Summary
Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.
Abstract
Het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt gereguleerd door een complex samenspel van neuronale, gliale, stromale en vasculaire cellen die de juiste functie vergemakkelijken. Hoewel het bestuderen van deze cellen in isolatie in vitro of samen ex vivo nuttige fysiologische informatie biedt; opvallende kenmerken van neurale celfysiologie zullen worden gemist in dergelijke contexten. Daarom is er behoefte aan het bestuderen van neurale cellen in hun oorspronkelijke in vivo omgeving. Het hier beschreven protocol beschrijft repetitieve in vivo twee-foton beeldvorming van neurale cellen in de knaagdierschors als een hulpmiddel om specifieke cellen gedurende langere perioden van uren tot maanden te visualiseren en te bestuderen. We beschrijven in detail het gebruik van de schromelijk stabiele hersenvacuatuur als een grove kaart of fluorescerend gelabelde dendrieten als een fijne kaart van bepaalde hersengebieden van belang. Met behulp van deze kaarten als een visuele sleutel, laten we zien hoe neurale cellen nauwkeurig kunnen worden verplaatst voor latere repetitieve in vivo beeldvorming. Met behulp van voorbeelden van in vivo beeldvorming van fluorescerende microglia, neuronen en NG2+ cellen, toont dit protocol het vermogen van deze techniek aan om repetitieve visualisatie van cellulaire dynamiek in dezelfde hersenlocatie over langere perioden mogelijk te maken, die verder kan helpen bij het begrijpen van de structurele en functionele reacties van deze cellen in normale fysiologie of het volgen van pathologische beledigingen. Waar nodig kan deze aanpak worden gekoppeld aan functionele beeldvorming van neurale cellen, bijvoorbeeld met calciumbeeldvorming. Deze benadering is vooral een krachtige techniek om de fysieke interactie tussen verschillende celtypen van het CNS in vivo te visualiseren wanneer genetische muismodellen of specifieke kleurstoffen met duidelijke fluorescerende tags beschikbaar zijn om de cellen van belang te labelen.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt beheerst door een complex samenspel van interacties tussen verschillende ingezeten celtypen, waaronder neuronen, glia en aan bloedvaten geassocieerde cellen. Traditioneel werden neurale cellen bestudeerd in geïsoleerde, co-gekweekte1,,2,,3,4,5 (in vitro) of uitgesneden hersenweefsel (ex vivo)6,7,8,9,10 contexten. Echter, er is behoefte aan verder te begrijpen neurale cel gedrag en interacties in de inheemse omgeving van de intacte hersenen in vivo. In dit protocol beschrijven we een methode om in vivo regio's van belang in kaart te brengen en deze regio's nauwkeurig opnieuw te beelden in toekomstige beeldvormingssessies om de complexe interacties tussen de verschillende CNS-celtypen gedurende langere perioden bij te houden.
De ontwikkeling van in vivo beeldvormingsbenaderingen heeft aanzienlijke voordelen opgeleverd voor het juiste begrip van neurale functie11,12,13,14,15. Met name deze benaderingen bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele in vitro en ex vivo benaderingen. Ten eerste hebben in vivo beeldvormingssystemen fysiologisch relevante cel- en weefselcomponenten zoals de vasculatuur met het volledige repertoire van cellulaire interacties om een volledig begrip van neurale netwerkfysiologie te bieden. Ten tweede, recente bevindingen suggereren dat wanneer verwijderd uit hun eigen omgeving, bepaalde neurale cellen (zoals microglia) belangrijke kenmerken van hun identiteit en dus fysiologie16,17 die kunnen worden bewaard in de in vivo instelling te verliezen. Ten derde bieden in vivo beeldvormingssystemen de mogelijkheid voor stabiele longitudinale onderzoeken van weken tot maanden om cellulaire interacties van CNS te bestuderen. Ten slotte bieden in vivo-systemen, gezien het groeiende bewijs voor bijdragen van het perifere immuunsysteem18,,19 en het microbioom20,21 in de CNS-fysiologie, een platform om dergelijke bijdragen en effecten op CNS-cellen te ondervragen. Dus, benaderingen die longitudinale in vivo beeldvorming gebruiken om neuro-immuun fysiologie en interacties in gezonde, gewonde en zieke toestanden te bestuderen zijn een grote aanvulling op traditionele benaderingen.
