Summary
هنا نصف طريقة لفرط في التعبير الرجعية ونقل بالتبني من الخلايا B-1a المورين لفحص في حالة انتقال الخلية B-1a والتعريب. يمكن تمديد هذا البروتوكول للمقالات الوظيفية المتنوعة في المصب بما في ذلك التحديد الكمي لتوطين الخلايا B-1a المانحة أو تحليل العوامل المفرزة المشتقة من الخلايا المانحة بعد النقل بالتبني.
Abstract
كما تتأثر وظيفة الخلية بعوامل متخصصة في البيئة الدقيقة الخلوية، وطرق تشريح توطين الخلية والترحيل يمكن أن توفر المزيد من البصيرة على وظيفة الخلية. الخلايا B-1a هي مجموعة فرعية فريدة من نوعها خلية B في الفئران التي تنتج الأجسام المضادة IgM الطبيعية الواقية ضد epitopes الأكسدة الخاصة التي تنشأ أثناء الصحة والمرض. B-1a إنتاج الخلية IgM يختلف اعتمادا على موقع الخلية B-1a، وبالتالي يصبح من المفيد من وجهة نظر علاجية لاستهداف B-1a التعريب إلى منافذ داعمة لإنتاج الأجسام المضادة عالية. هنا نحن وصف طريقة لاستهداف هجرة الخلايا B-1a إلى نخاع العظام عن طريق التعبير المفرط بوساطة الرجعية من مستقبلات كيموكين زفكرة C-X-C 4 (CXCR4). يمكن أن يكون تحريض الجينات في خلايا المورين B الأولية تحديًا وعادةما ينتج كفاءة نقل منخفضة بنسبة 10-20٪ اعتمادًا على التقنية. هنا نثبت أن نقل الفيروس الرجعي من الخلايا الأولية B-1a الخلايا يؤدي إلى 30-40٪ كفاءة نقل. تستخدم هذه الطريقة نقل الخلايا بالتبني للخلايا B-1a المستحثة إلى فئران متلقية ناقصة الخلية B بحيث يمكن تصور ترحيل الخلايا B-1a وتوطينها. يمكن تعديل هذا البروتوكول لبنيات أخرى من الفيروسات الرجعية ويمكن استخدامها في المقالات الوظيفية المتنوعة بعد نقل بالتبني، بما في ذلك تحليل الخلية المانحة أو الخلية المضيفة فيلوب ووظيفة، أو تحليل العوامل القابلة للذوبان تفرز بعد نقل الخلية B-1a. كما أن استخدام فئران مانحة ومتلقية متميزة متمايزة بواسطة CD45.1 وCD45.2 allotype ووجود مراسل GFP داخل البلازميد الرجعي يمكن أن يمكّن أيضًا من الكشف عن الخلايا المانحة في نماذج فأرة أخرى كافية للمناعة تحتوي على مجموعات خلايا B داخلية.
Introduction
وقد أظهرت الدراسات الحديثة خلايا مناعية كبيرة، وتحديدا خلية B، التغايرية الفينوتيرية والوظيفية اعتمادا على توطين الخلايا1،,2،,3،,4،,5. الخلايا B-1a هي واحدة من هذه السكان مع القدرة غير المتجانسة لإنتاج الأجسام المضادة IgM واقية; نخاع العظم B-1a الخلايا إفراز IgM التأسيسية والمساهمة بشكل كبير في البلازما IgM titers6, في حين أن خلايا ب-1a بب ذات مستوى منخفض إفراز IgM في التوازن بدلا من ذلك يمكن تفعيلها من خلال مستقبلات مثل حصيلة فطرية (TLR) أو السيتوكين بوساطة إشارة إلى الانتشار السريع, الهجرة, وإفراز IgM7,,8,,9,,10. B-1a الخلية IgM الأجسام المضادة التعرف على epitopes الأكسدة محددة (OSE) التي هي موجودة على مسببات الأمراض, الخلايا المبرمجة, وLDL مؤكسد, وIgM ملزمة لOSE يمكن منع إشارات المصب الالتهابي في أمراض مثل تصلب الشرايين11. لذلك ، قد تكون استراتيجيات زيادة إنتاج IgM عن طريق زيادة هجرة الخلايا B-1a الجبقية إلى مواقع مثل نخاع العظم مفيدة علاجيًا. ومع ذلك، من المهم أن تكون هذه الاستراتيجيات مستهدفة ومحددة من نوع الخلية، حيث أن الآثار غير المستهدفة قد تؤثر سلبًا على وظيفة المناعة أو الصحة.
