Summary
We beschrijven hier een protocol om eiwit-eiwit interacties te karakteriseren tussen twee zeer verschillend uitgedrukte eiwitten in levende Pseudomonas aeruginosa met behulp van FLIM-FRET metingen. Het protocol omvat bacteriën stam constructies, bacteriën immobilisatie, beeldvorming en post-imaging data-analyse routines.
Abstract
Eiwit-eiwit interacties (PPR's) controleren verschillende belangrijke processen in cellen. Fluorescentie levensduur beeldvorming microscopie (FLIM) in combinatie met Förster resonantie energieoverdracht (FRET) bieden nauwkeurige informatie over PPR's in levende cellen. FLIM-FRET vertrouwt op het meten van het fluorescentielevensverval van een FRET-donor op elke pixel van het FLIM-beeld, met kwantitatieve en nauwkeurige informatie over PPR's en hun ruimtelijke cellulaire organisaties. We stellen hier een gedetailleerd protocol voor voor FLIM-FRET-metingen dat we hebben toegepast om PPR's in levende Pseudomonas aeruginosa te monitoren in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten uitgedrukt met zeer verschillende kopienummers om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR's. Dit protocol beschrijft in detail alle noodzakelijke stappen voor PPI-karakterisering - van bacteriële mutantconstructies tot de eindanalyse met behulp van recent ontwikkelde tools die geavanceerde visualisatiemogelijkheden bieden voor een eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens.
Introduction
Eiwit-eiwit interacties (PPR's) controleren verschillende belangrijke processen in cellen1. De rollen van PPR's verschillen op basis van eiwitsamenstelling, affiniteiten functies en locaties in cellen2. PPR's kunnen worden onderzocht via verschillende technieken3. Co-immunoprecipitatie is bijvoorbeeld een relatief eenvoudige, robuuste en goedkope techniek die vaak wordt gebruikt om PPR's te identificeren of te bevestigen. Het bestuderen van PPR's kan echter een uitdaging zijn wanneer de interactieve eiwitten lage expressieniveaus hebben of wanneer de interacties van voorbijgaande aard zijn of alleen relevant zijn in specifieke omgevingen. Het bestuderen van PPR's tussen de verschillende enzymen van het pyoverdinepad in P. aeruginosa vereist dat de onderdrukking van de algemene ijzer-co-factored repressor Fur wordt verlicht om de expressie van alle eiwitten van het pyoverdinepad in cel4,5,6te laten uitdrukken . Deze gemeenschappelijke regulatie voor alle eiwitten van het traject resulteert in tijdige expressies in de cel naar verwachting hun interacties te bevorderen. De diversiteit in termen van grootte, aard, expressieniveaus en het aantal eiwitten van deze metabole route maken het moeilijk om te bestuderen in gereconstitueerde systemen6. Het verkennen van PPR's in hun cellulaire omgeving is daarom van cruciaal belang om de biologische functies van eiwitten in hun eigen context verder te begrijpen.
Slechts enkele methoden, waaronder fluorescentie, maken het verkennen van PPR's in levende cellen7mogelijk. Onder de verschillende fluorescentie parameters die kunnen worden gemeten, de fluorescentie levensduur (dat wil zeggen, de gemiddelde tijd een fluoroforie blijft in zijn opgewonden toestand voor het uitzenden van een foton) is waarschijnlijk een van de meest interessante parameters te verkennen in levende cellen. De fluorescentieleven van een fluorofoër is zeer gevoelig voor zijn omgeving en FLIM kan daarom chemische of fysische informatie verstrekken over de fluorofoëromgeving8. Dit omvat de aanwezigheid van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) die kan optreden in aanwezigheid van een "acceptor" van fluorescentie op korte afstand van een fluorescentie "donor". Energieoverdracht resulteert in een aanzienlijke verkorting van de donorfluorescentieleven(figuur 1A),waardoor Fluorescentie Lifetime Imaging Microscopie (FLIM) een krachtige benadering is om eiwit-eiwitinteracties rechtstreeks in levende cellen te verkennen. FLIM kan bovendien ruimtelijke informatie verstrekken over waar de interacties plaatsvinden in de cellen7,8. Deze aanpak is zeer krachtig voor het onderzoeken van PPR's in situaties waarin het labelen met fluoroforen van de twee interactiepartners mogelijk is.