In dit protocol beschrijven we een betrouwbare benadering van verschillende celtypen in de hersenen, waaronder microglia, neuronen en NG2+ cellen als voorbeelden. Er zijn twee benaderingen ontwikkeld om neurale cellen in vivo te visualiseren: de uitgedunde schedelbenadering en de open schedel met een craniale raambenadering. Hoewel uitgedunde schedelbenaderingen in gebruik zijn en de voorkeur hebben omdat ze enkele van de nadelen van de open schedelbenadering overwinnen, zoals gliacelactivering, hoger dan fysiologische wervelkolomdynamiek en het gebruik van ontstekingsremmende middelen22,23,24,25, uitgedunde schedelbenaderingen vertonen ook een paar kritische nadelen. Ten eerste is de dunner wordende procedure een zeer delicate procedure die veel onderzoekers moeilijk vinden om te perfectioneren, vooral wanneer het opnieuw uitdunnen noodzakelijk is. Dit is het geval omdat het vaak moeilijk is voor onderzoekers om na te gaan dat ze de schedel hebben uitgedund tot een ~ 20 μm diepte. Ten tweede, voor adequate vergelijkingen tussen muizen, dunner zou moeten identiek zijn en een verscheidenheid van dunner wordend succes tussen beeldvorming sessies of muizen kunnen compliceren visualisatie van neurale structuren. Ten derde, wanneer ze worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming, kunnen dieren met uitgedunde schedels slechts voor een beperkt aantal sessies worden gebruikt wanneer het opnieuw uitdunnen van de schedel wordt gebruikt. Forth, aangezien sommige van het botweefsel nog steeds overblijft, duidelijkheid in de diepte van de beeldvorming kan worden aangetast van de uitgedunde schedel benadering waardoor grote visualisatie van meer oppervlakkige, maar niet zo veel met diepere regio's. In het licht hiervan kunnen diepere hersenstructuren zoals de hippocampus niet succesvol worden afgebeeld met de uitgedunde schedelbenadering. Deze overwegingen doen de noodzaak van alternatieve en complementaire benaderingen aan de orde die deze zorgen kunnen wegnemen.
Als alternatief voor de uitgedunde schedelbenadering, maakt de open schedelvensterimplantatiebenadering gebruik van een procedure waarbij de schedel wordt vervangen door een optisch heldere glazen coverslip. Dit zorgt voor een vrijwel onbeperkt aantal beeldvormingssessies. Bovendien, gezien de vervanging van de schedel door de glazen coverslip, deze methode zorgt voor een duidelijk kijkvenster van fluorescerend getagde hersencellen voor uitgebreide perioden van uren tot maanden en, daarom, kan worden gebruikt om celactiviteit en interacties die relevant zijn voor fysiologie, veroudering en pathologie te bestuderen.
Over het algemeen beschrijven we stappen die kunnen worden gevolgd om chronische craniale vensters te implanteren door middel van een stereotaxic craniotomie die in vivo beeldvorming van hersengebieden van belang mogelijk maakt. We beschrijven ook hoe de schromelijk stabiele hersenen vasculatuur of de fluorescerende gelabelde dendrieten kunnen worden gebruikt om een grove of een fijne kaart te genereren, respectievelijk van de hersenen regio's van belang. Deze aanpak kan vervolgens worden gebruikt voor herhaalde beeldvorming gedurende meerdere sessies. Het belang van deze techniek ligt daarom in zijn vermogen om de langetermijnveranderingen of stasis in hersenelementen in beeld te brengen, waaronder de opstelling, morfologie en interacties van de verschillende cellulaire typen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle stappen zijn in overeenstemming met de richtlijnen vastgesteld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Virginia.
1. Muisvoorbereiding voor schedelowimplantatie
LET OP: Verschillende transgene muislijnen met fluorescerende tags zijn geschikt voor beeldvorming.
- Gebruik CX3CR1GFP/+ muizen26 om microglia in vivo te visualiseren. Typisch, jonge tot jonge volwassen 4 tot 10 weken oude muizen die 17-25 g wegen worden gebruikt.
