Articolo metodologico

Isolamento dei tessuti del sistema nervoso centrale e delle meningi associate per l'analisi a valle delle cellule immunitarie

DOI:

10.3791/61166

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19 maggio 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

In questo articolo

Sommario

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Questo documento presenta due protocolli ottimizzati per l'esame delle cellule immunitarie residenti e di derivazione periferica all'interno del sistema nervoso centrale, tra cui il cervello, il midollo spinale e le meningi. Ognuno di questi protocolli aiuta ad accertare la funzione e la composizione delle cellule che occupano questi compartimenti in condizioni stazionarie e infiammatorie.

Abstract

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Il sistema nervoso centrale (SNC) è composto dal cervello e dal midollo spinale ed è avvolto dalle meningi, strati membranosi che fungono da barriera tra la periferia e il SNC. Il sistema nervoso centrale è un sito immunologicamente specializzato e, in condizioni di stato stazionario, il privilegio immunitario è più evidente nel parenchima del sistema nervoso centrale. Al contrario, le meningi ospitano una vasta gamma di cellule residenti, comprese le cellule immunitarie innate e adattative. Durante le condizioni infiammatorie innescate da lesioni del sistema nervoso centrale, autoimmunità, infezioni o persino neurodegenerazione, le cellule immunitarie di derivazione periferica possono entrare nel parenchima e risiedere all'interno delle meningi. Si ritiene che queste cellule svolgano azioni sia benefiche che dannose durante la patogenesi della malattia del SNC. Nonostante questa conoscenza, le meningi sono spesso trascurate quando si analizza il compartimento del SNC, perché i metodi convenzionali di estrazione del tessuto del SNC omettono gli strati meningei. Questo protocollo presenta due metodi distinti per l'isolamento rapido dei tessuti murini del SNC (cioè cervello, midollo spinale e meningi) che sono adatti per l'analisi a valle tramite tecniche a singola cellula, immunoistochimica e metodi di ibridazione in situ. I metodi descritti forniscono un'analisi completa dei tessuti del SNC, ideale per valutare il fenotipo, la funzione e la localizzazione delle cellule che occupano il compartimento del SNC in condizioni omeostatiche e durante la patogenesi della malattia.

Introduzione

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Il sistema nervoso centrale (SNC) è una sede immunologicamente specializzata. Il parenchima del SNC, escludendo lo spazio del liquido cerebrospinale, le meningi e la vascolarizzazione, è classicamente visto come un sito immuno-privilegiato 1,2,3,4,5 ed è relativamente privo di cellule immunitarie durante le condizioni omeostatiche 2,6,7. Al contrario, le meningi, che comprendono gli strati dura, aracnoideo e pia, s....

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Protocollo

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Tutto il lavoro sugli animali utilizza protocolli esaminati e approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Geisel School of Medicine di Dartmouth.

1. Elaborazione di campioni di cervello e midollo spinale per la decalcificazione

  1. Isolamento di campioni di cervello e midollo spinale
    1. Eutanasia il topo tramite inalazione di CO2 . Assicurarsi che la portata di CO2 sposti il 10%-30% del volume della gabbia al minuto.
    2. Usando una pinza, solleva il processo xifoideo e taglia la parete addominale lateralmente appena sotto la gabbia toracica con le for....

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Risultati

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Questo esperimento rappresentativo aveva lo scopo di quantificare le cellule B e T e descrivere la localizzazione delle cellule B e T nei compartimenti meningeo e parenchimale del SNC in condizioni omeostatiche e in un modello murino di SM progressiva (i.e., TMEV-IDD). TMEV-IDD è stato indotto in topi SJL femmine di 5 settimane da infezione intracranica con 5 x 106 unità formanti placca (PFU) di TMEV BeAn come descrittoin precedenza 29.

Il presente studio ha .......