Om fret te laten optreden - kritieke omstandigheden op de afstand tussen twee fluoroforen zijn vereist8,9. De twee fluoroforen mogen niet meer dan 10 nm van elkaar verwijderd zijn. Daarom moet worden gewaarschuwd bij het ontwerpen van FLIM-FRET-experimenten om ervoor te zorgen dat de donor en de acceptor van fluorescentie een kans hebben om zich dicht bij elkaar te bevinden in het interagerende complex. Hoewel dit lijkt misschien beperkend, het is in feite een echt voordeel als de afstand-afhankelijkheid van FRET zorgt ervoor dat twee geëtiketteerde eiwitten ondergaan FRET moeten fysiek interageren (Figuur 1A). De moeilijkheden bij het verkrijgen van duidelijke antwoorden over PPI in colocalisatie-experimenten (twee gekoloniseerde eiwitten kunnen niet noodzakelijkerwijs op elkaar inwerken) zijn daarom geen probleem met FLIM-FRET.
Figuur 1: FLIM-FRET-analyseprincipe. Elke pixel van de FLIM-FRET multidimensionale afbeelding bevat informatie over het fluorescentieverval dat op deze specifieke locatie is geregistreerd (#counts = aantal gedetecteerde fotonen in het kanaal t). (A) De klassieke weergave van de FLIM afbeelding is meestal een false-color levensduur gecodeerde 2D-afbeelding (links). Een afname van de gemiddelde fluorescentieleven van de donor - zoals blijkt uit een verandering in de kleurschaal - kan worden waargenomen in aanwezigheid van FRET en is informatief over de aanwezigheid van PPR's in dit ruimtelijk gebied. (B) Overlap tussen het donoremissiespectrum en het acceptorabsorptiespectrum is noodzakelijk om FRET te kunnen voorkomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Een tweede vereiste voor FRET is dat het emissiespectrum van de donor en de absorptiespectra van de acceptor elkaar overlappen8 (figuur 1B). De fluorescentie excitatie van de donor moet op golflengten die zeer weinig bijdragen aan de directe fluorescentie excitatie van de acceptor. Niet alle combinaties van fluoroforen zijn mogelijk en we raden bovendien aan om bij voorkeur donoren met monoexponentiele fluorescentieverval te gebruiken om FLIM-FRET interpretaties te vergemakkelijken10. Verschillende paren van fluorescentie eiwitten voldoen aan deze eisen, waaronder de populaire eGFP-mCherry paar11 (voor een overzicht van het palet van beschikbare fluorescerende eiwit FRET paren zie12,13).
FLIM-FRET maakt het meten van de fluorescentie levensduur verval van een FRET donor op elke pixel van een FLIM beeld(Figuur 1A). Er zijn twee belangrijke technieken om fluorescentieleven te bepalen die verschillen in acquisitie en analyse: frequency-domain (FD)14 en time-domain (TD). TD FLIM is meer verspreid en wordt uitgevoerd met behulp van een gepulseerde verlichting in combinatie met verschillende mogelijke detectie configuraties, waaronder gating methoden15, streak camera16 of time-gecorreleerd single photon tellen (TCSPC) technieken8. Voor zowel FD- als TD-technieken wordt de fluorescentieleven niet direct gemeten, maar vereist een analyse van de gemeten gegevens om de levensduur(en) of de aanwezigheid van interacties te schatten. Voor TCSPC-technieken is de meest gebruikte analyse gebaseerd op het aanbrengen van het verval met enkele of meerdere exponentiële functies met behulp van de minst vierkante iteratieve re-convolutions die de gewogen som van de resten minimaliseren.