OPMERKING: Hoewel deze aanpak zelfs geschikt is voor voorspende muizen, kan de noodzaak om de muizen terug te keren naar hun kooi met hun moeders voor het voeden, het herstel bemoeilijken als de moeder na de operatie niet voldoende voor pups zorgt. Daarom wordt het gebruik van muizen na het spenen aanbevolen. - Verdoven de muis met behulp van isoflurane (5% stroom in zuurstof voor inductie gedurende 1 min) in een verdovingskamer. Controleer of de muis geen beweging of trillende reacties op teen- en/of staartknijpers laat zien. Neem de muis uit de kamer en in de open lucht grondig scheren het haar op het hoofd tussen de oren van ongeveer het ooghoogte naar de top van de nek regio met behulp van een haartrimmer.
OPMERKING: De concentratie van gebruikte isofluran zou afhangen van de grootte van de inductiekamer. Daarom kan voor kleinere kamers 3-4% isoflurane worden gebruikt om anesthesie effectief te induceren, terwijl grotere kamers tot 5% nodig hebben. - Verplaats de muis naar de stereotactische chirurgie station neuskegel voor anesthesie (1,5-2% voor onderhoud voor de operatie), stabiliseren van het hoofd met behulp van oordoppen, en onderhouden van de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur warm te houden.
- Smeer beide ogen met oogzalf. Injecteer 100 μL van 0,25% bupivicaine (om lokale analgesie te bieden aan de muis die 8-12 uur zal duren) en 100 μL van 4 mg/mL dexamethasone (om de ontsteking die het gevolg kan zijn van de operatieprocedure te verminderen) onderhuids op de incisieplaats. Laat de muis minstens 5 minuten zitten voordat u naar de volgende stap gaat.
- Maak de geschoren kop schoon met drie afwisselende wattenstaafjes betadine en 70% alcohol. Maak een middellijn hoofdhuid incisie met behulp van chirurgische mes of schaar uit te breiden van de achterkant van de schedel regio tussen de oren naar de frontale gebied tussen de ogen. De resterende huid wordt gesneden om de schedel bloot te leggen.
- Reinig het bindweefsel tussen de hoofdhuid en de onderliggende schedel met 3% waterstofperoxide (H2O2)en lokaliseer het te beelden hersengebied met stereotactische coördinaten.
OPMERKING: Er is vaak wat bloeden (stap 1.5) van de incisie op het schedeloppervlak. Deze bloeding verdwijnt meestal vanzelf binnen 3-5 min. Schoonmaken met de peroxide helpt. Voorafgaande behandeling van bupivacaine (stap 1.4) wordt ook opgemerkt om de hoeveelheid bloeden gedurende deze tijd te beperken.
2. Muis craniale venster implantatie chirurgie
- Boor een cirkelvormige opening ~4 mm in de schedel met behulp van een tandboorbit (0,7 mm tipdiameter) en verwijder dit deel van de schedel voorzichtig met behulp van puntige tangen. Voor het beeldvorming van de somatosensorische cortex van 6-8 weken oude muizen, lokaliseren het centrum van de craniotomie op -2,5 achterste en ± 2,0 laterale naar bregma. Bevochtig tijdens het boren regelmatig de schedel met steriele zouten en wattenstaafjes om de hersenen af te koelen, botresten schoon te maken en het schedelbot te verzachten voor eventuele verwijdering.
OPMERKING: De coördinaten voor de craniotomie zouden variëren afhankelijk van het interessegebied en de leeftijd van de muizen. - Nadat de schedel is verwijderd, voorzichtig plaats een klein afdekglas (grootte #0 op 0,1 ± 0,02 mm dikte) bevochtigd met zout in de craniotomie. Droog overtollige zoutoplossing af met een steriele doek.
- Met behulp van een puntige applicator (zoals een pipetpunt of het puntige uiteinde van een gebroken houten wattenstaafje), breng cyanoacrylaatlijm rond het raam en laat het hechten aan de hersenen en schedel. Breng de primer lijm op de rest van de schedel en genezen met een uitharding licht voor 20-40 s. Bereid een put rond het raam met de uiteindelijke lijm en genezen met een uitharding licht voor 20-40 s.
