Il protocollo descrive metodi sperimentali per ottenere sostituzioni stabili del complesso di istocompatibilità maggiore (MHC) classe Iattraversopotenziali sostituzioni di β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie. Sono stati studiati il confronto strutturale dell'MHC I stabilizzato da β omologo edeterologodi 2 m.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Stabilità e struttura del pipistrello Maggiore Istocompatibilità Complesso Classe I con Eterolologo β2-Microglobulina
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) svolge un ruolo fondamentale nella presentazione del peptide antigene e nelle risposte immunitarie delle cellule T contro le malattie infettive e lo sviluppo tumorale. L'MHC I ibrido complesso con sostituzione eterologo β 2-microglobulina (β2m) da diverse specie può essere stabilizzato in vitro. Questo è un mezzo fattibile per studiare l'MHC I dei mammiferi, quando l'β2m non è disponibile. Nel frattempo, è indicato che il βsostituzione di 2m non influisce in modo significativo sulla presentazione peptidica. Tuttavia, c'è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia per l'MHC ibrido I complessa con β eterologo2-microglobulina (β2m). Nel presente documento vengono presentati metodi per valutare la fattibilità βsostituzione eterologodi 2 m nello studio MHC I. Questi metodi includono la preparazione di costrutti di espressione; purificazione dei corpi di inclusione e ripiezione del complesso MHC; determinazione della termostabilità proteica; screening cristallino e determinazione della struttura. Questo studio fornisce una raccomandazione per la comprensione della funzione e della struttura dell'MHC I ed è anche significativo per la valutazione della risposta delle cellule T durante le malattie infettive e l'immunoterapia tumorale.
Introduzione
Il principale complesso di istocompatibilità (MHC) esiste in tutti i vertebrati ed è un insieme di geni che determina l'immunità mediata dalle cellule agli agenti patogeni infettivi. La classe MHC I presenta peptidi endogeni, come componenti virali prodotti dopo l'infezione da virus, ai recettori delle cellule T (TCR) sulla superficie delle cellule CD8+ T per mediare l'immunità cellulare e partecipare alla regolazione immunitaria1. Uno studio strutturale dell'MHC I che si lega ai peptidi fornisce informazioni sui motivi di legame peptidico e sulle caratteristiche di presentazione da parte delle molecole MHC I, che svolge un ruolo vit....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione dei costrutti di espressione
- Recupera le sequenze dei geni di classe I dell'MHC (inclusi i geni previsti) dai pipistrelli dal database NCBI.
- Recuperare sequenze di catene pesanti MHC I di mammiferi superiori dal database ipd (Immuno Polymorphism Database) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) e dal database UniProt (www.uniprot.org).
- Per ottenere complessi MHC solubili, mutagenizzare le sequenze per rimuovere le regioni citosoliche e transmembrane.
- Clonare i geni che codificano gli ectodomini del pipistrello Ptal-N*01:01 (GenBank n. KT98792919) (residui 1–277) e pipistrello β2m (GenBank n. XP....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Lavori precedenti riportavano che il peptide HeV1 (DFANTFLP) derivato da HeV era presentato da Ptal-N*01:0110,19. Nel presente documento è stata valutata la capacità di legame di questo peptide a Ptal-N*01:01 con pipistrello omologo β2m (bβ2<.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La costruzione di un complesso proteico ibrido attraverso la sostituzione eterologo da diversi taxa è una strategia comune per le indagini funzionali e strutturali quando il complesso omologo non è disponibile, come nell'MHC I e nei suoi ligandi. Tuttavia, vi è una sintesi limitata per quanto riguarda la metodologia e la tecnologia. Qui è stata analizzata la struttura del pipistrello MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizzata da bβ2m o hβ2m. Gli amminoacidi chiave di β2m che si legano a Ptal-N*01:.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal fondo aperto del laboratorio statale chiave di biotecnologia farmaceutica, Università di Nan-jing, Cina (Grant no. KF-GN-201905), la National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 81971501). William J. Liu è supportato dall'Excellent Young Scientist Program della NSFC (81822040) e dal Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 kDa MMCO membrana | Merck millipore | PLGC07610 | |
| 30% acrilammide | LABLEAD | A3291-500ml*5 | |
| 5&volte; Proteina SDS Caricamento | Novoprotein | PM099-01A | |
| AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff | Merck millipore | UFC901096 | |
| Ampicillina | Inalco | 1758-9314 | |
| APS | Sigma | A3678-100G | |
| BL21 (DE3) ceppo | TIANGEN | CB105-02 | |
| DMSO | MP | 219605580 | Indossare guanti adeguati e protezioni per occhi/viso. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con abbondante acqua e sentire il parere del medico. |
| DTT | Solarbio | D1070 | devono essere indossati e utilizzati in una cucina ventilata. In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con abbondante acqua e sentire il parere del medico. |
| EDTA-2Na | KeyGEN BioTECH | KGT515500 | |
| Glicerina | HUSHI | 10010618 | |
| GSH | Amresco | 0399-250G | |
| GSSG | Amresco | 0524-100G | |
| Guanidina cloridrato | Amresco | E424-5KG | |
| hβ 2m | il nostro laboratorio | Zhang, S. et al. Basi strutturali della presentazione cross-allelica da parte di HLA-A*0301 e HLA-A*1101 rivelate da due complessi peptidici derivati dall'HIV. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011). | |
| IPTG | Inalco | 1758-1400 | |
| L-Arginina cloridrato | Amresco | 0877-5KG | |
| NaCl | Solarbio | S8210 | |
| marcatore proteico | Fermentas | 26614 | |
| SDS | Boao Rui Jing A112130 | ||
| Superdex Increase 200 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
| TEMED | Thermo | 17919 | I guanti e gli occhiali devono essere indossati e utilizzati in una cucina ventilata. |
| Tris-HCl | Amresco | 0497-5KG | |
| Triton X-100 | Bioruler | RH30056-100mL | |
| Triptone | Oxoid | LP0042 | |
| Estratto di lievito | Oxoid | LP0021 |
Riferimenti
- Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
- Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