Ten slotte kan FLIM-FRET zowel met behulp van enkele foton of multiphoton excitaties worden uitgevoerd. De nieuwste hebben verschillende voordelen, zoals het verminderen van autofluorescentie en fotodamage uit het brandpuntsvlak. Multiphoton excitaties maken ook een langere excitatie diepte mogelijk als het werken in dikke 3D-monsters8. Integendeel, enkele foton excitatie is meestal efficiënter als de twee-foton absorptie dwarsdoorsnedes van fluorescerende eiwitten zijn beperkt17.
Hier stellen we een protocol voor voor FLIM-FRET-metingen van PPR's in levende P. aeruginosa in het specifieke geval van twee interagerende eiwitten (PvdA en PvdL) uitgedrukt met zeer verschillende aantallen kopieën om de kwaliteit en robuustheid van de techniek aan te tonen bij het onthullen van kritische kenmerken van PPR's. PvdA en PvdL zijn betrokken bij de biosynthese van Pyoverdine. PvdA is een L-ornithine N5-oxygenase en synthetiseert de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine van L-ornithine door hydroxylation (PvdA) en vervorming (PvdF)18. PvdL is een niet-ribosomale peptide synthese (NRPS) enzym bestaande uit vier modules. De eerste module katalyseert de acyleratie van myristisch zuur. De tweede module katalyseert de activering van L-Glu en de condensatie ervan aan de myristische coA. Vervolgens condenseert de derde module een L-Tyr aminozuur dat vervolgens wordt geïsomeriseerd in D-Tyr. Ten slotte bindt de vierde module een L-Dab (Diaminobutyric acid) aminozuur om het geacyleerde tripeptide L-Glu/D-Tyr/L-Dab6te vormen. PvdL is dus verantwoordelijk voor de synthese van de drie eerste aminozuren van de voorloper van pyoverdine. De interactie van PvdA met PvdL is verrassend omdat PvdL, in tegenstelling tot PvdI en PvdJ, geen module specifiek voor de L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine draagt. Deze interactie suggereert dat alle enzymen die verantwoordelijk zijn voor de pyoverdine precursor biosynthese zijn gerangschikt in grote voorbijgaande en dynamische multi-enzymatische complexen19,20.
In dit rapport leggen we in detail uit hoe we de bacteriestammen kunnen construeren die de twee interactie met eGFP en mCherry-geëtiketteerde eiwitten uitdrukken. We beschrijven ook de voorbereiding van monsters en de omstandigheden voor efficiënte FLIM-FRET-celbeeldvorming. Tot slot stellen we een stapsgewijze zelfstudie voor voor beeldanalyse voor, inclusief een recent ontwikkelde tool die geavanceerde visualisatiemogelijkheden biedt voor eenvoudige interpretatie van complexe FLIM-FRET-gegevens. Met dit rapport willen we niet alleen avontuurlijk, maar de meeste biologen ervan overtuigen dat FRET-FLIM een toegankelijke en krachtige techniek is die in staat is om hun vragen over PPR's rechtstreeks in de inheemse cellulaire omgeving aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmidbouw
- Versterken door twee PCR (PCR1 en 3) de DNA-sequenties (gebruik genomisch DNA van P. aeruginosa PAO1) van de 700 basisparen stroomopwaarts en stroomafwaarts van de regio's die overeenkomen met de invoegplaats in P. aeruginosa genoom met high-fidelity DNA polymerase. Voeg beperkingsplaatsen toe aan primers in blauw en groen en voeg een overlappende volgorde met mCherry toe aan primers in het rood (figuur 2).
- Voor PvdA geëtiketteerd op de C-terminus met eGFP, versterken van de 700 bp regio stroomopwaarts ten opzichte van de stop codon door de primers in blauw, en versterken de 700 bp downstream regio met de stop codon met de primers in het groen.
- Voor PvdL geëtiketteerd op de N-terminus met mCherry, versterken van de 700 bp regio stroomopwaarts naar de PvdL gen, met inbegrip van de start codon, door de primers in blauw, en versterken de 700 bp downstream regio met de primers in het groen.