هنا نحن وصف طريقة لموجه وطويلة الأجل overexpression CXCR4 في الخلايا الأولية B-1a murine ونقل بالتبني اللاحقة لتصور هجرة الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة IgM وظيفية(الشكل 1). ويكون التلاعب الجيني بالخلايا B الأولية محدودًا بسبب انخفاض كفاءة التَلَقمقارنة بمعالجة خطوط الخلايا المتحولة. ومع ذلك ، كما خطوط الخلايا المحولة يمكن أن تحيد بشكل كبير عن الخلايا الأولية12،13، واستخدام الخلايا الأولية من المرجح أن توفر النتائج التي تتماشى بشكل وثيق مع علم وظائف الأعضاء العادية. وقد وصفت عدة تقنيات لنقل الجينات في الخلايا الأولية المورين باء, بما في ذلك نقل الفيروس الرجعي, نقل الغدي الفيروسي, lipofection, أو التسفير القائم على الكهربية, التي لديها مستويات متفاوتة من الكفاءة, انتقال, وتأثير على صحة الخلايا13,,14,,15. استخدمت الطريقة التالية نقل الفيروس الرجعي لأنها أسفرت عن كفاءة كافية لنقل الجينات بنسبة > 30٪ في حين تؤثر على الحد الأدنى من صلاحية الخلية. تم إنشاء الفيروس الرجعي CXCR4 المعبر عنه باستخدام الفيروس الرجعي الموصوف سابقًا بناء فيروس الخلايا الجذعية المورينداخلي -بروتين الفلورسنت الأخضر (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, التي كان الماوس CXCR4 الجين الفرعي المستنسخة4. تم إنشاء MigR1 (التحكم (Ctl)-GFP) وجزيئات الرجعية CXCR4-GFP باستخدام التفسفات فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا4,14.
تم نقل الخلايا B-1a التي تم نقلها بنجاح عن طريق الوريد إلى Rag1-/- الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الليمفاوية. بالإضافة إلى ذلك، احتوت الفئران المانحة والمتلقية بالضربة القاضية لمورثة apolipoprotein E (ApoE) ، مما يؤدي إلى زيادة تراكم OSE وتصلب الشرايين ، مما يوفر نموذجًا لتنشيط الخلية B-1 في الجسم الحي وإنتاج IgM. وعلاوة على ذلك، اختلفت الفئران المانحة والمتلقية في النمط الكلووي CD45؛ جاءت الخلايا B-1 المانحة من CD45.1+ ApoE-/- الفئران وتم نقلها إلى Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-المستلمين. سمح هذا التمايز من المانح CD45.1 من المتلقي CD45.2 B الخلايا بعد النقل دون الحاجة إلى وصمة عار بالإضافة إلى علامات الخلية B أثناء تحليل قياس الخلايا التدفق. النتائج المقدمة هنا تثبت أن الهدف CXCR4 الإفراط في التعبير على الخلايا B-1a المنتسبين مع زيادة قدرة الخلايا B-1a على الهجرة إلى نخاع العظام، الذي يرتبط مع زيادة البلازما المضادة OSE IgM. نحن نقدم بالإضافة إلى ذلك طريقة لتخصيب خلايا ب-1 ب الجهوية من خلال الاختيار السلبي وإظهار متطلبات تنشيط الخلية B-1 من أجل نقل فعال. يمكن تكييف هذه الطريقة لبنيات أخرى رجعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير البروتيني على هجرة الخلايا B-1a أو النمط الظاهري أو الوظيفة. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام CD45.1 مقابل CD45.2 التمييز allotype يمكن أن تسمح نظريا ً بالانتقال إلى نماذج أخرى كافية من التورين المناعي تحتوي على خلايا B ذاتية المنشأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة فرجينيا.
1. الفصل المغناطيسي وإثراء الخلايا ب-1 الجبقية
- القتل الرحيم 12-14 أسبوعا من العمر، ذكر، CD45.1+ApoE-/- الماوس باستخدام CO2.
- جعل قطع سطحية في البطن باستخدام مقص الجراحية على التوالي وقشر الجلد مرة أخرى باستخدام مقص منحني لفضح الجدار الجبقية. تجويف بافيق بزاوية 10 مل من 37 درجة مئوية دورة في الدقيقة 1640 المتوسطة باستخدام حقنة 10 مل و25 G إبرة. هز الماوس لفك الارتباط الخلايا عن طريق فهم الذيل وتحريك الجانب الماوس إلى جانب بدقة ل15-20 s.
ملاحظة: تدليك بافيتونوم اللافج يمكن أيضا تحقيق أقصى قدر من استعادة الخلية. - جمع السائل الجفيتوني باستخدام حقنة 10 مل و 25 G إبرة عن طريق رسم السوائل في الجانب الأيمن السفلي من الجيوم فقط فوق مستوى الورك، بالقرب من الأمعاء. تجنب تعطيل مستودعات الدهون epidydimal والأعضاء الكامنة. تجنب سحب السوائل من الجانب الأيسر للفأرة حيث يمكن بسهولة سحب الدهون omental إلى الحقنة.
- بمجرد جمع ~ 6−7 مل من السوائل، الاستغناء في أنبوب مخروطي 50 مل وضعت على الجليد. بعد ذلك ، ارفع الماوس عموديًا عن طريق الإمساك بالجدار الصفاق فوق الحجاب الحاجز باستخدام الملقط بحيث يبقى أي سائل متبقي في الجزء السفلي من تجويف الصفاق. جعل قطع صغيرة في الجدار الجبقية باستخدام مقص الجراحية فوق الكبد (تأكد من عدم قطع الكبد) وجمع أي السائل الجبقية المتبقية باستخدام أنبوب زجاجي ولمبة.
