Imaging e analisi delle lesioni dell'aorta intera O-macchiata di olio rosso in un modello murino di iperlipidemia da aneurisma

La malattia coronarica, una delle principali cause di mortalità negli Stati Uniti, è solitamente causata dall'aterosclerosi, un processo che porta all'accumulo di placca all'interno delle pareti arteriose1. I topi con deficit di Apoe e Ldlr soggetti a iperlipidemia sono fondamentali per le indagini sull'aterosclerosi e le sue complicanze e lo sviluppo di terapie2,3,4,5. La quantificazione delle lesioni aterosclerotiche da un'aorta en face è un'importante analisi finale per valutare l'impatto della manipolazione genetica in diversi tipi di cellule. Aiuta anche a studiare nuove terapie progettate per influenzare l'inizio, la progressione e la regressione della malattia aterosclerotica. Le lesioni aterosclerotiche possono formarsi ovunque nell'aorta e nei suoi rami (cioè arterie brachiocefale, carotidi e succlavia nel torace, nonché arterie renali, iliache e femorali comuni sotto il diaframma)⁶. Una valutazione completa del carico di aterosclerosi e una terapia appropriata richiedono una valutazione del carico di malattia in diverse località, una sfida che viene spesso trascurata.

Questo protocollo descrive come eseguire un'analisi completa delle lesioni aterosclerotiche, iniziando con un'aorta intera non aperta e procedendo alla preparazione del viso, in un singolo topo. La colorazione Red O dell'olio di aorta intera non aperta consente una valutazione rapida e qualitativa delle placche cariche di lipidi nell'intera aorta e nei suoi rami, mentre la preparazione del viso fornisce una valutazione quantitativa della distribuzione della lesione aterosclerotica nell'aorta del topo.

La tecnica utilizza topi di 8 settimane con una delezione TGFβR2 specifica per le cellule muscolari lisce sullo sfondo iperlipidemico Apoe^-/- (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; di seguito ^{denominati topi TGFβR2iSMC-Apoe}) e controlli Apoe^-/- littermate (MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/-; di seguito denominati Apoe^-/- topi). Gli animali sono tenuti per 16 settimane con una dieta ricca di colesterolo alto contenuto di grassi (HCHFD) come materiali di ^studio7. Al termine dello studio, le aorte intere non aperte vengono macchiate e fotografate (compresi tutti i rami principali) con Oil Red O per la valutazione qualitativa delle placche cariche di lipidi. Le aorte vengono aperte attraverso la preparazione del viso e tutte le lesioni aterosclerotiche vengono visualizzate e quantificate. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare lo sviluppo della lesione aterosclerotica in modelli di topi iperlipidemia Apoe^-/- o Ldlr^-/- ed esteso ad applicazioni di biologia vascolare generale correlate all'aorta.

I topi mT / mG (stock n. 007676) e Apoe^-/- (stock n. 002052) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory. I topi Myh11-CreERT2 sono stati un regalo di Stefan Offermanns (disponibile presso il Jackson Laboratory come stock n. 019079). I topi Tgfbr2fl^/fl sono stati ottenuti da Harold L. Moses (Vanderbilt University). Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite utilizzando protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yale.

1. Topi

1. Produrre MYH11-CreERT2;mT/mGf^/f; Apoe^-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- topi come descritto in ^precedenza7. Alleva ceppi mutanti sullo sfondo C57BL / 6J per più di dieci generazioni.
   NOTA: La linea di topi Myh11-CreERT2 Cre fornisce un potente strumento per studiare il ruolo delle cellule muscolari lisce nell'omeostasi vascolare e nella patologia vascolare. L'allele Cre viene inserito nel cromosoma Y; quindi, i topi femmina non esprimono questo costrutto.

2. Genotipizzazione del topo, induzione del tamoxifene e alimentazione dietetica ricca di grassi ad alto contenuto di colesterolo

1. Eseguire la genotipizzazione del topo utilizzando il DNA dell'orecchio del topo e l'analisi PCR. Il DNA dell'orecchio del topo deve essere isolato utilizzando il kit di isolamento del DNA del sangue e dei tessuti (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. I primer PCR sono elencati nella Tabella 1.
2. Indurre la ricombinazione di Cre-Lox mediante iniezione di tamoxifene a 1 mg/die i.p. per 5 giorni in MYH11-CreERT2 ^di 6 settimane;mT/mGf^/f; Apoe^-/- e MYH11-CreERT2; Tgfbr2f^/f;mT/mGf^/f; Apoe^-/- topi maschi.
3. Indurre l'aterosclerosi mettendo topi maschi di 8 settimane (2 settimane dopo il trattamento con tamoxifene) su una dieta HCHF (40% di grassi kcal, 1,25% di colesterolo, 0% di acido colico) per 16 settimane.

