Summary
Denne metoden bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å forstå metabolske prosesser i S. alba blader når de utsettes for xenobiotika. Metoden tillater romlig lokalisering av forbindelser av interesse og deres predikerte metabolitter innenfor spesifikke, intakte vev.
Abstract
Metoden som presenteres bruker massespektrometriavbildning (MSI) for å etablere den metabolske profilen til S. alba blader når den utsettes for xenobiotika. Ved hjelp av en ikke-målrettet tilnærming identifiseres og lokaliseres plantemetabolitter og xenobiotika av interesse i plantevev for å avdekke spesifikke distribusjonsmønstre. Deretter, i silico prediksjon av potensielle metabolitter (dvs. katabolitter og konjugater) fra identifiserte xenobiotika utføres. Når en xenobiotisk metabolitt ligger i vevet, registreres typen enzym som er involvert i plantens endring. Disse resultatene ble brukt til å beskrive ulike typer biologiske reaksjoner som forekommer i S. alba blader som svar på xenobiotisk akkumulering i bladene. Metabolittene ble spådd i to generasjoner, slik at dokumentasjonen av påfølgende biologiske reaksjoner kunne transformere xenobiotika i bladvevet.
Introduction
Xenobiotics er utbredt over hele verden på grunn av menneskelige aktiviteter. Noen av disse forbindelsene er vannløselige og absorberes av jord1, og går inn i næringskjeden når de akkumuleres i plantevev2,3,4. Plantene spises av insekter og plantelevende dyr, som er byttedyr til andre organismer. Inntaket av noen xenobiotika og deres innvirkning på plantens helse har blitt beskrevet5,6,7,8, men bare nylig på vevsnivå9. Derfor er det fortsatt uklart hvor eller hvordan metabolismen av xenobiotika oppstår, eller om spesifikke plantemetabolitter er korrelert med xenobiotisk akkumulering i bestemte vev10. Videre har de fleste undersøkelser oversett metabolismen av xenobiotika og deres metabolitter i planter, så lite er kjent om disse reaksjonene i plantevev.
Foreslått her er en metode for å undersøke enzymatiske reaksjoner i biologiske prøver som kan knyttes til vev lokalisering av substrater og produkter av reaksjonene. Metoden kan tegne den komplette metabolske profilen til en biologisk prøve i ett eksperiment, da analysen er ikke-målrettet og kan undersøkes ved hjelp av tilpassede lister over analytter av interesse. Angitt er en liste over kandidater som spores i det opprinnelige datasettet. Hvis en eller flere analytter av interesse er notert i prøven, kan den spesifikke vevslokaliseringen gi viktig informasjon om de relaterte biologiske prosessene. Analyttene av interesse kan deretter endres i silico ved hjelp av relevante biologiske lover for å søke etter mulige produkter / metabolitter. Listen over metabolitter oppnådd brukes deretter til å analysere de opprinnelige dataene ved å identifisere enzymene som er involvert og lokalisere reaksjonene i vevet, og dermed bidra til å forstå de forekommende metabolske prosessene. Ingen annen metode gir informasjon om hvilke typer reaksjoner som forekommer i de biologiske prøvene, lokalisering av forbindelsene av interesse og deres relaterte metabolitter. Denne metoden kan brukes på alle typer biologisk materiale når friske og intakte vev er tilgjengelige og forbindelsene av interesse kan ioniseres. Den foreslåtte protokollen ble publisert i Villette et al.12 og er detaljert her for bruk av det vitenskapelige samfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvepreparering
- Ta tak i den biologiske prøven og hold den frisk og intakt (f.eks. ikke tving den inn i et rør) eller frys den. Den foreslåtte protokollen gjelder for alle typer faste biologiske prøver (dvs. plante,dyr eller humant vev) for å lokalisere forbindelser i spesifikt vev.
- Avkjøl en kryokrotom til -20 °C. Oppbevar prøveholderen og bladet ved samme temperatur.
- Bygg om nødvendig inn objektet i M1-innebyggingsmediet for å bevare det under kutting.
- Hell litt matrise i en plastform plassert i kryokrotomkammeret. Legg raskt til prøven og hell litt mer innebyggingsmedium for å dekke det. Oppretthold prøven i midten av formen når matrisen størkner under nedkjøling.
