Raccolta a cella singola di cellule di trofoblasto in peri-impianto Stadio Embrioni Umani

Sommario

Qui, descriviamo un metodo per riscaldare le blastocisti umani vetrificati, maficandoli attraverso il periodo di impianto in vitro, digerindoli in singole cellule e raccogliendo cellule trofoblaste precoci per ulteriori indagini.

Abstract

L'impianto umano, l'apposizione e l'adesione all'epitelia della superficie uterina e la successiva invasione della blastocisti nel decidua materno, è un evento biologico critico ma enigmatico che è stato storicamente difficile da studiare a causa di limitazioni tecniche ed etiche. L'impianto è iniziato dallo sviluppo del trophectoderm al trofoblasto precoce e dalla successiva differenziazione in sottolinea trofoblasto distinta. La differenziazione aberrante precoce del trofoblasto può portare a insufficienza di impianto, patologie placentiali, anomalie fetali e aborto spontaneo. Recentemente, sono stati sviluppati metodi per consentire agli embrioni umani di crescere fino al giorno 13 dopo la fecondazione in vitro in assenza di tessuti materni, un periodo di tempo che comprende il periodo di impianto nell'uomo. Questo ha dato ai ricercatori l'opportunità di studiare l'impianto umano e ricapitolare le dinamiche della differenziazione trofoblasta durante questo periodo critico senza confondere le influenze materne ed evitare ostacoli intrinseci allo studio degli eventi di differenziazione precoce degli embrioni in vivo. Per caratterizzare diverse sottolinea trofoblastiche durante l'impianto, abbiamo adottato metodi di coltura estesi bidimensionali (2D) esistenti e sviluppato una procedura per digerire e isolare in modo esipetino e isolare diversi tipi di cellule trofoblaste per i test a valle. Gli embrioni se nessiti in condizioni 2D hanno una morfologia relativamente appiattita e possono essere non ottimali nella modellazione di architetture embrionali tridimensionali (3D) in vivo. Tuttavia, la differenziazione dei trofoblasti sembra essere meno influenzata, come dimostrato dai cambiamenti previsti della morfologia e dell'espressione genica nel corso della coltura estesa. Diverse sottolinea trofoblas, tra cui citotrophoblast, syncytiotrophoblast e trofoblast migratorio possono essere separati per dimensione, posizione e apparizione temporale, e utilizzati per ulteriore caratterizzazione o sperimentazione. L'analisi di queste cellule trofoblastiche precoci può essere determinante per comprendere l'impianto umano, nel trattamento di comuni patologie place-sina, e mitigare l'incidenza della perdita di gravidanza.

Introduzione

L'impianto umano e l'emergere della placenta precoce sono storicamente difficili da indagare e rimangono in gran parte sconosciuti perché i tessuti umani sono inaccessibili in questa fase quando la gravidanza è clinicamente inosservabile. I modelli animali sono inadeguati, in quanto la placentation umana ha le sue caratteristiche uniche rispetto ad altri mammiferi eutermici. Ad esempio, la placenta umana invade profondamente il decidua con alcune cellule trofoblaste che raggiungono almeno il terzo interno del miometrio uterino mentre altre cellule rimodellano le arterie a spirale uterina. Anche i nostri antenati evoluzionari più vicini, i primati non umani, mostrano d....

Protocollo

Tutti gli embrioni umani sono stati donati con il consenso per l'uso nella ricerca. I protocolli per la coltura estesa degli embrioni umani sono stati approvati dal Western Institutional Review Board (studio n. 1179872) e seguono le linee guida internazionali. Qualsiasi uso di embrioni umani deve essere riesaminato dagli organi etici e di governo competenti associati all'istituto di ricerca che utilizzano il presente protocollo.

1. Preparazione

1. Preparare i supporti e le piastre di recupero un giorno prima del riscaldamento degli embrioni in una cappa sterile a flusso laminare.
   1. Preparare 2 mL di supporti di coltura blastoci....

Risultati

Gli embrioni sani hanno mostrato una proliferazione continua nel corso della coltura estesa (Figura 2B). Gli embrioni anomali cominciarono a ritrarsi dai loro bordi esterni e disintegrarsi (Figura 2C). Dalla nostra esperienza, circa il 75% degli embrioni è stato attaccato al fondo del piatto rivestito di fibronectina a 48 h e l'attaccamento è aumentato a circa il 90% da 72 h in coltura. Il successo dell'attaccamento degli embrioni può essere ampiamente influenza.......