- تجمع خلايا الغسل الجيومية من جميع CD45.1+ApoE-/- الفئران (ن = 15-20) إلى أنابيب مخروطية 50 مل، وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: لحساب عدد الفئران اللازمة: تشكل خلايا B-1a 5-10٪ من إجمالي عدد الخلايا الجبقية وينتج ما يقرب من 2.5-5 × 105 خلايا B-1a لكل فأر في أيدي المؤلفين. كفاءة التحويل هي ~ 30-40 ٪، كما هو مبين أدناه. - عد الخلايا الحية باستخدام صبغة الجدوى مثل الأزرق trypan ومقياس الهيموكيتومتر (تمييع العينات 1:5 في blue trypan وتحميل 10 ميكرولتر في غرفة قياس الهيموكيتومتر). تجمع الخلايا في ما يصل إلى 1 × 108 خلايا لكل أنبوب. خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية، ثم تستنشق supernatant.
- إعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 108 خلايا في 1 مل من الأجسام المضادة لمكافحة CD16/CD32(جدول المواد)المخفف 1:50 في عازلة فحص (1x الفوسفات عازلة المحلول [PBS], 0.5% البودرة الألبوم المصل [BSA], 2 mM EDTA) من أجل منع مستقبلات Fc. مقياس حسب الضرورة استناداً إلى عدد الخلايا. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة في 4 °C.
- إعداد مزيج رئيسي 2x من الأجسام المضادة الحيوية الصغيرة(الجدول 1)في عازلة القول للنضوب. يفسر المزيج الرئيسي 2x حجم السائل الذي توجد فيه الخلايا بالفعل عند احتضانه بمضاد CD16/CD32. على سبيل المثال، إذا كانت الخلايا تحتضن 500 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة CD16/CD32، فأضف 500 ميكرولتر من المزيج الرئيسي 2x الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من Ter119 وGr-1 و CD23 وNK1.1 الأجسام المضادة و25 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحيوية الصغيرة جداً F4/80 لتحقيق التركيزات النهائية الواردة في الجدول 1. إضافة مزيج رئيسي 2x إلى الخلايا ووصمة عار لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مع 5 مل من عازلة وأجهزة الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant.
- إعادة تعليق واحتضان الخلايا مع الميكروبات المضادة للالبيوتين(جدول المواد)المخفف في عازلة فحص وفقا للتركيز والبروتوكول الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
- اغسل بسعة 5 مل من عازل الزى والطرد المركزى عند 400 × جرام لمدة 5 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. استنس supernatant وإعادة تعليق ما يصل إلى 1 × 108 خلايا في 500 ميكرولتر من عازلة ازى.
- أعمدة الاختيار المغناطيسي رئيس(جدول المواد)مع 3 مل من عازلة ازى. نقل الخلايا على أعمدة الاختيار المغناطيسي تستعد وجمع eluent التي تحتوي على الخلايا المخصب B-1 في أنبوب مخروطي 15 مل على الجليد. اغسل عمود التحديد المغناطيسي بعازل فحص إضافي حتى يكون الحجم الإجمالي الذي تم جمعه 10 مل.
ملاحظة: يجب تحليل أتريدوت من كسور الخلايا المنقاة مسبقًا وما بعد التنقية بشكل منفصل عن طريق قياس خلايا التدفق لكفاءة التنقية عن طريق تلطيخ خلايا CD19 + B ، والفحاق F480 + ، وخلايا CD5 + T كما هو موضح في الشكل 2. - عد كسر الخلية بعد تنقية (الإلونت الذي يحتوي على خلايا B-1 المخصب) عن طريق حساب الخلايا الحية كما هو الحال في الخطوة 1.6، وإعادة تعليق في 1 × 106 خلايا / مل في خلية B المتوسطة الثقافة (RPMI-1640, 10% الحرارة المعطلة مصل البقر الجنين [FBS], 10 mM HEPES, 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية, 1 mM بيروفات الصوديوم, 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين, 55 ميكرون α-mercaptoethanol).
2. تحفيز الخلية B-1 ب بيريتونال
- انقسام الخلايا المجمعة للشرطين المستحثين (Ctl-GFP و CXCR4-GFP)، مع وضع جانبا وطلاء ما لا يقل عن 10 × 106 خلايا للتحكم غير المستحث.
- لوحة تصل إلى 150 ميكرولتر (150،000 خلية) لكل بئر في لوحات مستديرة القاع 96 بئر.
- إضافة 100 nM TLR9 agonist ODN1668 إلى جميع الآبار لتحفيز انتشار الخلايا.
- احتضان 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2.
3- نقل الفيروس الرجعي للخلايا الجهوية باء
- إنشاء Ctl-GFP (MigR1) وCXCR4-GFP الجسيمات الرجعية باستخدام التقافي فوسفات الكالسيوم كما هو موضح في البروتوكولات المنشورة سابقا14.
ملاحظة: سيستغرق هذا عدة أيام، لذلك قم بإعداد وtiter مخزونات الفيروسات الرجعية وتخزين aliquots في -80 درجة مئوية قبل بدء هذا البروتوكول. - ذوبان أرصدة الفيروسات الرجعية على الجليد. استخدام على الفور وعدم إعادة تجميد كما titer الفيروس يقلل بشكل كبير خلال دورات تجميد ذوبان الجليد. إضافة Ctl-GFP أو CXCR4-GFP المواد الخارقة للفيروسات الرجعية في 20:1 تعدد العدوى (وزارة الداخلية) إلى الخلايا، في وجود 8 ميكروغرام / مل polybrene وجديدة β-mercaptoethanol في تركيز نهائي 55 ميكرومتر. لا تضيف مخزونات فيروسية إلى الخلايا المخصصة للتحكم غير المستحث.