MERK: Innebygging er ikke nødvendig for alle biologiske gjenstander. Homogene objekter som musehjerner trenger ikke innebyggingsmedium og kan kuttes frosset.
- Hell litt matrise i en plastform plassert i kryokrotomkammeret. Legg raskt til prøven og hell litt mer innebyggingsmedium for å dekke det. Oppretthold prøven i midten av formen når matrisen størkner under nedkjøling.
- Plasser den innebygde eller frosne prøven på kryokrotomholderen og kutt den med et skarpt blad. En tykkelse på 5-30 μm er bra for planteprøver, som er vanskelige å kutte på grunn av deres heterogenitet. Tilpass skjæretykkelsen og temperaturen til prøven, og gjør flere kutt for å finne de beste forholdene. I eksemplet som ble gitt, ble prøven kuttet ved -20 °C. Vurder å holde prøven under 0 °C for å unngå prøveforringelse.
MERK: Bruk av et kikkertmikroskop plassert ved siden av kryokrotomet kan bidra til å bestemme kvaliteten på skivene. Vevet må forbli intakt. - Flytt forsiktig skiven til et ITO-belagt lysbilde ved hjelp av tang eller en liten pensel, og legg deretter en finger under lysbildet for å varme opp og tørke prøven. Hold gliden i kryokrotomkammeret til alle prøvene er klare. Ta sklien ut av kammeret sakte for å unngå varmesjokk.
MERK: For å sjekke hvilken side av lysbildet som er ITO-belagt, legg en dråpe vann på lysbildet ved romtemperatur (RT). Dråpen forblir rund på den ITO-belagte siden eller flater ut på den ubestrøkete siden. - Tegn merker på lysbildet med en tynn markørpenn eller korreksjonsvæske, og skann det med en skanner med høy oppløsning før matriseavsetning. Merkene brukes til å bestemme prøvens nøyaktige posisjon på lysbildet når det er i massespektrometeret. Den beste måten å oppnå nøyaktige referansepunkter på er å tegne et kryss.
2. Matrix avsetning
- Forbered MALDI-matrisen: vei 70 mg α-cyano-4-hydroksycinnamic acid (HCCA) matrise og fortynn den i 10 ml vann og metanoloppløsning (50:50) med 0,2% TFA. Soniker matrisen i 10 minutter på RT. Det kan være ekstra solid matrise etter sonikering.
MERK: Ulike typer MALDI-matriser kan brukes avhengig av analyttene av interesse. - Rengjør matriseavsetningsroboten med 100% metanol.
- Bruk metanol og en presisjonsserviett, rengjør lysbildet, hold prøvene uten å berøre dem og uten å fjerne merkene. Legg til et rent deksle over lysbildet i et område uten prøve. Den delen av lysbildet plasseres deretter over den optiske detektoren for å spore matriseavsetning.
MERK: For å spore matrisetykkelsen optisk, må gliden og dekslene være veldig rene. - Bruk roboten til matriseavsetning: Plasser bare 6 ml av matriseløsningen i reservoaret, og tilsett 2 ml 100% metanol for et totalt volum på 8 ml.
MERK: Opptak av matrisetykkelse langs avsetning er automatisk og kan gjenopprettes ved hjelp av en USB-pinne. Utviklingen av en sprøytemetode er ikke detaljert her.
3. Datainnsamling
- Plasser 1 μL av matrisen på en MALDI-plate for å kalibrere massespektrometeret ved hjelp av matrisetoppene som referanser. Utviklingen av en oppkjøpsmetode på massespektrometeret er ikke detaljert her.
- Sett inn MALDI-platen i kilden, klikk "Last inn mål" i ftmsControl programvare, og vent til platen skal lastes.
- Velg plasseringen av matrisestedet ved å klikke på stedet i bildet som representerer MALDI-platen.
- Angi eksempelnavnet og mappen i kategorienEksempelinformasjoni programvaren.
- Start anskaffelsen ved å klikkepå Anskaffelse.
- Flytt platen litt under oppkjøpet ved hjelp av musepekeren på kategorien" MALDI-video" slik at laseren peker på forskjellige steder.