Discussione

Lo sviluppo del protocollo per la coltura degli embrioni umani attraverso l'impianto ha permesso agli scienziati di esplorare un tempo precedentemente inesplorate nello^{sviluppo 8,9}. Qui, usiamo un sistema di coltura esteso per colturare gli embrioni umani e studiare la differenziazione trofoblasto precoce prima della formazione della placenta villous. I metodi descritti qui ci permettono di raccogliere diverse sottolinea TB da utilizzare nell'analisi a cella sing.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa sterile NORM JECT Luer Lock	VWR	53548-019	Confezione da 100
incubatori a CO2 con rivestimento d'acqua 3130 o 3110 Forma Serie II	Thermo Fisher Scientific	13-998-078
Piatto per coltura tissutale Corning Primaria da 35 mm	VWR	62406-038	Confezione da 500
provette con tappo a scatto	VWR	60819-295	Confezione da 25
tessuti Corning Primaria da 60 mm piatto di coltura	VWR	25382-687	Cassa da 200
piatto a 6 pozzetti	Agtech Inc.	D18	Confezione da 1, 10 o 50
soluzione di Tyrode acido	Millipore Sigma	T1788	100 mL
Biotix 1250 µ L puntali per pipette	VWR	76322-156	Confezione da 960
Blast, terreno di coltura per blastocisti	Origio	83060010	10 mL
Soluzione di diluizione	Kitazato	VT802	1 x 4 mL
Monouso in vetro borosilicato Pasteur Pipets	Thermo Fisher Scientific	1367820D	5.75 in. (146 millimetri); 720/Cs
Dulbecco's Phosphateed Buffered Saline	Millipore Sigma	D8537
Olio di paraffina per colture embrionali OvOil	Vitrolife	10029	100 mL
Provette Eppendorf PCR 0,2 mL	VWR	47730-598	Confezione da 1.000
provette Eppendorf PCR 0,5 mL	VWR	89130-980	Confezione da 500
Fibronectina da plasma umano. Soluzione liquida .1%	Millipore Sigma	F0895	1 mg
Gilson 1 mL Pipetteman	Thermo Fisher Scientific F123602G		1 Pipetteman 200-1000 &; L
Gilson 20 µ L Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 2-20 µ L
Gilson 200 µ L Pipetteman	Thermo Fisher Scientific	F123602G	1 Pipetteman 50-200 &; L
G-MOPS Mezzi di manipolazione	Vitrolife	10129	125 mL
Terreni di manipolazione	Origio	83100060	60 mL
Ibidi 8 vetrini coprioggetto a camera pozzettistica	Ibidi	80826	15 vetrini per scatola
IVC1/IVC2	Sistemi di guida cellulare	M11-25/ M12-25	Aliquote da 5-5 mL
K System T47 Piastra riscaldante	Cooper Surgical	23054
MilliporeFiltri per siringhe sterili Sigma Millex con membrana Durapore PVFD	Fisher Scientific	SLGVR33RS	Confezione da 50
boccagli	IVF Store	MP-001-Y	100 pezzi
Oosafe piatto per pozzetti centrali	Oosafe	OOPW-CW05-1	Confezione da 500
Quinn's Advantage SPS	Origio	ART-3010	12x 12 mL
Tubo in lattice di gomma per boccagli	Negozio IVF	IVFS-NRL-B-5	5 piedi.
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ1270
Punte per estrattore	Cooper Surgical	MXL3-275	20/pk 275 µ m
Soluzione di scongelamento	Kitazato	VT802	2 x 4 mL
The Stripper Micropipetter	Cooper Surgical	MXL3-STR
TrypLE Express Enzyme (1X), senza rosso fenolo	Thermo Fisher Scientific 12604013		1 x 100 mL
Tween20	Millipore Sigma	P1379-25ML	25 mL flacone
VWR 1-20 &; L puntali per pipette	VWR	76322-134	Confezione da 960
VWR 1-200 & micro; L puntali per pipette	VWR	89174-526	Confezione da 960
Soluzione di Lavaggio	Kitazato	VT802	1 x 4 mL