- تنفيذ spinfection بواسطة لوحات الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- ألواح الحاضنة مع الفيروس الرجعي عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 3 ساعة إضافية.
- حصاد وإعادة صف الخلايا في خلية جديدة متوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
4. فرز الخلية من الخلايا الجبريتوب المستحثة B-1a
- حصاد الخلايا المستزرعة وتجمع في ثلاثة أنابيب مخروطية منفصلة 50 مل لكل حالة: غير مستحثة، Ctl-GFP المستحثة، وCXCR4-GFP المستحثة.
- عد الخلايا الحية كما هو الحال في الخطوة 1.6، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant.
- إعادة تعليق الخلايا في 100،000 الخلايا / μL في عازلة الفرز (PBS + 1٪ BSA) التي تحتوي على 1:50 المضادة CD16/CD32 الأجسام المضادة(جدول المواد) منأجل منع مستقبلات Fc. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة في 4 °C.
- Aliquot الخلايا لضوابط التعويض (~ 30،000 الخلايا لكل مراقبة التعويض): لغير الملطخة وواحد عناصر التحكم وصمة عار aliquot من عينة غير مرسلة وللGFP واحد للسيطرة على وصمة عار aliquot من عينات المستحثة.
ملاحظة: يمكن استخدام حبات التعويض المتاحة تجاريًا بدلاً من ذلك لضوابط وصمة عار واحدة إذا كان رقم الخلية غير المستحث منخفضًا. - إعداد مزيج الأجسام المضادة 2x الرئيسية التي تحتوي على الأجسام المضادة المفلورة الزوجية في نوع عازلة(الجدول 1). أضف مزيجًا رئيسيًا 2x إلى عينات مرسلة غير مرسلة من CTL-GFP وCXCR4-GFP. إضافة الأجسام المضادة الفردية إلى عناصر التحكم وصمة عار واحدة. احتضان لمدة 20 دقيقة في 4 °C في الظلام.
ملاحظة: حسابات المزيج الرئيسي 2x لحجم السائل الخلايا موجودة بالفعل عند احتضان مع مكافحة CD16/CD32، كما هو الحال في الخطوة 1.8. يمكن أن تكون ملطخة aliquot من الخلايا من كل حالة بشكل منفصل لCXCR4 لتأكيد التعبير المفرط CXCR4. - غسل العينات مع 1 مل من نوع عازلة وسلالة من خلال مرشحات 70 ميكرون في أنابيب البولي بروبلين.
- الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant. إعادة تعليق العينات في 50,000 خلية/ميكرولتر في المخزن المؤقت الفرز.
- قبل فرز الخلايا إعداد المسمى الفلورسينس تنشيط أنابيب جمع الخلايا (FACS) التي تحتوي على 1 مل من وسط جمع (RPMI-1640، 20٪ من الـ FBS المنشط للحرارة، 10 mM HEPES، 1x الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1 mm الصوديوم بيروفات، 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين، 55 ميكرومتر- ميركابتوإيثانول) لكل مجموعة من السكان ليتم فرزها.
- قبل تشغيل العينات على الفرز الخلية إضافة 2x DAPI (أعدت على النحو 1:5000 تخفيف في عازلة الفرز) للتمييز الخلية الميتة.
- فرز GFP + B-1a الخلايا في أنابيب FACS التي تحتوي على المتوسطة جمع DAPI- CD19+ GFP+ B220منتصف لو CD23- IgM+ CD5+ الخلايا من عينات CTL-GFP و CXCR4-GFP. استخدم العينة غير المستحثة لتعيين بوابة GFP+ وفرز DAPI- CD19+ GFP- B220منتصف قرص CD23- IgM+ CD5+ الخلايا B-1a غير المستحثة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن أيضاً فرز الخلايا غير المستحثة من عينات CTL-GFP و CXCR4-GFP عن طريق الخلايا B-1a التي تقُطّر بشكل منفصل داخل الكسر GFP. يمكن أيضًا فرز الخلايا B-1b المستحثة أو غير المستحثة باستخدام استراتيجية الفرز هذه كـ DAPI- CD19+ GFP+/- B220منتصف قرص CD23- IgM+ CD5- الخلايا.
5- النقل بالتبني
- بعد فرز الخلايا، خلايا الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية وتستنشق supernatant بعناية.
- إعادة تعليق الخلايا في الباردة المعقمة 1x PBS في 1000 خلية / ميكرولتر.
- التخدير الذكور Rag1-/- ApoE-/- الفئران باستخدام الايزوفلوران وحقن 100 ميكرولتر (100،000 خلية) لكل فأر عن طريق الوريد الرجعية المدارية أو حقن الوريد الذيل باستخدام حقنة الأنسولين فائقة الغرامة. حقن عدد قليل من الفئران مع 1x PBS كعنصر تحكم.
