: non trasstanza, Ctl-GFP transdotta e CXCR4-GFP trasdotta.
2. Contare le cellule vive come nel passo 1.6, quindi centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato.
3. Risospendere le celle a 100.000 celle/l nel buffer di ordinamento (PBS - 1% BSA) contenenti anticorpi 1:50 anti-CD16/CD32 (Tabella dei materiali) per bloccare i recettori Fc. Incubare sul ghiaccio per 10 min a 4 gradi centigradi.
4. Cellule per i controlli di compensazione (30.000 cellule per controllo retributivo): per controlli incontaminati e monotura da campioni non trasdotti e per il controllo delle macchie singole GFP da campioni dotteddotti di d'azione.
   NOTA: i perline di compensazione disponibili in commercio possono essere utilizzati in alternativa per i controlli a macchia singola se il numero di cellulare non transdotti è basso.
5. Preparare una miscela master di 2x anticorpi contenenti gli anticorpi coniugati con fluoroforo nel buffer di ordinamento (Tabella 1). Aggiungere 2x master mix a campioni trasdotti non transdotti, CTL-GFP e campioni trasdotti CXCR4-GFP. Aggiungere singoli anticorpi ai controlli delle macchie singole. Incubare per 20 min a 4 gradi centigradi al buio.
   NOTA: il master mix 2x tiene conto del volume di liquido in cui si trovano già le cellule durante l'incubazione con anti-CD16/CD32, come nel passaggio 1.8. Un aliquota di cellule da ogni condizione può essere colorato separatamente per CXCR4 per confermare la sovraespressione CXCR4.
6. Lavare i campioni con 1 mL di tampone di tipo e filtrare attraverso filtri da 70 m in tubi di polipropilene.
7. Centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e supernatante aspirato. Risospendere i campioni a 50.000 celle/L nel buffer di ordinamento.
8. Prima dello smistamento delle celle preparare tubi di raccolta con attivazione della fluorescenza (FACS) contenenti 1 mL di mezzo di raccolta (RPMI-1640, 20% di FBS disattivazione del calore, 10 m HEPES, 1x aminoacidi non essenziali, 1 mM di pydium pyruvate, 50 g/mL gentamicin, 55 m-mercaptoonol) per ogni popolazione da deordinare.
9. Prima di eseguire campioni sulla selezionatrice di celle aggiungere 2x DAPI (preparato come 1:5000 diluizione nel buffer di ordinamento) per la discriminazione delle cellule morte.
10. Ordinare le cellule B-1a in tubi FACS contenenti il supporto di raccolta come DAPI^- CD19^- BFP^- B220^mid-lo CD23^- IgM^- CD5^- cellule dei campioni CTL-GFP e CXCR4-GFP. Utilizzare il campione non trasseguito per impostare il gate GFP e per ordinare DAPI^- CD19^- GFP^- B220^mid-lo CD23^- IgM^- CD5^- cellule B-1a non trasdotte.
    NOTA: In alternativa, le cellule non transdotte possono anche essere ordinate dai campioni CTL-GFP e CXCR4-GFP grattuando separatamente le cellule B-1a all'interno della frazione GFP. Le cellule B-1b trasdotte o non trasdotte possono anche essere smistati utilizzando questa strategia di ordinamento come DAPI^- CD19^- GFP^-/- B220^mid-lo CD23^- IgM^- CD5^- cellule.

5. Trasferimento adottivo

1. Dopo lo smistamento delle cellule, centrifugare le cellule a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi e aspirare supernatante con attenzione.
2. Risospendere le cellule a freddo sterile 1x PBS a 1.000 celle/L.
3. Anestesizzare maschio Rag1^-/- ApoE^-/- topi che utilizzano isoflurane e iniettare 100 L (100,000 cellule) per topo tramite iniezione di vena retro-orbitale o coda per via endovenosa o vena posteriore utilizzando una siringa di insulina ultra-fine. Iniettare alcuni topi con 1x PBS come controllo.

6. Quantificazione delle cellule donatrici e del plasma IgM

1. Al momento desiderato trasferimento post-adozione, analizzare le cellule trasferite nei topi destinatari con midollo osseo e tessuto della milza raccolto⁴ e citometria di flusso. Quantifica la localizzazione delle cellule donatorie e la sovraespressione CXCR4 colorando CD45.1, CD45.2 e CXCR4 e analizza i risultati della citometria di flusso utilizzando un software come Flowjo.
   NOTA: Vedere la Tabella 1 per gli anticorpi utilizzati in questo passaggio. Assicurarsi di non utilizzare un controcatenare coniugato che fluoresce nel canale FITC come GFP sarà presente sulle cellule donatrici trasdotte.
2. Isolare il plasma aggiungendo 10 DiVi di 0,5 M EDTA al sangue intero raccolto tramite puntura cardiaca al momento del sacrificio animale. Centrifugare il sangue intero a 7.000 x g e il plasma sifezza in tubi di centrifuga tural separati da 1,5 mL. Conservare a -80 gradi centigradi fino a eseguire l'analisi di fattori secreti come IgM di ELISA⁴.