3. Reagenti e preparazione dello strumento di dissezione

1. Preparazione della soluzione Di Olio Rosso O: sciogliere 1 g di Olio Rosso O in 100 ml di alcool isopropilico.
2. Preparazione della soluzione Oil Red O di lavoro: mescolare 24 mL di soluzione Oil Red O stock con 16 mL di _dH2O. Filtrare l'Oil Red O diluito con filtri a siringa sterili da 0,45 μm (la soluzione è buona solo per 1-2 h).
3. Preparazione di alcol isopropilico al 60%: mescolare 60 ml di alcol isopropilico con 40 ml di _dH2O.
4. 4% di formaldeide in 1x preparazione DPBS: diluire 10 mL di formaldeide al 16% in 30 mL di 1x DPBS.
5. Pulire tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo (Figura 1).

4. Eutanasia (Figura 2A)

1. Misurare il peso del topo prima dell'eutanasia.
2. Eutanasia del topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina (ogni millilitro contiene 10 mg/mL di ketamina e 2 mg/mL di xilazina).
3. Posizionare il mouse in posizione supina (lato ventre rivolto verso l'alto).

5. Apertura della cavità toracica e addominale e perfusione cardiaca (Figura 2B)

1. Preparare una siringa da 10 mL con 10 mL di 1x DPBS. Cappuccio con ago da 25 G. La siringa sarà usata per lavare il cuore.
2. Sollevare la pelle con una pinzetta (Stile 5) e tagliare con forbici sottili dalla base dell'addome alla parte superiore del collo.
3. Aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica.
4. Sollevare lo sterno con una pinzetta (Stile 5) e tagliare il diaframma, quindi tagliare via la gabbia toracica per esporre la cavità toracica.
5. Fai una piccola incisione nell'atrio destro del cuore.
6. Perfondere attraverso la puntura ventricolare apicale sinistra iniettando lentamente 10 ml di 1x DPBS. Una volta completamente perfusi, il fegato e il rene diventano di colore marrone chiaro.
7. Pulire la cavità toracica di sangue e liquidi estranei utilizzando una spugna non tessuta per assorbire il materiale.

6. Isolamento dell'aorta e dei rami (Figura 2C)

1. Rimuovere gli organi (cioè polmone, fegato, milza e organi gastrointestinali e riproduttivi) e tagliare la clavicola usando una pinzetta (Stile 5) e forbici fini lasciando il cuore, il rene e l'aorta intatti in situ.
   NOTA: Assicurarsi di non lacerare il cuore o i principali vasi sanguigni.
2. Posizionare il mouse sotto uno stereomicroscopio.
3. Sezionare i rami dell'aorta e dell'aorta tra cui l'arteria brachiocefalica, le arterie carotidi, le arterie succlavia, le arterie renali, le arterie iliache comuni e le arterie femorali usando una pinzetta (Stile 4) e forbici a molla.
   NOTA: Coprire l'aorta con una spugna bagnata e non tessuta per evitare la disidratazione durante la dissezione dei rami dell'aorta.
4. Sezionare e rimuovere con cura il tessuto adiposo e connettivo avventiziale attorno ai rami dell'aorta e dell'aorta usando una pinzetta (Stile 4) e forbici a molla.
   NOTA: Poiché l'infiammazione è prominente nel topo iperlipidemia dell'aneurisma, è difficile rimuovere l'avventizia. Fai attenzione a non strappare o tagliare i rami dell'aorta e dell'aorta. Questo passaggio richiede pratica e pazienza.