- Lijm eerst een kleine hoofdplaat op de schedel op het contralaterale halfrond van de craniotomie met de primerlijm als primer en vervolgens met de uiteindelijke lijm. Cure beide met het uitharden licht voor 20-40 s per stuk.
LET OP: Hechtingen zijn niet nodig als de schedel tijdens deze procedure volledig bedekt is met de lijm.
3. Na de operatie
- Laat de muis wakker worden bij afwezigheid van anesthesie (herstel gedaan op een verwarmingskussen verkort de hersteltijd) en breng hem terug naar zijn kooi zodra het volledig wakker is. Injecteer één onderhuidse dosis buprenorfine SR (0,5 mg/kg) als postoperatieve analgesie die voldoende is voor 72 uur.
- Om een gezond herstel van de operatie te vergemakkelijken, geeft u de muis een extra zacht voedsel, dat in de vorm van regelmatige vaste chow in water kan zijn om de chow of voedsel in de vorm van een gel te verzachten.
LET OP: Een eenmalige levering van het zachte voedsel direct na de operatie is voldoende. - Controleer de muis dagelijks op gezondheid en goed herstel voor de eerste 72 uur van de operatieprocedure. Daarna, uitvoeren van beeldvorming vanaf al 2 weken vanaf het venster implantatie chirurgie.
OPMERKING: Als het goed wordt gedaan, herstellen muizen goed met normaal ambulante gedragingen, voldoende kooiverkenning, goede hydratatie, stabiele gewichtstoename en uitgebreide interacties met andere muizen in de kooi en andere items in de kooi. Muizen met lethargie, uitdroging en meer dan 10% gewichtsverlies na de operatie worden geëuthanaseerd en verwijderd uit de studie.
4. Twee-foton hersenen mapping voor de eerste beeldvorming
- Verdoof de muis (Isoflurane, 5 % inductie en 1,5 % onderhoud). Stabiliseer de kop met behulp van schroeven om de kopplaat te monteren op de twee-foton microscoop stadium, wordt gehandhaafd op een verwarmingsplaat op 35 °C. Injecteer intraperitoneally 100 μL bloedvatkleurstof zoals Rhodamine B (2 mg/mL).
OPMERKING: Beeldvorming kan ook worden gedaan in wakkere muizen zonder verdoving. Recente studies wijzen er echter op dat anesthesie de microgliale surveillancedynamiek27,28,29 beïnvloedt en dat hoofdfixatie voor twee fotonbeeldvorming bij wakkere muizen de stress verhoogt, zelfs tijdens chronische beeldvorming gedurende ten minste 25 dagen (zie Juczewski et al., 2020)30. - Reinig het oppervlak van het schedelvenster voorzichtig met een wattenstaafje in 70% ethanol. Doe een paar druppels water of zout op het schedelvenster en verlaag de objectieve lens in de oplossing, omdat het doel een onderdompelingslens is.
- Hand-teken een grove kaart om de belangrijkste bloedvat oriëntatiepunten in een lab notebook aan te duiden tijdens het kijken door het oculair door epiflorescence. Gebruik deze tekening om de specifieke regio's te identificeren tijdens twee fotonbeeldvorming. U ook foto's maken van de bloedvaten via een camera die op de microscoop is gemonteerd of via een handcamera of telefoon.
OPMERKING: Deze met de hand getekende beelden en foto's moeten het opnieuw bezoeken van dezelfde brede regio's onder de microscoop vergemakkelijken voordat twee fotonbeeldvorming. Dit zijn geen nauwkeurige beeldmapping. - Verzamel onder twee fotonbeelden beelden van florescente cellen en vaten als dat nodig is. Maak zorgvuldige aantekeningen met de juiste coördinaten om ervoor te zorgen dat de precieze regio's opnieuw kunnen worden bekeken voor latere beeldvorming. Verzamel verschillende gezichtsvelden in deze eerste beeldvormingssessie, bijvoorbeeld om elke 1-2 μm z-stackbeelden te verkrijgen via een volume weefsel.