Figuur 2: Overzicht van de PCR-strategie en de plasmidenconstructie die wordt gebruikt voor de bouw van PvdA-mCherry. Zie tekst voor details - pvdA codeert een enzym dat betrokken is bij de biosynthese van de siderophore pyoverdine, een secundaire metaboliet die betrokken is bij ijzerverwerving. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Versterk het eGFP-coderings-DNA (zonder de start- en stopcodons) met primers in het rood met High-Fidelity DNA polymerase.
- Zuiver de PCR-producten op een PCR-opruimkolom(Tabel van materialen).
- Meng overlappende PCR-producten in equimolar-verhouding en voer een tweede PCR uit met primers met beperkingsplaats die wordt gebruikt voor PCR 1 en 3 (groen en blauw in figuur 2).
- Migreer het PCR-product in agarose-1x TAE (Tris-Base Acetaat EDTA pH 8.0) gel, snijd de bijbehorende band en haal de amplicon met een PCR clean up kit(Table of Materials).
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken. - Digest PCR amplicon en pEXG2 plasmide met behulp van de bijbehorende beperkingsenzymen21.
- Ligate plasmide en invoegen met T4 DNA ligase met behulp van 90 ng van plasmid en moleculaire verhouding 1:1 (plasmid:insert).
- Transformeer plasmidenconstructie in chemisch bevoegde cellen E. coli TOP10 cellen door ligatieproduct en 100 μL TOP10 te mengen. Het bevoegde bacterie/plasmidemengsel gedurende 30 minuten op ijs uitbroeden alvorens 60 s met een hitteschok van 42 °C te gaan. Zet vervolgens de buis 10 minuten in ijs.
- Voeg 1 mL lysogeny bouillon (LB) toe aan de bacterie en broed 1 uur bij 37 °C.
- Plaat 100 μL bacteriën op LB agar met 15 μg/mL gentamicine.
- Incubeer 's nachts bij 37 °C.
- Screen de aanwezigheid van de insert door kolonie PCR: van een geïsoleerde transformant kolonie, pick-up een minuut hoeveelheid bacteriën worden toegevoegd aan een PCR mix met primers hybridiseren op de plasmid op een zodanige wijze dat de aanwezigheid van het amplicon kan worden gedetecteerd door het uitvoeren van het product op een agarose gel (DNA polymerase). Van dezelfde kolonie die voor PCR wordt gebruikt, moet een kleine hoeveelheid bacteriën op een verse plaat met 15 μg/mL gentamicine worden geïsoleerd en gebruikt voor plasmideextractie. Tot slot isoleer en zuiver het plasmide(Tabel van materialen)en verifieer de insert door sequencing.
- Bewaar TOP10-bacteriën die de plasmide in LB bevatten met 20 % glycerol in 1,5 mL microbuis bij -80 °C en de gezuiverde plasmid bij -20 °C in 1,5 mL buis.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken
2. Fluorescerende tag inbrengen in het chromosomale genoom van P. aeruginosa (Figuur 3)
- Grow P. aeruginosa, TOP10 en E. coli helper bacteriën, elk in 5 mL van LB zonder antibioticum op 30 °C onder orbitale schudden 's nachts22. Genereer fluorescerende tag invoeging in het genoom van P. aeruginosa door het overbrengen van de plasmide van E. coli TOP10 in de PAO1-stam en het integreren van de plasmid in het genoom door homologe recombinatie. Een tweede kruising-over gebeurtenis excising de vector genereren de overeenkomstige mutant.
- Meet de optische dichtheid op 600 nm (OD600 nm)van de bacteriecultuur en meng een gelijke hoeveelheid P. aeruginosa (500 μL, OD600 nm = 1,0) met E. coli TOP10 pEXG2 (500 μL, OD600 nm = 1,0) en E. coli HB101 pRK600 helper (500 μL, OD600 nm = 1,0) in 1,5 mL microtube.
- Centrifuge 5 min op 9.300 x g om de bacteriën te pelleteren.