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Discussione

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I metodi per valutare la composizione cellulare nel compartimento del SNC durante l'omeostasi e la malattia sono essenziali per comprendere gli stati fisiologici e patologici del SNC. Tuttavia, nonostante fungano da importante barriera nel sistema nervoso centrale e ospitino una vasta gamma di cellule immunitarie, le meningi sono spesso omesse dall'analisi perché molti metodi convenzionali di estrazione dei tessuti per il cervello e il midollo spinale non consentono la raccolta di queste membrane. Questa omissione è una .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il personale del Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) di Dartmouth per la loro cura esperta dei topi utilizzati per questi studi. Il Bornstein Research Fund ha finanziato questa ricerca.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio di alluminioqualsiasiN/A
Siero bovino AlbuminaThermoFisher Scientific37002D
CentrifugaBeckman CoulterAllegra X-12R Collagenase
IWorthingtonLS004196
Provetta conica, 15 mLVWR525-1069
Provetta conica, 50 mLVWR89039-658
Vetro di coperturaHauser Scientific5000
CryomoldVWR18000-128
Pinze curveFine Science Tools11003-14
Provetta monouso in polistirene, 14 mLFisher Scientific14-959-1B
Bisturi monousoFisher ScientificNC0595256
DNAse IWorthingtonLS002139
Ghiaccio seccoAirgas N/A
Durmont #7ForcepsFine Science Tools11271-30
EDTA sale disodico diidratoAmresco0105-500g
Etanolo, 100%qualsiasi N/A
Siero fetale bovino (FBS)HycloneSH30910.03
Tubo orizzontale filtrante, 5 mLVWR352235
Colorazione di vitalità fissabile 780Becton Dickinson565388
Citometro a flussoBeckman CoulterGallios
GlucosioFisher ChemicalD16-500
IgG anti-topo di capra (488 coniugato)Jackson immunoresearch115-546-146
IgG anti-topo di capra (594 conjugate)Jackson immunoresearch115-586-146
Goat anti-rabbit 488Jackson immunoresearch111-545-144
Goat anti-rat 594Jackson immunoresearch112-585-167
Goat anti-ratto 650Jackson immunoresearch112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)Corning21-020-CV
EmatocitometroAndwin Scientific02-671-51B
EmostaticoFine Science Tools13004-14
HEPES (N-2-idrossietilpiperazina-N-2-acido solfonico)ThermoFisher Scientific15630080
KClFisher chimicoBP366-500
KH2PO4 (anidro)Sigma AldrichP5655-100G
Azoto liquidoAirgasN/A
Blocco FC per topi (CD16/32)Becton Dickinson553141
Na2HP04 (anidro)Fisher ChemicalS374-500
NaClFisher chemicalS671-500
Ago, 25 gaugeBecton Dickinson305122
Siero di topo normaleThermoFisher Scientific31881
Filtro a rete in nylonVWR352350
OCTSakura4583
Paraformaldeide, 20%Microscopia elettronica Sciences15713-SDiluito al 4% utilizzando 1 x pipetta
PBS Pasteur, 9 pollici, scollegataFisher Scientific13-678-20C
PBS (1x)Corning21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4Becton Dickinson553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19Becton Dickinson562329
Percoll densità gradiente mediaGE healthcare17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45Becton Dickinson550994
Piastra di Petri, 100 mmVWR353003
pHmetroFisher Scientific13-636-AB150
Pipet-AidDrummond Scientific Corporation4-000-101
Pipetta 200 &; lGilsonFA10005M
Puntali per pipette, 1 mLUSA Scientific1111-2831
Puntali per pipette, 200 & micro; lUSA Scientific1111-1816
Pipetta, 1 mLGilsonFA10006M
Prolong Diamond mountant con DAPIThermoFisher ScientificP36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32Becton Dickinson553141
Rabbit anti-mouse CD3 (clone SP7)Abcamab16669
Coniglio anti-topo lamininaAbcamab11575
Tubo sierologico anti-topo per ratto ERT-R7Abcamab51824
RPMI 1640Corning10-040-CV
, 1 mLVWR357521
Pipetta sierologica, 10 mLVWR357551
Pipetta sierologica, 5 mLVWR357543
Idrossido disodioFisher ScientificS318-100
SaccarosioFisher chemicalS5-500
Forbici chirurgicheFine Science Tools14001-16
Forbici chirurgiche, extra fineRobozRS-5882
Siringa, 10 mLBecton Dickinson302995
Siringa, 5 mLBecton Dickinson309646
Trypan blueGibco15250-061
Sistema di filtraggio sottovuotoMillipore20207749
Pallone sottovuotoThomas Scientific5340-2L
Filtro in linea sottovuotoPall Corporation4402
Linea vuotoColePalmer EW-06414-20
BagnomariaThermoFisher ScientificVersa bagno

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492(2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Review....

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Isolamento delle meningiestrazione del tessuto cerebraleestrazione del midollo spinaleanalisi di singola cellulametodi di immunoistochimicaibridazione in situtrattamento con collagenasicentrifugazione a gradiente di densitgating CD45

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