7. Fissaggio del cuore e dell'aorta (Figura 2D, E)

1. Preparare una siringa da 10 mL con 10 mL di formaldeide al 4% in 1x di DPBS. Cappuccio con ago da 25 G.
   ATTENZIONE: La formaldeide è pericolosa. Leggere la MSDS prima di lavorare con questa sostanza chimica. Indossare guanti e occhiali di sicurezza e produrre le soluzioni di diluizione all'interno di una cappa aspirante.
   NOTA: la soluzione di formaldeide al 4% si degrada nel tempo. È importante utilizzare formaldeide al 4% appena fatta per la fissazione.
2. Fissare l'albero vascolare attraverso la puntura ventricolare apicale sinistra iniettando lentamente 10 ml di formaldeide al 4%.
   NOTA: la fissazione della formaldeide interferisce con diverse applicazioni a valle, come la coltura cellulare, l'analisi FACS e l'analisi del sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Saltare questo passaggio se l'aorta verrà utilizzata per una di queste applicazioni.
3. Pulire la cavità toracica di qualsiasi fluido estraneo con una spugna non tessuta per assorbire il materiale.
4. Separare il cuore dall'aorta tenendo il cuore con una pinzetta (Stile 4) e usando forbici a molla micro-dissezionanti.
   NOTA: Per eseguire la colorazione En face Oil Red O dopo questo passaggio, si consiglia di tagliare l'aorta aperta in situ anziché ex vivo e procedere al paragrafo 8. Questo rende facile per l'aorta en face di essere piatta.
5. Isolare e asportare l'aorta e la sua maggiore da 1 mm sopra l'arteria carotide fino all'estremità dell'arteria femorale usando una pinzetta (Stile 4) e forbici a molla.
6. Trasferire il recipiente in una capsula di Petri di cera o in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e riempire con 1x DPBS fino a coprire l'aorta.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.

8. Colorazione O rosso olio e imaging dell'aorta intera non aperta (Figura 3)

1. Fissare il recipiente su una capsula di Cera di Petri usando perni di minuzia (Figura 3A).
2. Risciacquare il recipiente una volta con 1x DPBS.
3. Versare 25 ml di soluzione fresca di Oil Red O nella capsula di Petri (Figura 3B).
   NOTA: (1) L'isopropanolo è pericoloso e un liquido infiammabile. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale. (2) La soluzione di Olio Rosso O può facilmente precipitare. Le particelle precipitate possono interferire con la successiva colorazione. È importante rimuovere il precipitato filtrando la soluzione oil red O attraverso un filtro da 0,45 μm prima dell'uso. (3) È meglio preparare la soluzione fresca di Oil Red O ed eliminare qualsiasi soluzione inutilizzata. (4) Oltre all'olio rosso O, Sudan IV è un altro composto chimico utilizzato per la colorazione di lipidi, trigliceridi e lipoproteine. Tuttavia, Oil Red O ha gradualmente sostituito Sudan IV perché il colore rosso prodotto da Oil Red O è più intenso e può quindi rendere il grasso molto più facile da vedere.
4. Macchiare l'aorta per 60 minuti a temperatura ambiente (RT). Oil Red O macchia la placca ricca di lipidi di rosso, lasciando altre aree non contenenti placca di colore pallido.
5. Lavare una volta per 20 minuti con il 60% di isopropanolo a RT.
   NOTA: il risciacquo eccessivo può rimuovere la placca.
6. Risciacquare l'aorta 3x con _dH2O per 5 minuti per rimuovere l'isopropanolo.
7. Sotto uno stereomicroscopio, pulire delicatamente tutto il tessuto adiposo perivascolare intorno all'aorta usando una pinzetta (Stile 4) e forbici a molla (Figura 3C,D).
   NOTA: È importante pulire tutto il tessuto adiposo perivascolare intorno all'aorta e ai suoi rami dopo la colorazione, perché il tessuto adiposo perivascolare macchiato di O rosso olio può produrre falsi sfondi e interferire con la morfometria della placca e la quantificazione dell'area della placca. Assicurarsi di non rimuovere una parte della parete aortica. Riempire il piatto di cera con _dH2O fino a coprire l'aorta macchiata durante la pulizia. Questo passaggio richiede pratica e pazienza.
8. Trasferire il recipiente su un vetrino pulito per microscopio.
9. Acquisire micrografie digitali utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio ottico. Salvare immagini ad alta risoluzione, preferibilmente in formato TIFF (Tagged Image File Format) (Figura 3E).
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Per evitare che l'aorta si asciughi, trasferire il recipiente in un tubo microcentrifuga da 1,5 ml e riempire con 1x DPBS fino a coprire l'aorta. Conservare a 4 °C.