Una panoramica del protocollo è data figura 1. La figura 2 mostra l'arricchimento delle cellule B-1a peritoneali dopo l'esaurimento magnetico di altri tipi di cellule peritoneali. Le cellule singlet vive nella frazione post-deplezione hanno una percentuale maggiore di cellule B CD19 e B rispetto a F4/80- macrofagi, mancano di cellule CD5hi CD19- T e contengono una frequenza maggiore di cellule Cd19 - CD5medie B-1a rispetto alla frazione di pre-esaurimento.+ Nella figura 3 viene illustrato il requisito dell'attivazione delle cellule B per una corretta trasduzione retrovirale delle cellule B e un aumento dipendente dalla dose della frequenza dei sottoinsiemi di cellule GFP B trasdotte con successo con l'aumento del virus MOI mediante retrovirus Ctl-GFP. La Tabella 2 mostra una maggiore efficienza di trasduzione utilizzando 96 piastre ben rotonde rispetto a piastre da 24 o 6 pozze. La figura 4 mostra la sovraespressione CXCR4 riuscita (>40%) sulle cellule B-1 e ha aumentato la migrazione delle cellule B-1 verso CXCL12 in vitro dopo la trasduzione con il retrovirus CXCR4-GFP, senza un impatto significativo sulla vitalità delle cellule B. Nella figura 5 viene visualizzata la strategia di gating per l'ordinamento delle celle live, singlet, CD19 CD23- IgM CD5 B-1a da una condizione non trasdotta (GFP-) o le due condizioni trasdotte (GFP). Si noti che le cellule B-2 CD23 non sono presenti in questi campioni a causa di un precedente esaurimento magnetico. Le cellule live, singlet, CD23- IgM CD5- B-1b trasdotte possono anche essere ordinate utilizzando questa strategia di gating. La figura 6 mostra le cellule donatrici CD45.1 e la sovraespressione CXCR4 sostenuta sulle cellule donatrici recuperate dal midollo osseo e dalla milza di topi ricasilo CD45.2 17 settimane di trasferimento post-cellula. La tabella 3 mostra un'associazione positiva tra l'espressione CXCR4 e la localizzazione delle cellule donatorie al midollo osseo, ma non la milza. La tabella 4 mostra un'associazione positiva tra il numero di cellule del donatore nel midollo osseo e la quantità plasmatica di anti-MDA-LDL IgM.