- Når anskaffelsen er fullført, går du til kategorienKalibrering, velger HCCA-kalibreringslisten i kvadratisk modus og klikker Automatisk. Det globale kalibreringsresultatet er angitt i vinduet" Kalibreringsplott" og bør være mindre enn 0,2 ppm for en SolariX XR 7T.
- Hvis kalibreringen er god, klikker duGodtaog lagrer metoden.
- Når matriseavsetningen på prøvene er ferdig, plasserer du lysbildet i en lysbildeadapter og henter plasseringen av merkene ved hjelp av et plastdeksel.
- I flexImaging-programvare konfigurerer du en ny bildebehandlingskjøring ved hjelp av det første vinduet som åpnes med programvaren.
- Gi bildet et navn, velg resultatkatalogen, og klikk Neste.
- Angi rasterstørrelsen (dvs. brukerdefinert måleområde), velg metoden som skal brukes (kalibrert i avsnitt 3.1), og klikk Neste.
- Last inn det optiske bildet av lysbildet som ble oppnådd i trinn 1.6 etter at du har skannet lysbildet, og klikk Neste.
- Bildet åpnes i et bredere vindu. Bruk merkene på lysbildet til å lære plasseringen av lysbildene: i ftmsControl, plasser målet for MALDI-videovinduet på nøyaktig plasseringen av et merke, kom deretter tilbake til felxImaging og klikk på nøyaktig samme punkt på det optiske bildet. Gjenta dette for tre uavhengige punkter. Plastdekselet som bærer merkene er plassert på en MALDI-plate for å gjenopprette sin posisjon og lette undervisningen.
MERK: Hvis merkene ble laget med en markør, kan det å legge til hvit korreksjonsvæske på baksiden av lysbildet få dem til å skille seg ut under undervisningen.
- Tegn områdene av interesse i eksemplene i flexImaging -programvaren ved hjelp av verktøyeneLegg til måleområder.
- Lagre bildebehandlingskjøringen og enAutoXecute Sequencehvis flere prøver skal analyseres.
- Start en sekvens ved hjelp av"AutoXecute Batch Runner" hvis flere prøver analyseres.
MERK: Synkroniser dataene regelmessig til et sikkert sted.
4. Databehandling
- Importer rådataene til visualiseringsprogramvaren (SCiLS Lab) og opprett et datasett. Dette gjøres i to separate trinn i denne programvaren.
- Bruk verktøyet"Batch Importer"og velg rådata, angi målkatalogen, og klikk på "Importer".
- Etter import kan flere datasett kombineres for videre analyse. Hvis du vil kombinere datasett, bruker dufilen| Nytt| Datasett- verktøy.
- Velg hvilken type instrument som skal brukes til anskaffelse, legg til de importerte datasettene ved å klikke "+", og ordne bildene ved å klikke og dra objektene.
- Kontroller masseområdeinnstillingene eller endre om nødvendig ved å angi interesseområdet. Klikk Neste for å se importsammendraget og starte importen.
- Visualiser m/z av interesse for de forskjellige vevene i en prøve og/eller i forskjellige prøver. Bare klikk på spektra for å velge m / z av interesse eller skriv inn verdien i m / z -boksen.
- Utfør statistiske tester om nødvendig for å søke etter colokaliserte eller diskriminerende verdier mellom forskjellige vev og / eller forskjellige prøver for å bestemme m / z av interesse. Verktøyene er tilgjengelige påVerktøy -menyenog vil ikke bli beskrevet i denne protokollen.
- Eksporter m/z av interesse (f.eks. colokaliserte, diskriminerende forbindelser) som en .csv fil fra Objekt-fanen. Hele datasettet kan også eksporteres hvis det ikke er for stort (dvs. maksimalt 60 000 linjer). Klikk på"Eksporter" -ikonet på høyre side av interesseområdet angitt med en rød pil.
- Importer den .csv filen for å opprette et nytt datasett i merknadsprogramvaren (Metaboscape). Klikk på "Prosjekter | Importer CSV-prosjekt. Vær oppmerksom på at bare den eksakte m / z vil bli vurdert, og den isotopiske profilen går tapt.