OPMERKING: Tijdens het verzamelen van beelden door twee foton, het bloedvat oriëntatiepunten worden gebruikt voor grof in kaart brengen. Als fijne mapping nodig is, worden YFP-gelabelde dendrieten van Thy1-YFP31 muizen gebruikt.- Gebruik deze aanbevolen parameters voor beeldvorming: een golflengte van 880-900 nm is optimaal; voor GFP en/of dsRed / Rhodamine excitatie wordt een 565 nm dichroic spiegel met 525/50 nm (groen kanaal) en 620/60 nm (rode kanaal) emissiefilters gebruikt; voor GFP- en YFP-scheiding wordt een 509 nm dichroic spiegel met 500/15 en 537/26 nm emissiefilters gebruikt; het vermogen in de hersenen wordt gehandhaafd op 25 mW of lager; beeldresolutie is 1024 x 1024 pixels, het gezichtsveld genomen met een 25X 0.9 NA doelstelling op een 1,5X zoomfactor is 295,24 x 295,24 μm.
- Aan het einde van de beeldvorming, neem de muis van het podium, laat het wakker worden van anesthesie en terug te keren naar zijn huis kooi tot een toekomstige imaging sessie.
5. Beeldvorming met twee foto's en re-imaging
- Voor toekomstige volgende beeldvormingssessies, die van enkele uren tot maanden na de eerste beeldvormingssessie overal kunnen zijn, verdoven de muis (Isoflurane, 5% inductie en 1,5% onderhoud), monteren op de twee-fotonmicroscoop, handhaven op een verwarmingsplaat en re-inject 100 μl een bloedvatkleurstof zoals Rhodamine B (2 mg/mL).
- Open de eerder verkregen afbeeldingen in ImageJ en identificeer deze met behulp van deze afbeeldingen en de notities van de vorige sessie en identificeer deze zorgvuldig.
- Herhaal dit zolang het beeldvenster duidelijk is of essentieel voor de omvang van de studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de microgliale dynamiek in vivo te visualiseren, werden dubbele transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP muizen gebruikt. De Thy1-YFP H-lijn wordt gebruikt in tegenstelling tot de Thy1-GFP M-lijn om te voorkomen dat de overlap van microglia (GFP) en neuronen (YFP) florescentie overlapt. Alternatieve benaderingen kunnen gebruik maken van een reporter lijn waarin microglia zijn gelabeld met bijvoorbeeld tdTomato en vervolgens de Thy1-GFP M lijn kan worden gebruikt. Een nadeel van de H-lijn is dat YFP veel neuronen labelt en het label toeneemt met toenemende leeftijd (persoonlijke observatie). De M-lijn vertoont schaarse etikettering van neuronen. Tussen 2 – 4 weken van de raamimplantatie operatie, microgliale dynamiek kan worden gevolgd door herhaalde beeldvorming. Grote bloedvaten worden gebruikt om specifieke regio's te lokaliseren en vervolgens de YFP-gelabelde dendrieten worden gebruikt voor het fijn in kaart brengen van hersengebieden. Met deze aanpak kunnen specifieke dendrieten worden gebruikt als stabiele oriëntatiepunten voor het fijn in kaart brengen van hersengebieden(figuur 1, pijlen in figuur 1b). Terwijl dendrieten stabiel zijn, bewegen sommige microglia dagelijks(figuur 1c).
Bovendien is deze aanpak voldoende voor wekelijkse longitudinale beeldvorming op lange termijn. Zo werden enkele transgene CX3CR1GFP/+ muizen gebruikt om microglia te volgen in combinatie met intraperitoneale injecties van Rhodamine B om de vasculatuur tijdens elke beeldvormingssessie gedurende maximaal 8 weken te etiketteren(figuur 2). Als alternatief, zoals hierboven besproken, Thy1 muizen kunnen worden gebruikt voor longitudinale fijne mapping. Wanneer wekelijkse beeldvorming wordt uitgevoerd, wordt de vasculatuur stabiel vastgesteld, maar microglia kan worden gezien als dynamisch, zoals blijkt uit drie specifieke regio's van belang (ROI, stippelcirkels) in figuur 2. In de top ROI, microglia beginnen aan de ROI in te voeren door de4e week van de beeldvorming en verder te gaan door de8e week van de beeldvorming. In het midden ROI met een gespleten vat, een microglia cel ontstaat rond het onderste vat in de3e week, gaat verloren op de6e week en een andere microglia ontstaat op het bovenste bloedvat in de7e week en wordt gehandhaafd in de8e week. Ten slotte, in de onderste ROI, een microgliale cel in onderhouden door de6e week en verloren in de7e en8e week van beeldvorming. Deze resultaten wijzen op dynamische veranderingen in het microgliale positionele netwerk gedurende weken tot maanden.