OPMERKING: Online tools kunnen worden gebruikt om centrifugale g-kracht om te zetten in rotatie per minuut (rpm) om de centrifugesnelheid aan te passen. - Houd de bacteriële pellet en gooi de supernatant.
- Resuspend de pellet met bacteriën in 50 μL van LB.
- Plaats een vlek (~50 μL) van het mengsel op het midden van LB agar (verwarm bij 37 °C) en incubeer 5 h bij 37 °C.
- Schrap de plek met een steriele inentingslus en resuspend in 1 mL LB.
- Plaat 100 μL van deze bacteriële suspensie op LB agar met 10 μg/mL chlooramfenicol om E te elimineren. coli (E. coli TOP10 pEXG2 en E. coli HB101 pRK600 helper zijn gevoelig voor chloramphenicol, maar P. aeruginosa is van nature resistent) en 30 μg/mL gentamicine en incubate 2 dagen bij 37 °C.
- Resuspend een kolonie in 1 mL LB en uitbroeden bij 37 °C onder orbitale schudden 4h.
- Centrifuge 3 min bij 9.300 x g en gooi 950 μL supernatant weg. Resuspend de pellet in 50 μL LB en isoleer het mengsel op LB agar met sacharose en zonder NaCl.
- Incubeer 's nachts bij 30 °C.
- Spot geïsoleerde kolonies op LB agar en LB agar met 15 mg/mL gentamicine om de gentamicine gevoeligheid te controleren.
- Controleer de eGFP of mCherry invoeging door PCR kolonies (DNA polymerase) en sequencing met behulp van specifieke primers.
Figuur 3: Protocol voor de bouw van P. aeruginosa-stammen door het inbrengen van fluorescerende markeringen. Zie tekst voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
3. Pyoverdine-meting
- Kweek bacteriën in 5 mL LB bij 30 °C onder orbitale schudden 's nachts.
- Pelletbacteriën door centrifugatie, wassen en telen in 5 mL SM (Succinate Medium, samenstelling: 6 g·L−1 K2HPO4, 3 g·L−1 KH2PO4, 1 g·L−1 (NH4)2 DUS4, 0,2 g·L−1 MgSO4, 7 H2O en 4 g·L−1 natriumsuccinaat met de pH aangepast aan 7,0 door toevoeging van NaOH) bij 30 °C onder orbitale schudden 's nachts. SM is een ijzerarm medium - de afwezigheid van ijzer activeert de expressie van de eiwitten van de pyoverdineroute die normaal gesproken onderdrukt wordt in aanwezigheid van ijzer.
- Meet OD600 nm en verdun bacteriën opnieuw in vers SM medium op OD600 nm = 0,1 en laat ze 's nachts bij 30 °C groeien onder orbitale schudden.
- Meet OD600 nm om de hoeveelheid bacteriën in elk monster te bepalen.
- Bereid een kwarts cuvette met 100 μL P. aeruginosa cultuur en vul aan 1 mL SM (900 μL). Maak een kwarts cuvette met 1 mL SM medium (blanco).
- Met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer meet u de absorptie op het maximum van de absorptiepiek. Bij pH 7.0 zal het maximum aan absorptie van pyoverdine plaatsvinden bij ~400 nm. Bepaal de pyoverdineconcentratie (apovorm) in monster met behulp van de Beer-Lambert-wet met behulp van een molaire extinctiecoëfficiënt op 400 nm e = 19 000 M-1∙cm-1.
OPMERKING: Pyoverdine kan worden gekwantificeerd in het bereik van absorptie van ~0,1 tot ~1 (afhankelijk van UV-zichtbare spectrofotometer) waarin de absorptie lineair toeneemt met concentratie.
4. Bacteriecultuur en -voorwaarden voor cellen om PvdA, PvdL en PvdJ uit te drukken
- Op dag 1, inenting een buis met 5 mL van LB uit de juiste glycerol voorraad van bacteriën en groeien bacteriën 's nachts bij 30 °C bij 200 rpm in een orbitale shaker incubator.