MERK: 5.0-programvareversjonen tillater direkte import av data fra visualiseringsprogramvaren, noe som muliggjør en mer nøyaktig merknad, fordi den isotopiske profilen kan vurderes. - Kommenter med skreddersydde analyttlister, som kan avledes fra offentlig tilgjengelige databaser. En mal er gitt av programvaren for å lage analyttlister.
- Bruk prediksjon programvare (Metabolite Predict) å utføre i silico prediksjon av metabolitter av de kommenterte forbindelser. Den utviklede formelen av forbindelsen av interesse er nødvendig, enten trukket av brukeren i programvaren eller importert som en .mol-fil. Da er metoden en enkel trinnvis protokoll.
- Gjenopprett listen over metabolitter, lag en analyttliste, og bruk den i merknadsprogramvaren for å kommentere rådataene med predikerte metabolitter. Alternativt, hvis listen over metabolitter er kort, kan du manuelt søke etter den i trinn 4.8.
- Visualiser vevsfordelingen av metabolittene i rådataene i visualiseringsprogramvaren.
- Gjenopprett navnene på enzymene som er involvert i metabolske prosesser i prediksjonsprogramvaren ved å høyreklikke på den anslåtte metabolitten av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen ble brukt på friske blader samplet fra et S. alba-tre utsatt for xenobiotika i miljøet. Prosessen er avbildet i figur 1. Det første trinnet er å forberede tynne skiver av utvalget av interesse. Planteprøver er ofte vanskeligere å kutte enn dyreprøver, da vevet er heterogent og kan inneholde vann og / eller luft. Denne vanskeligheten håndteres ved hjelp av innebyggingsmedium, som danner en homogen blokk rundt prøven. Matriseavsetningen forenkles ved bruk av en robot, unngår håndmanipulering og sikre reproduserbare resultater. Maldivens matriselagtykkelse følges under hele prosessen og kan registreres. Datainnsamling krever læring for å håndtere et høyoppløselig massespektrometer og tilpasse metoden til typen prøver og forbindelser som undersøkes. Rådata importeres til en visualiseringsprogramvare for å søke etter forbindelsene av interesse og vise vevslokaliseringen. Diskriminerende eller colokaliserte forbindelser kan bli funnet ved hjelp av statistiske verktøy tilgjengelig i programvaren. På dette trinnet er bare den eksakte m / z av forbindelsene kjent. Forbindelsene av interesse eksporteres deretter til merknadsprogramvaren, som kan sammenligne den eksakte m / z med en tilpasset liste over forbindelser av interesse definert av brukeren. Hvis den nøyaktige m/z samsvarer med m/z for en sammensetning av interesse, kommenteres den. I sammenheng med en metabolsk profilundersøkelse er de kommenterte forbindelsene valgt for i silico prediksjon av metabolitter. Typer av biologiske reaksjonsregler som brukes til å generere metabolitter er lett valgt av brukeren, samt antall generasjoner som metabolittene er spådd. Listen over predikerte metabolitter kan brukes i merknadsprogramvaren til å søke etter treff mellom rådata nøyaktig m/z og predikerte metabolitter m/z (figur 1). De kommenterte metabolittene kan søkes etter i visualiseringsprogramvaren for å få vevslokalisering (figur 2). Enzymene som er involvert i metabolismen av de opprinnelige forbindelsene av interesse, kan gjenopprettes for å trekke metabolske reaksjoner som forekommer i den biologiske prøven (Figur 3).
I dette eksemplet ble stoffet telmisartan identifisert i plantebladene; den ble fordelt over hele vevet. Telmisartans metabolitter ble spådd og søkt etter i rådataene. Merknadene viste at en førstegenerasjons (I) metabolitt ble påvist i bladenes indre vev og ytterligere degradert til andre generasjons (II) metabolitter, som ble lokalisert i indre vev eller var mer generelt fordelt i alle bladvev (Figur 2). Disse resultatene antyder en aktiv metabolsk reaksjon i bladene for å forringe telmisartan. Prosessen ble brukt på flere forbindelser av interesse kommentert i bladene, og enzymene som var involvert i reaksjonene ble gjenopprettet for å undersøke deres rolle i plantens respons på xenobiotika akkumulering. Dette gir en oversikt over enzymene som er involvert i xenobiotika metabolisme i S. alba blader (Figur 3).