6- القياس الكمي للخلايا المانحة والبلازما IgM
- في الوقت المطلوب بعد نقل بالتبني، وتحليل الخلايا المنقولة في الفئران المتلقية عن طريق نخاع العظام والطحال الأنسجة الحصاد4 وتدفق القياس الخلوي. تحديد تعريب الخلايا المانحة والتعبير المفرط CXCR4 عن طريق تلطيخ CD45.1 و CD45.2 و CXCR4 وتحليل نتائج قياس الخلايا التدفق باستخدام برنامج مثل Flowjo.
ملاحظة: راجع الجدول 1 للأجسام المضادة المستخدمة في هذه الخطوة. تأكد من عدم استخدام اقتران الأجسام المضادة التي الفلورسيس في قناة FITC كما GFP سوف تكون موجودة على الخلايا المانحة المستحثة. - عزل البلازما عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى الدم كله التي تم جمعها عن طريق ثقب القلب في وقت التضحية بالحيوان. الطرد المركزي كامل الدم في 7000 × ز والبلازما aliquot في أنابيب منفصلة 1.5 مل الطرد المركزي. تخزين في -80 درجة مئوية حتى إجراء تحليل للعوامل المفرزة مثل IgM بواسطة ELISA4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد لمحة عامة عن البروتوكول في الشكل 1. يعرض الشكل 2 إثراء الخلايا الجبيرية B-1a بعد الاستنفاد المغناطيسي لأنواع الخلايا الجبقية الأخرى. يعيش خلايا مفردة في كسر ما بعد الاستنفاد لديها نسبة أكبر من خلايا CD19 + B مقارنة مع F4/80+ الضامة، وعدم وجود CD5مرحبا CD19- الخلايا التائية، وتحتوي على زيادة وتيرة CD19+ CD5منتصف B-1a الخلايا مقارنة مع كسر ما قبل الاستنفاد. يعرض الشكل 3 متطلبات تنشيط الخلية B لنقل الخلية B الرجعية الناجحة ، وزيادة تعتمد على الجرعة في تكرار المجموعات الفرعية للخلايا GFP + B المستحثة بنجاح مع زيادة فيروس MOI باستخدام فيروس Ctl-GFP الرجعي. ويعرض الجدول 2 زيادة كفاءة النقل باستخدام 96 لوحة مستديرة القاع جيدا مقارنة مع لوحات 24 بئر أو 6 بئر. الشكل 4 يعرض التعبير المفرط الناجح CXCR4 (> 40٪ ) على الخلايا B-1 وزيادة هجرة الخلايا B-1 نحو CXCL12 في المختبر بعد نقل مع CXCR4-GFP الفيروس الرجعي, دون تأثير كبير على قدرة الخلية B. يعرض الشكل 5 استراتيجية الجاتينغ لفرز الخلايا الحية، المفرد، CD19+ CD23- IgM+ CD5+ B-1a من إما حالة غير مرسلة (GFP-)، أو الشرطين المستحثين (GFP+). لاحظ أن خلايا CD23+ B-2 غير موجودة في هذه العينات بسبب الاستنفاد المغناطيسي السابق. يمكن أيضًا فرز خلايا البث المباشر، المفرد، CD19+ CD23- IgM+ CD5- B-1b باستخدام استراتيجية الجاتينغ هذه. الشكل 6 يعرض CD45.1 + نقل الخلايا المانحة والمستمر CXCR4 الإفراط في التعبير على الخلايا المانحة تعافى من نخاع العظام والطحال من الفئران المتلقي CD45.2 17 أسابيع بعد نقل الخلية. يعرض الجدول 3 ارتباطًا إيجابيًا بين تعبير CXCR4 وتوطين الخلايا المانحة إلى نخاع العظم، ولكن ليس الطحال. يعرض الجدول 4 ارتباطًا إيجابيًا بين رقم الخلية المانحة في نخاع العظم وكمية البلازما من مضادات MDA-LDL IgM.