- Op dag 2, pelletcellen door centrifugatie op 3.000 x g gedurende 3 min en gooi de supernatant.
- Resuspend de cellen in 10 mL van SM.
- Herhaal stap 4.2-4.3 eenmaal en kweek bacteriën in SM 's nachts bij 30 °C 200 rpm.
- Op dag 3, verdun 1/10 de bacteriecultuur in verse SM.
- Kweek verdunde bacteriën weer 's nachts onder dezelfde omstandigheden.
OPMERKING: De aanwezigheid van pyoverdine kan visueel worden gedetecteerd als het kleuren in geel-groen de groeiende media. Het toont aan dat de expressie van de eiwitten van de pyoverdine route zijn geactiveerd en dat enzymen van belang worden uitgedrukt in de cellen.
5. Voorbereiding van agarosepad (figuur 4)
- Plaats een microscoop glas-dia op een vlakke horizontale ondergrond. Schik twee glazen dia's met twee lagen plakband aan elke kant van de eerste dia.
OPMERKING: Houd een 1-2 mm ruimte tussen de drie uitgelijnde dia's om te voorkomen dat de meleted agarose uiteindelijk verspreid op de dia's met plakband. - Pipette en giet een druppel van 70 μL van 1% gesmolten agarose op de glazen schuif. Voeg een vierde dia aan de bovenkant toe om de agarosedruppel af te vlakken en druk zachtjes naar beneden. Wacht ongeveer een minuut.
- Neem de bovenste glijbaan af en laat met een pipet ongeveer 3 μL bacteriën vallen op 3 tot 4 plekken op verschillende locaties op het agarosepad.
- Bedek met een microscopie glazen coverslip (bijvoorbeeld een 22x22 mm #1,5 dikte).
LET OP: Vlakheid en dikte van de coverslips zijn belangrijk voor het werken met twee-foton excitaties. Precisie coverslips met gecontroleerde uniforme vlakheid en lage autofluorescentie zijn meestal een goede keuze. - Bevestig de coverslip met gesmolten paraffine om de coverslip op de glazen schuif te verzegelen. Begin met het bevestigen van de vier hoeken van de coverslip.
Figuur 4: Agarose pad voorbereiding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
6. Beeldvorming met een twee-foton microscopie setup
OPMERKING: We gebruiken een zelfgemaakte twee-foton excitatie scannen omgekeerde microscoop met een 60x 1.2NA water onderdompeling objectieve werking in de-gescande fluorescentie collectie modus. Twee-foton excitatie golflengte is ingesteld op 930 nm. Het wordt geleverd door een Ti:Sapphire laser (80 MHz herhalingssnelheid, ≈ 70 fs pulsbreedte) werken op 10-20 mW. Fluorescentie fotonen werden verzameld door middel van een 680 nm short pass filter en een 525/50 nm band-pass filter alvorens te worden gericht op een vezel-gekoppeld lawine foto-diode aangesloten op een tijd-gecorreleerde single photon tellen (TCSPC) module. De microscoop is ook uitgerust met een transmissie fluorescentielamp. Verschillende FLIM-FRET microscopen zijn nu commercieel beschikbaar en veel imaging faciliteiten zijn uitgerust met opstellingen in staat om FLIM-FRET metingen uit te voeren.
- Gebruik de fluorescentielamp om de doelstelling te richten op de monolaag van bacteriën in het monster en selecteer gebieden van belang.
- Controleer of de excitatie laser sluiter gesloten is en dat het infrarood licht afkomstig van de laser is geblokkeerd en niet in de microscoop.
Let op: Zorgvuldige aandacht en constante waakzaamheid moet worden gegeven werken met IR gepulseerde lasers als het laserlicht kan niet worden gezien door de ogen, maar een en zelfs voorbijgaande directe expositie of laser reflectie kan zeer schadelijk zijn en leiden tot onomkeerbare oogschade. Raadpleeg de lokale laserveiligheidsprocedures en training voordat u microscopieopstellingen gebruikt. - Plaats de microscopie schuif op het podium met de coverslips naar het doel.