9. Montaggio dell'aorta in faccia (Figura 4, Figura 5)

1. Trasferire il recipiente in una capsula di Cera di Petri e riempire con 1x DPBS fino a coprire l'aorta.
2. Tagliare le arterie carotidi, succlavia dell'arco aortico e le arterie iliache nell'aorta addominale 1-2 mm dopo le biforcazioni. Tagliare le arterie renali. (Figura 4A)
3. Tagliare longitudinalmente la preparazione dell'aorta lungo la curvatura interna (Figura 4B1) e le sole arterie iliache (Figura 4B2) con forbici a molla microsezionanti.
4. Tagliare i tre rami dell'arco aortico (cioè innominato, carotide comune sinistra, arteria succlavia sinistra) lungo la curvatura maggiore fino al livello base di curvatura interna (x-mark) (Figura 4B3-B8) con forbici a molla micro-dissezionanti.
5. Fissare l'aorta piatta (lato lumen rivolto verso l'alto) in un piatto di cera con perni di minuzia e applicare 1x DPBS fino a coprire l'aorta per evitare che si secchi (Figura 4C).
   NOTA: (1) È importante rendere piatta l'aorta arrotolata e fissarla in faccia senza allungarsi. Questo passaggio richiederà alcuni giorni a seconda della gravità dell'aterosclerosi. (2) Per le aorte di animali Apoe^-/- o Ldlr^-/- , si consiglia di fissare l'aorta piatta per 24 ore. (3) Il protocollo può essere messo in pausa qui.
6. Pulire i vetrini del microscopio di vetro con etanolo al 70% e tergicristalli delicati (Figura 5A).
7. Trasferire l'aorta in un vetrino pulito per microscopio e mettere 15 gocce di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) su un altro vetrino per microscopio di vetro pulito (Figura 5B).
8. Posizionare con attenzione il vetrino del microscopio di vetro con composto OCT sopra l'aorta ed evitare di intrappolare bolle d'aria sul vetrino (Figura 5C).
9. Etichettare le diapositive con nomi di esempio (Figura 5D).
   NOTA: I vetrini montati sull'aorta possono essere conservati nella camera di umidità a 4 °C per diversi mesi.

10. Imaging e quantificazione delle lesioni dell'aorta facciale (Figura 6)

1. Acquisire micrografie digitali utilizzando una fotocamera collegata a un microscopio ottico. Salvare immagini ad alta risoluzione, preferibilmente in formato TIFF (Tagged Image File Format) (Figura 6A).
2. Trasferire le immagini dell'intera aorta macchiata di viso su un computer dotato del software ImageJ.
3. In ImageJ, seleziona lo strumento "Selezione a mano libera" e cerchia manualmente tutta la placca macchiata di O rosso olio (punti rossi intensi) mentre premi il tasto "Alt" (per PC Windows) o il tasto "Maiusc" (per Mac). Quindi, fare clic su "Misura" nel menu "Analizza" per visualizzare le aree della lesione nella finestra dei risultati (Figura 6B a sinistra).
   NOTA: Ci sono diverse insidie della quantificazione delle lesioni aterosclerotiche: (1) qualsiasi piccolo pezzo di grasso avventiziale macchiato che è rimasto attaccato all'aorta dal passo 8.7 può produrre false basi e interferire con la quantificazione della placca; (2) la rimozione di una porzione della parete aortica o il danneggiamento dell'aorta dai passaggi 6.4 e 8.7 possono interferire con la quantificazione della placca; (3) bolle e pieghe formate nell'aorta dopo il montaggio (fase 9.8) possono interferire con la quantificazione della placca; e (4) la placca aterosclerotica è un fenomeno 3D e le misurazioni eseguite su un piano 2D potrebbero non riflettere la vera estensione della placca. Oltre all'analisi dell'area della placca dell'aorta en face, si consiglia di analizzare separatamente le dimensioni della placca nella radice aortica, nell'arteria brachiocefalica, nell'aorta ascendente e nell'aorta ^addominale8.
4. Cerchiare la linea del bordo esterno dell'aorta e fare clic su "Misura" nel menu "Analizza" per visualizzare l'area dell'aorta nella finestra dei risultati (Figura 6B a destra).
5. Esportare tutte le misurazioni in un file Excel.
6. Calcola il rapporto tra l'area della placca dall'area totale dell'aorta e normalizza il valore come percentuale della superficie totale di Oil Red O.
7. Calcola il rapporto tra l'area della placca in 8-10 Apoe^-/- e 8-10 TGFβR2iSMC-Apoe topi. Presentare i dati come media ± SEM (Figura 6C).
8. Esegui un t-test dello studente spaiato per l'analisi statistica del rapporto tra i dati dell'area della placca rispetto a un altro gruppo di topi. Considera le differenze nei valori medi come significative a p < 0,05.

In questo protocollo, le lesioni aterosclerotiche nei topi TGFβR2iSMC-Apoe sono state analizzate dopo 4 mesi con una dieta HCHF7. Oltre all'aterosclerosi estesa, questi topi hanno sviluppato aneurismi dell'aorta toracica e addominale, come precedentemente riportato. Rispetto ai topi Apoe-/-, le pareti aortiche dei topi TGFβR2iSMC-Apoe hanno mostrato una grave aterosclerosi, rendendo difficile sezionare le lesioni (Figura 2C, D, E). Inoltre, gli aneurismi sono particolarmente estesi al di sotto dell'aorta soprarenale, ricordando molto gli aneurismi aortici umani avanzati.