الشكل 1: التخطيطي للتصميم التجريبي لنقل الفيروس الرجعي والنقل بالتبني. يتم إثراء الخلايا البرية المعزولة عن الفئران الكلوية CD45.1 لخلايا B-1 من خلال الاستنفاد المغناطيسي باستخدام الأجسام المضادة الحيوية الصغيرة وخرزات مضادة للالبيوتين. يتم تنشيط الخلايا الجبريتانية الغنية B-1 لتحفيز انتشار الخلايا مع TLR9 agonist CpG oligodeoxynucleotide. يتم نقل الخلايا المنشطة مع جزيئات الرجعية Ctl-GFP أو CXCR4-GFP. يتم فرز الخلايا GFP + B-1a المستحثة بنجاح باستخدام FACS ونقلها بالتبني إلى فئران مضيف ة CD45.2 allotype. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إثراء خلايا ب-1 الجبائية. قطع الخلايا المتدفقة التمثيلية للخلايا الصفاقية قبل الإثراء المغناطيسي (أعلى) والإثراء بعد المغناطيسي (أسفل) لخلايا CD19 + B. CD19 + F4/80- الخلايا هي خلايا B، CD19- F4/80+ الخلايا هي الضامة، CD19 + CD5 الخلاياالوسطى هي خلايا B-1a، وCD19-CD5خلايا مرحبا هي خلايا T. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يتطلب نقل الفيروس الرجعي تنشيط الخلية B. تم نقل خلايا بيريتونال B مع فيروس الرجعية Ctl-GFP في 5:1، 10:1، أو 25:1 وزارة الداخلية أو تركت غير مستحثة في وجود أو عدم وجود TLR9 agonist CpG ODN1668. تم قياس تردد بنجاح GFP + B2 أو B1 أو B-1a أو B-1b بواسطة قياس التدفق الخلوي 18 ساعة بعد النقل. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تأكيد التعبير المفرط CXCR4 وزيادة الهجرة B-1a في المختبر. تم عزل خلايا بيريتونال B من ApoE-/- الفئران التي تعاني من نقص خاص بالخلية B من CXCR4 وتنتقل مع فيروس Ctl-GFP أو CXCR4-GFP الرجعي، أو استزراعه دون نقل. (أ)قطع تدفق تمثيلية لتعبير CXCR4 وGFP على خلايا B-1 من غير المستحثة (أعلى اليسار)، Ctl-GFP المستحثة (أسفل اليسار)، أو CXCR4-GFP المستحثة (أسفل اليمين). FMO-CXCR4 (أعلى اليمين) تستخدم لتعيين بوابة CXCR4 إيجابية. (ب)القياس الكمي للمؤسسة المتعددة الناحية من CXCR4 على GFP + B-1 الخلايا من غير المستحثة (ن = 1)، Ctl-GFP المستحثة (ن = 2)، أو CXCR4-GFP المستحثة (ن = 2) الشروط. (ج)تواتر الخلايا غير المستحثة (n = 1)، أو Ctl-GFP المستحثة (n = 2)، أو CXCR4-GFP المستحثة (n = 2) الخلايا B-1 التي هاجرت نحو CXCL12 كنسبة مئوية من العدد الإجمالي للخلايا B-1 المحملة في طور العرض. (د)استراتيجية الجاتينغ التمثيلية للقياس الكمي للخلايا القابلة للحياة ضمن مجموعة الخلايا B المستحثة بنجاح (CD19+GFP+). (ه)تواتر الخلايا الحية ب بعد نقل مع Ctl-GFP (ن = 2) أو CXCR4-GFP الفيروس الرجعي (ن = 2). تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من منشورنا السابق4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استراتيجية الجاتينغ لفرز الخلايا المستحثة GFP+ B-1a. قطع السيتوتوميت التدفقية التمثيلية لفرز خلايا GFP+ أو GFP-B-1a من عينة غير مرسلة (أعلى) وعينة محولة من Ctl-GFP (وسط) وعينة محولة CXCR4-GFP (أسفل). B-1a الخلايا المعرفة بأنها حية، مفردة، CD19+ CD23- IgM + CD5+ الخلايا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: القياس الكمي للخلايا المانحة المنقولة. قطع السيتومترية العرض ية للتدفق التمثيلي عرض CD45.1+ CD45.2- الخلايا المانحة من عنصر تحكم PBS واحد (أعلى)، واحد Ctl-GFP + B-1a المتلقي الخلية (الأوسط)، وواحد CXCR4-GFP + B-1a المتلقي الخلية (أسفل)، والتحليل اللاحق للتعبير CXCR4 على الخلايا المانحة في نخاع العظام(أ)،أو الطحال(ب). القياس الكمي للتعبير CXCR4 (متوسط شدة الفلورسال، MFI) على الخلايا المانحة من نخاع العظام(ج)أو الطحال(د). قياس عدد الخلايا المانحة التي تم استردادها في نخاع العظم(ه)أو الطحال(و)من المتلقين. *P < 0.05 أو **P < 0.01 بواسطة اختبار مان ويتني. تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SEM. تم تعديل هذا الرقم من منشورنا السابق4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوة البروتوكول | جسم | التركيز النهائي |
| الخطوة 1-8 | Ter119 البيوتين | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي |
| CD3e البيوتين | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| Gr-1 البيوتين | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| CD23 البيوتين | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| NK1.1 البيوتين | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| F4/80 البيوتين | 2.5 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| جسم | التركيز النهائي | |
| الخطوة 4.5 | CD5 PE | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي |
| IgM PECF594 | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| CD23 PECy7 | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| B220 APC | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| CD19 APCef780 | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| جسم | التركيز النهائي | |
| الخطوة 6-1 | CD45.1 PerCP Cy5.5 | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي |
| CD45.2 BV421 | 1 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي | |
| CXCR4 APC | 2.5 ميكرولتر لكل 100 ميكرولتر الحجم النهائي |
الجدول 1: الأجسام المضادة وتركيزاتها النهائية المستخدمة في البروتوكول.
| حاله | %GFP+ من إجمالي السكان | %GFP+ من خلايا CD19+ B |
| 96 بئر مستديرة أسفل لوحة | 30.9% | 52.7% |
| 24-جيدا لوحة | 8.4% | 21.2% |
| 6-جيدا لوحة | 16.2% | 27.3% |
الجدول 2: لوحة الأمثل. تردد بنجاح الخلايا الإجمالية GFP + أو GFP + CD19 + B الخلايا بعد نقل 6 × 106 خلايا الصفاق B-1 المخصب في إما لوحة مستديرة القاع 96 بئرا (40 بئرا في 150،0 00 خلية لكل بئر)، لوحة 24 بئر (6 آبار في 1 × 106 خلايا لكل بئر)، أو لوحة 6 بئر (3 آبار في 2 × 106 خلايا لكل بئر) في 20:1 وزارة الداخلية مع فيروس Ctl-GFP الرجعية.