Deze aanpak kan ook worden gebruikt om cellulaire dynamiek te onderzoeken na acuut letsel of tijdens pathologische ziekteprogressie. Enkele transgene CX3CR1GFP/+ muizen werden gebruikt om microglia te volgen in combinatie met intraperitoneale injecties van Rhodamine B om de vasculatuur eerder te labelen (gegevens niet getoond) en na ernstige aanvallen veroorzaakt door kainiczuur (figuur 3). Na epileptische aanvallen wordt de vasculaire bedstructuur gehandhaafd zonder openlijke verstoringen(figuur 3a). Echter, de microgliale cellulaire netwerk en positionele landschap is tijdelijk veranderd (sommige cellen zijn "opgedaan" en anderen zijn "verloren" in het gezichtsveld) met grotere veranderingen binnen 24-48 uur van de aanvallen die wordt hersteld naar normaal door 72 uur (Figuur 3b) zoals we eerder gemeld32.
Ten slotte kan deze benadering ook worden gebruikt om celcelinteracties te onderzoeken of de dynamiek tussen neurale celtypen te vergelijken. Dubbele transgene CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ muizen werden gebruikt om microglia en NG2+ cellen in vivo te volgen. Zonder etikettering kunnen de vasculatuur, microglia en NG2 cellen worden geïdentificeerd (figuur 4a). NG2 is een proteoglycan die zowel aan vatgebonden pericyten als oligodendrocyten precursorcellen (OPC's)33,34labels . Pericyten hebben meestal langwerpige processen die volgen langs de vaatwand (vermoedelijk geïdentificeerd met pijlpunten in figuur 4a)en OPC's tonen meestal grotere cellichamen die zich in de hersenen parenchyma uit de buurt van de vasculatuur (vermoedelijk geïdentificeerd met pijlen in figuur 4a). Om pericyten en OPC's adequaat te onderscheiden, is de vasculatuur gelabeld met Rhodamine B. De helderdere florescentie van NG2+-vat geassocieerde cellen (pericyten, pijlpunten) kan worden onderscheiden van de zwakkere florescentie van luminale Rhodamine, ondanks soortgelijke excitatie door twee foton beeldvorming(Figuur 4b, c). Dagelijkse beeldvorming toont aan dat pericyten stabiel zijn gepositioneerd, terwijl OPC's (sterretjes in figuur 4b) en microglia (cirkels in figuur 4b) dynamisch zijn in overeenstemming met eerdere rapporten32,35,36.
Figuur 1: Dagelijkse beeldvorming van microglia met behulp van fijne mapping met neuronale dendrieten in dubbele transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP muizen. aa) Representatieve tweefoton afbeelding van microglia (groen) en dendrieten (rood) van een dubbele transgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP muis. (b-c), Dagelijkse afbeeldingen van geboxte regio in (a) met herhaaldelijk afgebeelde dendrieten (pijlen in b) en dendrieten met microglia (c). Terwijl dendritische structuren positie stabiel waren, werden sommige microglia genoteerd om van hun originele positie in verdere dagen te translocateren. Dergelijke cellen werden geïdentificeerd met een getal (1, 2 of 3). Op de vorige dag, hun positie werd opgemerkt met een witte sterretje en op een volgende dag, hun positie werd opgemerkt met een gele sterretje. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Lange termijn wekelijkse beeldvorming van microglia in CX3CR1GFP/+ muizen gedurende enkele maanden. (a-h), Representatieve twee-foton beelden van microglia (groen) van een CX3CR1GFP / muis tijdens herhaalde beeldvorming met behulp van acuut gelabelde vasculature (rood, Rhodamine, 2 mg/mL, i.p.) als een grove mijlpaal om het microgliale netwerk te volgen voor maximaal 8 weken. De vasculatuur was structureel stabiel tijdens de beeldvormingsperiode. Drie kleine gebieden met de vasculatuur (stippelcirkels) werden gemarkeerd om de beweging van microgliale somata aan te geven in (bovenste twee gestippelde cirkels) of uit (onderste cirkel) die regio's. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Dagelijkse beeldvorming op lange termijn van microglia in CX3CR1GFP/+ muizen na aanvallen. (a-b), Representatieve tweefoton beelden tijdens de dagelijkse beeldvorming van hetzelfde gezichtsveld van een specifiek hersengebied met microglia (groen) en acute etikettering van de vasculatuur (rood, Rhodamine, 2 mg/mL, i.p.). Beeldvorming begint na inductie van ernstige aanvallen met behulp van een chemoconvulsief middel, kainic zuur. De vasculaire structuur werd gehandhaafd als individuele vasculaire segmenten (pijlen) kan worden geïdentificeerd door de tijd(a). De dynamiek van het microgliale netwerk werd echter gedurende de eerste twee dagen na de aanvallen en de terugkeer naar normale niveaus tegen de derde dag (b). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Dagelijkse beeldvorming van microglia en NG2+ cellen in CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ muizen. (a) Een representatieve twee-foton afbeelding van microglia (groen) en NG2+ cellen (rood) in vivo. De niet-gelabelde vasculatuur slaagt er niet in NG2-cellen (pericyten, vermoedelijk geïdentificeerd met pijlpunten) en NG2-cellen te onderscheiden die niet geassocieerd zijn met de vasculatuur (oligodendrocytenprecursorcellen of OPC's, vermoedelijk geïdentificeerd met pijlen). bb) Representatieve tweefoton beelden van microglia (groen) en NG2+ cellen (rood) in opeenvolgende dagen van beeldvorming met de vasculatuur gelabeld met Rhodamine. Pericyten (pijlpunten) zijn stationair, terwijl OPC's dynamisch zijn (wit tot geel sterretjes). Microglia zijn ook dynamisch (cirkels: onderbroken cirkels vertegenwoordigen een positie zonder microglia en gevulde cirkel vertegenwoordigt een positie met een overeenkomstige microglia). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De komst van in vivo twee-foton beeldvorming heeft mogelijkheden geopend om de overvloed van cellulaire interacties en dynamiek die zich voordoen in de gezonde hersenen te verkennen. Eerste studies gericht op het gebruik van de open schedel craniotomie benadering van beeld neuronale dendrieten door zowel acute als chronische beeldvorming37,38. Dit kan ook worden gebruikt om neuro-immuun interacties in de hersenen te verduidelijken. Dit protocol beschrijft een methode voor de betrouwbare beeldvorming van fluorescerend getagde cellen (met name microglia, de ingezetene immuuncel van de hersenen) voor langere tijd op korte of lange termijn. Het gebruik van kleurstof-gelabelde vasculaire en / of fluorescerend gelabelde dendrieten is gedetailleerd voor grove of fijne mapping van de hersenen regio's van belang om herhaalde, betrouwbare beeldvorming van cellen mogelijk te maken. Hoewel de Thy1YFP-lijn wordt voorgesteld voor gebruik voor fijne hersenmapping, kunnen alternatieve benaderingen andere technieken of muislijnen gebruiken voor het labelen van geselecteerde neuronale populaties, zoals in utero elektroporatie39,40, vroege postnatale AAV-injecties41 of het gebruik van TRAP-muizen42. Hoewel corticale beeldvorming de focus van deze discussie was, kan deze aanpak bovendien worden aangepast om diepe hersenstructuren op lange termijn te visualiseren43.
Voor dit protocol kan de operatieprocedure op elke muis worden voltooid in 30-60 minuten vanaf de initiatie van anesthesie tot het herstel van anesthesie. Tijdens de operatie wordt de schedel zorgvuldig verwijderd en vervangen door een steriele afdekglas die na ten minste twee weken wordt geïmplanteerd voor beeldvorming op lange termijn. Sterfte is uiterst zeldzaam (minder dan 5%) bij wildtype muizen, hoewel muizen met stollingsproblemen, zoals P2Y12R knock-out muizen, tonen een hogere mortaliteit en chirurgie falen. Bij dergelijke muizen kan het bloeden langer aanhouden en muizen kunnen sterven binnen de eerste 48 uur van de craniotomie, vermoedelijk als gevolg van complicaties van interne bloedingen. Muizen met geïmplanteerde ramen uit dit protocol zijn niet opgemerkt om tekenen van infectie te vertonen en het protocol kan betrouwbaar worden gebruikt om duidelijke vensters te genereren voor lange termijn beeldvorming bij 50-80% van de muizen.