- Controleer of de fluorescentielamp aan is.
- Draai de filterkubustoren om de eGFP-kubus te selecteren en open de sluiter van de fluorescentielamp.
- Stuur het fluorescentielicht naar het oculair van de microscoop.
Let op: Zorg ervoor dat de juiste filters worden verwijderd in het lichtpad om direct excitatielicht van de fluorescentielamp weg te gooien dat de ogen kan beschadigen. - Focus het doel op bacteriën met behulp van de microscoop knop.
- Selecteer een gebied van belang in het monster door deze te vertalen met behulp van de joystick die de gemotoriseerde fase regelt
OPMERKING: Scherpstellen is gemakkelijker met een zeer fluorescerend monster waardoor de fluorescentie direct met de ogen kan worden gezien. - Schakel de excitatie voor de 2PE laser voor FLIM-FRET metingen.
- Stuur het fluorescentieemissiepad terug naar de detector.
- Draai de filterkubustoren terug om te selecteren voor de dichroic kubus voor de 930 nm laser.
- Stel het laservermogen in op 20 mW.
- Stel de grootte van het interessegebied in op 30 μm. Deze bewerking past de spanning aan die de galvospiegels werkingt en definieert het bereik van hun bewegingen (figuur 5).
- Schakel de detector in en begin met het scannen van het monster - de start- en stopknoppen die het scannen regelen, regelen ook het openen en sluiten van de lasersluiter, zowel om veiligheidsredenen als om de fotobleaching van het monster te beperken (figuur 5).
Figuur 5: Schematische weergave van de interface van microscoopbesturingssoftware. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Pas indien nodig de focus aan door de fijne focusknop van de microscoop enigszins te bewegen.
- Kies het gezichtsveld voor beeldvorming door de fase van de computerinterface fijn te verplaatsen. Dit kan worden gedaan op de setup door het verplaatsen van het kruis op het beeld in de microscoop controle software (Figuur 5) die het nieuwe centrum van het beeld zal definiëren en te drukken Move Stage. Een goed gezichtsveld voor acquisitie komt overeen met een afbeelding met 10-30 immobiele bacteriën, allemaal correct gericht (alle bacteriën bevinden zich op hetzelfde vlak). Als u geïnteresseerd bent in het extraheren van single cells FLIM-FRET-gegevens, zorg er dan voor dat bacteriën goed geïndividualiseerd zijn (beeldsegmentatie zal veel gemakkelijker zijn).
- Open de SPCM-software (commerciële software voor gegevensverwerving) en controleer of de aantalfotonen niet te hoog is om een opstapeleffect te voorkomen dat levensmetingen kan beïnvloeden. Verlaag indien nodig de laserintensiteit om de fotontelling laag te houden (ongeveer 1% van de laserherhalingssnelheid).
OPMERKING: Pile-Up effect beschrijft de effecten van fotonen verloren bij hoge foton tellen tarieven als gevolg van de dode tijd van de Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) apparaten. Als Pile-Up optreedt, wordt de gemeten gemiddelde levensduur kunstmatig korter met mogelijk een extra kortere component die in het verval kan verschijnen als gevolg van de oversampling van de snel emitterende fotonen. - Pas acquisitieparameters aan, waaronder de aankoopverzamelingstijd (meestal zijn 60 s tot 180 s vereist om voldoende fotonen te verzamelen).
- Druk op de startknop en wacht tot de overname is voltooid.
- Sla de gegevens op.
- Stop met het scannen van het monster en schakel de detector uit.
- Selecteer een ander gezichtsveld in voorbeeld en herhaal stappen 6.14-6.22 of afbeelding een nieuwe microscopiedia door stap 6.1-6.22 te herhalen.
OPMERKING: P. aeruginosa kan tot 6-8 uur leven en delen bij kamertemperatuur op het agarosepad (wat overeenkomt met eindelijk ~ 4 verdubbelingstijd bij 20°C). Wacht idealiter niet te lang met FLIM-FRET-meting om te voorkomen dat een pad volledig bedekt met bacteriën wordt waargenomen.