| متغير | MFI من CXCR4 على الخلايا B-1a المانحة | |
| r-القيمة | ع-القيمة | |
| # من الخلايا B-1a المانحة في نخاع العظام | 0.71 | *0.014 |
| # من الخلايا B-1a المانحة في الطحال | 0.43 | 0.18 |
الجدول 3: الارتباط بين تعبير CXCR4 على الخلايا المانحة وتوطين الخلايا المانحة. متوسط شدة الفلورسان (MFI) من CXCR4 على الخلايا B-1a المانحة المرتبطة بعدد الخلايا B-1a المانحة في نخاع العظام أو الطحال من Rag1-/- ApoE-/- الفئران المتلقية 17 أسابيع بعد نقل بالتبني. البيانات المقدمة كمعامل ارتباط (ص) وأهمية إحصائية (ع). تم تعديل هذا الجدول من المنشور السابق4.
| متغير | # من الخلايا المانحة في نخاع العظام | |
| r-القيمة | ع-القيمة | |
| البلازما المضادة MDA-LDL IgM | 0.67 | *0.028 |
| البلازما E06/T15 IgM | 0.56 | 0.076 |
| البلازما 1,3-dextran IgM | 0.29 | 0.39 |
الجدول 4: الارتباط بين توطين الخلايا المانحة وكمية البلازما من مضادات OSE IgM. عدد الخلايا B-1a المانحة في نخاع العظم من Rag1-/- ApoE-/- الفئران المتلقية 17 أسابيع بعد نقل بالتبني ترتبط مع كمية متداولة من مكافحة MDA-LDL IgM، E06/T15 IgM، أو المضادة ل1،3-dextran IgM. البيانات المقدمة كمعامل ارتباط (ص) وأهمية إحصائية (ع). تم تعديل هذا الجدول من المنشور السابق4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المقدمة هنا تمكن مستقرة وفعالة نسبيا الأولية B-1a تسليم الجينات الخلية، في نقل العضوية على جهاز الحي، وتحديد وتوطين الخلايا المحقونة. وتمكنت الخلايا من الكشف عن 17 أسبوعا ً من نقل هاون الخلية واحتفظت بزيادة تعبير CXCR4. أدى التسليم بوساطة الفيروسات الرجعية 30-40٪ كفاءة نقل الخلايا الأولية B-1a مع الحد الأدنى من التأثير على قدرة الخلية على البقاء في أيدينا(الشكل 4e). وهذا يتماشى مع نتائج دراسة سابقة أجراها موهيمى وزملاؤه وقارنت تقنيات نقل الجينات إلى خلايا المورين الأولية ب بما في ذلك العدوى المضادة للفيروسات الرجعية، أو العدوى الأدينوفيروسات، أو النيوكليوفيكتيون، أو الليفلكتومين15. ومع ذلك ، وجدنا أن نطاق التعبير المفرط CXCR4 اختلف إلى حد كبير داخل المستلمين الذين يتلقون خلايا CXCR4-GFP المستحثة B-1a(الشكل 6c، d). لذلك ، قمنا باستخدام التحليل النقابي لإثبات أن زيادة التعبير CXCR4 ترتبط بزيادة هجرة B-1a والتعريب إلى نخاع العظم ، والتي ترتبط بزيادة البلازما IgM(الجدول 3 والجدول 4).
وتشمل القيود المفروضة على هذه الطريقة العدد الكبير من الفئران اللازمة للحصول على أعداد كافية من الخلايا B-1a المنقولة بنجاح، والتباين في كفاءة النقل من تجربة إلى أخرى. يتم تحسين كفاءة نقل الاختزال عن طريق ارتفاع titers من المخزونات الفيروسية ، والتي ينبغي أن تكون على الأقل 2 × 107 جزيئات معدية / مل14. استخدام الفئران الأكبر سنا، الذين تتراوح أعمارهم بين 12-16 أسبوعا يمكن أيضا تحسين العائد الخلايا ب-1 الجبقية، كما زيادة أعداد الخلايا b-1 الجهوتي مع سن17.
من المهم أيضًا ملاحظة أن كمية IgM التي تفرزها خلايا B-1a المستحثة بعد النقل بالتبني كانت ~ 5 أضعاف أقل من المبلغ الذي تفرزه الخلايا B-1a غير المستحثة بعد النقل بالتبني إلى نفس Rag1-/- ApoE-/- نموذج (البيانات غير مبينة). قد يكون هذا بسبب متطلبات تنشيط الخلية B-1 مع ألمو 9 TLR9 قبل نقل الفيروس الرجعي(الشكل 3)، مما قد يحد من التنشيط الثانوي وإنتاج IgM استجابة لOSE في نقل الجسم الحي بعد التبني. لذلك ، بالنسبة للدراسات التي تتطلب إنتاج IgM القوي بواسطة خلايا B-1a المنقولة ، قد تكون تقنيات نقل الجينات البديلة التي لا تتطلب تنشيط الخلية B-1a السابقة ، مثل تسليم الفيروس18،19، مفيدة. وبدلاً من ذلك، قد تكون التعديلات التي أُدخلت على هذا البروتوكول وتشمل استراتيجيات التنشيط للحث على الانتشار ولكن ليس التمايز B-1a في الخلايا التي تفرز IgM كافية أيضًا لاستخدامها في نقل الفيروس الرجعي بنجاح دون التأثير على تنشيط الخلية B الثانوية. IL-5 هو التطفل السيتوكين هام B-1a انتشار الخلايا والبقاء على قيد الحياة، ويمكن أن يكون بديلا فعالا لتحفيز TLR920,,21.