Figur 1. Generell struktur av metoden. En fersk prøve kuttes og plasseres på en ITO-belagt lysbilde sprayet med riktig MALDI-matrise. MALDI-oppkjøpet gir rådata som lokaliseringen i vevet kan observeres med SCiLS Lab-programvaren. Metaboscape brukes til merknad, og Metabolite Predict brukes til metabolitt (dvs. katabolitter og konjugater) prediksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Eksempel på resultatene oppnådd på S. alba blader utsatt for xenobiotika. Telmisartan ble identifisert i plantebladene og visualisert i alle vevene. Telmisartan metabolitter ble spådd og kommentert på rådata for å visualisere vev lokalisering. Første generasjons (I) metabolitt C33H32N4O3 ble lokalisert hovedsakelig i det indre vevet, mens andre generasjons (II) metabolitter noen ganger var mer generelt fordelt. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Villette et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Global enzymatisk profil foreslått for potensielle reaksjoner som forekommer i S. alba blader som svar på xenobiotika eksponering. Metabolittens prediksjon og merknad på gjenstanden av interesse foreslo de potensielle enzymatiske reaksjonene som er ansvarlige for metabolismen av interesseforbindelsen. Denne figuren ble tilpasset med tillatelse fra Villette et al.12. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kritiske delen av denne protokollen er prøveforberedelsene: prøven må være myk og intakt. Kutting er den vanskeligste delen, da temperaturen og tykkelsen på prøven kan variere avhengig av hvilken type prøve som studeres. Dyrevev er vanligvis homogene og lettere å kutte. Planteprøver inneholder ofte forskjellige strukturer og er derfor vanskeligere å holde intakt når bladet møter mykt, hardt eller tomt vaskulært vev. Det anbefales på det sterkeste å bruke friskt vev når du arbeider med planteprøver for å unngå dannelse av is i hydrofile vev og ødeleggelse. Skivene må flyttes forsiktig når de legges på den ITO-belagte sklien. MALDI-matrisen ble litt fortynnet for å unngå tilstopping av sprøytearket med matrisekrystaller, noe som kan skje hvis 2 ml 100% metanol ikke tilsettes i trinn 2.4.
Denne metoden tilbyr en enkel en-dagers prøveforberedelsesprotokoll som gir reproduserbare resultater på grunn av bruk av en robot for maldivmatriseavsetning. Den foreslåtte protokollen krever kompetanse innen vevsskjæring og massespektrometriavbildning og gjelder bare forbindelser som kan ioniseres. Det gir imidlertid molekylær identifikasjon uten behov for merking som brukes i immunhiistokjemi11. Høy følsomhet oppnås fordi forbindelsene er direkte ionisert i vev eller celler, og unngår fortynningseffekter produsert av en ekstraksjonsprotokoll12. Prøvene analyseres på en ikke-målrettet måte, noe som gir mulighet for en storskala profilering av endogene eller xenobiotikaforbindelsene i prøvene. Derfor kan biologiske responser på eksogene forbindelser følges. Den i silico prediksjon av metabolitter koblet til ikke-målrettet analyse legger til en annen dimensjon til klassisk massespektrometri avbildning, fordi metabolske reaksjoner kan overvåkes uten forkunnskaper om de eksogene forbindelsene som vil akkumuleres i vevet. Til dags dato har bare kjente forbindelser og noen få metabolitter blitt fulgt med denne metoden (f.eks. legemidler av interesse matet til rotter)13. Med den foreslåtte protokollen kan de opprinnelige forbindelsene og deres metabolitter lokaliseres i vevet, og de biologiske responsene på opphopning av eksogene forbindelser og / eller deres metabolitter kan følges.
Denne protokollen gjelder ikke bare plantens respons på xenobiotika, men kan også brukes til å forstå dyremetabolismen som respons på narkotika, for å følge plante / soppinteraksjoner, planterespons på biotiske eller abiotiske påkjenninger, eller for å forstå utviklingen av sykdommer, avsløre metabolske prosesser i vev av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue og Régis Lavigne for deres tips og triks angående prøvepreparering for MALDI-avbildning av planteprøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