Un'immagine rappresentativa di colorazione O rossa dell'aorta non aperta dal mouse TGFβR2iSMC-Apoe alimentato con HCHFD è mostrata nella Figura 3E. L'immagine mostra un topo TGFβR2iSMC-Apoe che ha sviluppato aneurisma dell'aorta ascendente e addominale e mostra una formazione accelerata di lesioni aterosclerotiche nei rami dell'aorta (qui, l'arteria brachiocefalica, l'arteria carotide, le arterie succlavia, le arterie iliache, le arterie femorali e le arterie renali).

La Figura 6A mostra l'immagine di colorazione en face Oil Red O dei topi Apoe-/- e TGFβR2iSMC-Apoe. Rispetto al gruppo Apoe-/-, i topi TGFβR2iSMC-Apoe hanno mostrato un grave allargamento aneurismatico e un marcato allungamento dell'intera aorta.

Figura 1: Strumenti di dissezione utilizzati nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Protocollo passo-passo per l'escissione dell'aorta dal topo con dieta HCHF.
Questo è da un topo TGFβR2iSMC-Apoe di 24 settimane alimentato per 4 mesi con una dieta ricca di colesterolo alto contenuto di grassi (HCHF). (A) Topo in anestesia ketamina / xilene. Le linee tratteggiate indicano dove tagliare la pelle. (B) Dissezione del topo per esporre le cavità toracica e addominale. (C) Accurata rimozione degli organi interni (cioè polmone, fegato, milza e organi gastrointestinali e riproduttivi) seguita dall'esposizione dell'aorta di topo al microscopio di dissezione. (D) Rimozione accurata dei tessuti connettivi lungo l'aorta nel modo più pulito possibile. (E) Immagine dell'intera aorta isolata con rami. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Protocollo passo-passo per la colorazione e l'imaging dell'olio di aorta rosso O non aperto.
(A) Appuntamento dell'intera aorta con rami su una piastra di Petri di cera. (B) Copertura dell'aorta con soluzione colorante Oil Red O. (C) Illustrazione dell'intera aorta dopo la colorazione Oil Red O. (D) Illustrazione dell'aorta intera macchiata di O rosso olio dopo la pulizia. (E) Fotomicrografie rappresentative di aorta intera macchiata di olio rosso O di topi TGFβR2iSMC-Apoe dopo 4 mesi di dieta HCHF. a') Immagine ad alto ingrandimento dell'aorta ascendente da (a) e (b') immagine ad alto ingrandimento dell'aorta addominale da (b). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Protocollo passo-passo per la preparazione dell'aorta en face.
(A,B) L'albero arterioso macchiato con Oil Red O viene aperto longitudinalmente per appiattire l'aorta per l'imaging. Le linee tratteggiate lungo la parete e i numeri della nave indicano tagli sequenziali che vengono effettuati per aprire i vasi. (C) Diviso longitudinalmente e appuntato l'aorta intera su una capsula di Petri di cera a forma di Y. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Protocollo passo-passo per il montaggio dell'aorta en face.
(A) Pulizia delicata dei vetrini del microscopio in vetro con etanolo al 70% e asciugatura con salviette da laboratorio pulite. (B) Applicazione del composto PTOM sulla superficie di un vetrino per microscopio, quindi diffusione dell'aorta en face piatta sull'altro vetrino del microscopio di vetro. (C) Posizionamento delicato del vetrino del microscopio di vetro con composto OCT sopra il campione di aorta en face. (D) Etichettatura della diapositiva con il nome del campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Protocollo passo-passo per l'imaging dell'aorta facciale e la quantificazione della lesione aterosclerotica.
(A) Microfotografie di aorte en face da topi Apoe-/- e TGFβR2iSMC-Apoe dopo 4 mesi di dieta HCHF e colorate con Oil Red O. (B) Immagini che illustrano il processo di quantificazione assistita da computer delle lesioni aterosclerotiche. (C) Quantificazione dell'area della lesione: % area della lesione si riferisce alla colorazione O rosso olio come % della superficie aortica totale. Tutti i dati mostrati come ± SEM (***p < 0,001; t-test di studente a due code spaiato; n = 9 per topi Apoe-/- e n = 9 per topi TGFβR2iSMC-Apoe). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Primer di genotipizzazione.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.