وقد استخدمت الدراسات السابقة خلايا B الطحالمعزولة من خلال استراتيجيات الاختيار الإيجابي أو السلبي باستخدام الأجسام المضادة ضد B220 (علامة الخلية B) أو Thy1.2 (علامة الخلية T)13،14. ومع ذلك، B220+ خلايا B الطحال هي مجموعة سكانية غير متجانسة تحتوي على مجموعات فرعية خلية B-1 و B-2. وعلاوة على ذلك، فإن تردد الخلايا B-1 داخل إجمالي عدد خلايا CD19+ B منخفض (1-2٪ ). وعلى النقيض من ذلك، تستخدم هذه الطريقة التجويف الجهوية كمصدر للخلية B-1 للنقل، حيث تشكل خلايا B-1 60-70٪ من إجمالي خلايا CD19+ B في هذه المقصورة22، وتستخدم CD23 كعلامة لاستنفاد خلايا الجهوية B-2. الفرز اللاحق للخلايا B-1a المستحثة بنجاح استناداً إلى GFP و CD19 و B220 و CD23 و IgM و CD5 التعبير يسمح كذلك نقل نوع خلية محددة بشكل أكثر تحديداً. استراتيجية الاستنفاد المغناطيسي لإثراء خلايا b-1 الجهوية استنفدت بشكل فعال الخلايا التائية، وخفض F4/80 تردد الضامة الجهوية من قبل ~ 50٪ في أيدينا(الشكل 2)،على الرغم من مزيد من التحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه الخطوة الحرجة يمكن أن تزيد من كفاءة نقل. على سبيل المثال، باستخدام تركيز أعلى من الأجسام المضادة F4/80 التضمين بيولوجياً لتحسين استنفاد الضامة قد يزيد من كفاءة نقل الخلايا B-1a، حيث سيكون هناك أقل نقل الرجعية "خارج الهدف" لأنواع الخلايا الأخرى. استخدام لوحات 96 بئر مستديرة القاع لنقل, بدلا من مسطحة القاع 24 بئر أو 6-بئر لوحات بالإضافة إلى تحسين كفاءة نقل إلى حد كبير(الجدول 2),على الرغم من زيادة التعامل مع ووقت الأنابيب.
وعموماً، توفر هذه الطريقة نهجاً مفيداً لإثبات المفهوم لتحديد ما إذا كان تسليم الجينات المستهدفة إلى خلايا B-1a يمكن أن يغير توطين الخلايا B-1a وإنتاج IgM الوظيفي. التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية يمكن أن تشمل على سبيل اللّفة على سبيل الإنشاءات التي تستهدف البروتينات الأخرى، ونقل اعتمادي لتحديد تأثيرها على عمليات الخلايا المانحة أو المضيفة في الجسم الحي، بما في ذلك بقاء الخلية، الهجرة، الانتشار، أو الوظيفة. نقل بالتبني إلى المضيفين المناعة، بدلا من المضيفين نقص الخلايا الليمفاوية، سيكون من الممكن أيضا مع هذه التقنية منذ الخلايا المانحة (CD45.1 + GFP+) يمكن أن تختلف عن الخلايا المضيفة (CD45.2 + GFP-). استهداف مستقبلات العلاج الكيميائي الأخرى باستخدام هذه الطريقة يمكن أن تدعم فرضية أن استهداف هجرة الخلايا B-1a نحو منافذ متساهلة من إنتاج IgM عالية يمكن أن تعزز بشكل فعال مستويات IgM واقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل 1R01 HL107490 ، 1R01 HL136098 ، المشروع 3 من P01 HL055798 ، P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) ، وR01GM100776 (T.P. Bender). أ. بدعم من جمعية القلب الأمريكية قبل الدكتوراه زمالة 16PRE30300002 و 5T32AI007496-20. نشكر جوان لاننيغان، مايك سولغا، وكلود تشو من جامعة فرجينيا تدفق القلب للخلايا على مساعدتهم التقنية الممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
References
- Baumgarth, N. B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production. Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location. Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).
- Prohaska, T. A., et al. Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies. Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).
- Upadhye, A., et al. Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis. Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).
- Yang, Y., et al. Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires. Elife. 4, 09083 (2015).
- Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM. European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).
- Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells. European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).
- Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12. Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).
- Wang, H., et al. Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).
- Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).
- Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes. Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells. Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).
- Lin, K. I., Calame, K. Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors. Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).
- Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).
- DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors. Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).
- Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age. The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).
- Laurie, K. L., et al. Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector. Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).
- Warncke, M., et al. Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors. Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).
- Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production. Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).
- Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response. Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).
- Baumgarth, N. The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions. Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).