Figura 1: Schema della progettazione sperimentale per la trasduzione retrovirale e il trasferimento adottivo. Le cellule peritoneali isolate dai topi allotipi CD45.1 sono arricchite per le cellule B-1 attraverso l'esaurimento magnetico utilizzando anticorpi biotinylati e microsfere antibiotiche. Le cellule B-1 peritoneali arricchite vengono attivate per stimolare la proliferazione cellulare con l'agonista TLR9 Cpoligodeoxynucleotide. Le cellule attivate vengono traduci con particelle retrovirali Ctl-GFP o CXCR4-GFP. Le cellule B-1a trasdotte con successo vengono ordinate utilizzando FACS e trasferite adottivamente nei topi ospiti allotipi CD45.2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Arricchimento per le cellule B-1 peritoneali. Grafici di citometria di flusso rappresentativi di cellule peritoneali pre-arricchimento magnetico (in alto) e arricchimento post-magnetico (in basso) per le cellule CD19 e B. Le cellule CD19 E F4/80 sono cellule B, le cellule CD19- F4/80 sono macrofagi, le cellulemedie CD5 CD5 sono cellule B-1a e le cellulehi CD19- CD5 sono cellule T. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: La trasduzione retrovirale richiede l'attivazione delle cellule B. Le cellule Peritoneal B sono state trasdotte con il retrovirus Ctl-GFP a 5:1, 10:1 o 25:1 MOI o sinistra non trasdotta in presenza o assenza di CpG ODN1668, agonista del TLR9. La frequenza delle cellule GFP B2, B1, B-1a o B-1b è stata quantificata dalla citometria di flusso 18 h dopo la trasduzione. Le barre di errore rappresentano la media - SEM. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Conferma della sovraespressione CXCR4 e aumento della migrazione B-1a in vitro. Le cellule B peritoneali provenienti da topi ApoE-/- con carenza di cellule B specifiche di CXCR4 sono state isolate e tradusse con retrovirus Ctl-GFP o CXCR4-GFP, o coltivate senza trasduzione. (a) Grafici di flusso rappresentativi dell'espressione CXCR4 e GFP su cellule B-1 da condizioni non trasdotte (in alto a sinistra), Ctl-GFP trasdotte (in basso a sinistra) o transdotte CXCR4-GFP (in basso a destra). FMO-CXCR4 (in alto a destra) utilizzato per impostare il cancello positivo CXCR4. (b) Quantificazione delle IFM di CXCR4 su cellule B-1 di GFP a partire da condizioni non trasdotte (n - 1), Ctl-GFP trasdotte (n ) o Transdotted CXCR4-GFP (n - 2). (c) Frequenza delle cellule B-1 non trasdotte (n - 1), Ctl-GFP trasdotte (n - 2) o CXCR4-GFP trasdotte (n - 2) che migravano verso CXCL12 come percentuale del numero totale di cellule B-1 caricate nel transwell. (d) Strategia rappresentativa per la quantificazione delle cellule vitali all'interno della popolazione di cellule B trasdotta con successo (CD19-GFP). (e) Frequenza delle cellule B vive dopo la trasduzione con Ctl-GFP (n ) o retrovirus CXCR4-GFP (n ) . Le barre di errore rappresentano la media : SEM. Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Strategia di Gating per l'ordinamento di cellule B-1a transdotte. Grafici di citometria di flusso rappresentativi per l'ordinamento delle celle GFP o GFP-B-1a da un campione non trasposto (in alto), un campione transdotto Ctl-GFP (al centro) e un campione transdotta CXCR4-GFP (in basso). Cellule B-1a definite come cellule live, singlet, CD23- CD23 - IgM CD5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Quantificazione delle cellule del donatore trasferite. Grafici di citometria a flusso rappresentativi che visualizzano le celle donatrici CD45.1 e CD45.2- da un controllo PBS (superiore), un recipiente di celle Ctl-GFP B-1a (al centro) e un destinatario di celle CXCR4-GFP B-1a (in basso) e l'analisi successiva dell'espressione CXCR4 sulle cellule del donatore nel midollo osseo(un)o come una milza (b). Quantificazione dell'espressione CXCR4 (intensità media a fluorescenza, MFI) sulle cellule donatrici dal midollo osseo (c) o dalla milza (d). Quantificazione del numero di cellule donatrici recuperate nel midollo osseo (e) o nella milzadeidestinatari. P < 0,05 o P < 0,01 dal test Mann-Whitney. Le barre di errore rappresentano la media : SEM. Questa cifra è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione4. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Anticorpi e le loro concentrazioni finali utilizzate nel protocollo.

Tabella 2: Ottimizzazione della piastra. La frequenza delle cellule totali di GFP o delle cellule GFP CD19 B dopo la trasduzione di 6 x 106 cellule B-1 arricchite in una piastra a fondo rotondo di 96 pozzetti (40 pozzi a 150,00 0 cellule per pozzo), una piastra di 24 pozzetti (6 pozzi a 1 x 106 cellule per pozzo), o una piastra 6-po (3 pozzi a 2 x 106 cellule per pozzo) a un MOI 20:1 con retrovirus Ctl-GFP.

Tabella 3: Associazione tra espressione CXCR4 sulle cellule donatrici e localizzazione delle cellule donatrici. L'intensità media di fluorescenza (MFI) di CXCR4 sulle cellule del donatore B-1a è correlata al numero di cellule B-1a del donatore nel midollo osseo o nella milza di Rag1-/- ApoE-/- i topi riceventi 17 settimane dopo il trasferimento post-adozione. Dati presentati come coefficiente di correlazione (r) e significatività statistica (p). Questa tabella è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione4.

Tabella 4: Associazione tra localizzazione delle cellule donatorie e quantità di plasma IgM. Il numero di cellule del donatore B-1a nel midollo osseo di Rag1-/- ApoE-/- topi riceventi 17 settimane di trasferimento post-adozione correlato con la quantità circolante di anti-MDA-LDL IgM, E06/T15 IgM, o anti-1,3-dextran IgM. Dati presentati come coefficiente di correlazione (r) e significatività statistica (p). Questa tabella è stata modificata dalla nostra precedente pubblicazione4.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.