Alternatief voor de huidige chronische raamimplantatie benadering, de dunne schedel benadering bestaat om hersencellen in de intacte hersenen herhaaldelijk visualiseren. Verschillende studies hebben gewezen op de waarde en zelfs de prioriteit van de keuze van de dunne schedel benadering over het venster implantatie aanpak22,23,24,25. De belofte van die aanpak mag niet worden genegeerd, omdat, wanneer het goed wordt gedaan, het een aantal opvallende beperkingen of nadelen van de huidige aanpak tegengaat, waaronder het gebrek aan activering van gliacellen, de lage omzet van stekels die fysiologischer is, en het gebrek aan behoefte aan het gebruik van ontstekingsremmende middelen die ook de fysiologie van de hersenen kunnen beïnvloeden. Bij het selecteren van een aanpak voor specifieke onderzoeksvragen moet rekening worden gehouden met deze ernstige beperkingen voordat de in dit protocol beschreven aanpak wordt gekozen.
De aantrekkingskracht van deze aanpak is echter verviervoudigd. Ten eerste is de craniale raamimplantatiebenadering aantrekkelijk vanwege het gemak van beheersing van deze procedure ten opzichte van de dunne schedelprocedure. Passende schedel dunner kan niet altijd worden beheerst door onderzoekers en zo niet goed gedaan kan resulteren in glia activering beperking van de aantrekkingskracht. Ten tweede, deze craniale venster implantatie aanpak geeft krachtige diepte duidelijkheid van de hersenen structuren als de hersenen wordt afgebeeld door middel van een optisch helder venster. Het venster beschikbaar voor beeldvorming is ook meestal veel groter dan die gebruikt in de dunne schedel aanpak waardoor toegang tot een groter volume van weefsel voor analyse. Ten derde, net als dieptehelderheid, zorgt deze benadering voor een uniforme helderheid door het raam, omdat de glazen kaplip gelijkmatig dun en duidelijk is. Dit vergemakkelijkt de vergelijking tussen sessies en tussen dieren. Speciale expertise is vereist voor de dunne schedeltechniek om zelfs duidelijkheid over het raam te garanderen tijdens herhaalde sessies en tussen dieren. Ten slotte biedt deze aanpak veel flexibiliteit in de frequentie van beeldvorming van uren, dagen tot weken tot maanden en zelfs jaren. Voor de dunne schedel benadering, een maximum van vijf herhalingen is voorgesteld24.
Toekomstige toepassingen van deze aanpak zijn talrijk. Ten eerste kunnen toepassingen betrekking hebben op het ophelderen van nieuwe neuro-glio-vasculaire interacties in de hersenen in zowel de normale fysiologie als pathologie. Ten tweede, hoewel ingezeten cellen worden besproken in deze procedure, kan de aanpak worden gebruikt om de dynamiek en interacties van het infiltreren van immuuncellen te bestuderen, zoals bijvoorbeeld tijdens acuut letsel, chronische herseninfectie en/of neurodegeneratieve aandoeningen, zolang muizen met de respectievelijk fluorescerende cellen beschikbaar zijn. Ten slotte is deze aanpak vooral besproken in het kader van structurele studies van hersencellen. Echter, met de komst van functionele beeldvorming bijvoorbeeld met behulp van calcium44,45,46 of voltage imaging technieken47,48, deze aanpak kan worden gebruikt voor functionele beeldvorming in de tijd in de gezondheid en ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de leden van het Eyo lab voor het bespreken van de ideeën gepresenteerd in dit manuscript. Wij danken Dr. Justin Rustenhoven van het Kipnis Lab aan de Universiteit van Virginia voor het geschenk van NG2DsRed muizen33. Dit werk wordt ondersteund door financiering van het National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health to U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C.
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W.
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J.
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L.
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