7. Gegevensanalyse
Figuur 6: Hoofdpaneel van het venster voor gegevensanalyse van SPCImage-software. Intensiteit beeld (blauwe doos), levensduur beeld (paarse doos), levensduur histogram (rechtsboven), verval curve op geselecteerde positie (groene doos), en verval parameters op geselecteerde positie (cyaan doos) van een representatieve PvdA-eGFP verval opgenomen in live P. aeruginosa met behulp van een bh SPC830 acquisitie kaart op een zelfgemaakte Two-Photon Excitation-FLIM-FRET setup. De experimentele vervalcurve van de pixel die in de bovenstaande afbeelding is gericht, de mono-exponentiële pasvorm (rode curve) die het verval van de berekende instrumentale responsfunctie (groene curve) deconvoluteert, is te zien in het groene paneel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Basisanalyse
- Voer de SPCImage-software uit.
- Het opgeslagen SPCM-bestand importeren. De intensiteitsafbeelding wordt weergegeven op het linker bovenpaneel van de software(figuur 6 blauwe doos).
- Bestudeer het venster vervalcurve(Afbeelding 6 groen vak) waarin de vervalgegevens worden weergegeven die overeenkomen met de pixel die is geselecteerd in de intensiteitsafbeelding(figuur 6 blauw vak). De fotonnummers van elk keer kanaal worden weergegeven als blauwe stippen en de pasvorm van het verval wordt getekend als een rode lijn. Houd er rekening mee dat de software na het laden van de gegevens de helderste pixel van de afbeelding weergeeft. Verplaats het blauwe kruis over de afbeelding om pixels met een lagere intensiteit te onderzoeken. Het vervalvenster wordt automatisch vernieuwd op elke nieuwe pixelpositie.
OPMERKING: Het meten van de Instrumental Response Function (IRF) van een laserscansysteem is erg moeilijk. Een IRF berekend vanaf de stijgende rand van de fluorescentie verval bochten in de FLIM gegevens kunnen worden gebruikt voor verval deconvolutie. Dit is de optie die standaard wordt gedaan in SPCimage(figuur 6 groene curve). - Pas het montagebereik aan door de start- en eindkanalen van de montagebox (T1 en T2 in de groene doos) te verplaatsen. T1 moet beginnen bij de eerste paar kanalen van het stijgende verval en T2 definiëren het laatste kanaal aan het einde van het verval en kan worden gekozen als een van de laatste kanalen van het verval met een aantal fotonen boven de fotonen tellen offset (dat wil zeggen, de niveaus van fotonen geteld voordat het verval stijgt).
- Kies de binning door de waarde Bin te wijzigen. Het curveverval integreert het foton tellen van de geselecteerde pixel samen met een gebied van i pixels rond de cursor positie gedefinieerd door de bin parameter (het verhogen van de binning zal het aantal fotonen in het verval te verhogen en kan nuttig zijn om de foton telt die nodig zijn voor multi-exponentiële modellen te bereiken).
- Pas de waarde Drempelwaarde aan. Pixels die niet ten minste één kanaal hebben met een aantal fotonen hoger dan de drempelwaarde, worden niet opgenomen in de montageprocedure. Natuurlijk hoe hoger het aantal pixels te passen, hoe langer de analyse.
OPMERKING: FLIM-gegevens kunnen een enorm aantal pixels en tijdkanalen bevatten. De laatste versies van de software maken het gebruik van GPU (Graphics Processor Unit) mogelijk om een groot aantal pixels parallel te verwerken, wat de verwerkingstijden enorm verkort. Het kan interessant zijn om de binning- en drempelparameters aan te passen met afbeeldingen die overeenkomen met bacteriënconstructies die de laagste fluorescentieintensiteit vertonen (bijvoorbeeld met bacteriële stammen met de laagste expressieniveaus). Dit zal ervoor zorgen dat de relevante verval waargenomen in deze monsters zal voldoen aan de filtercriteria en zal worden opgenomen in de analyse. Deze parameters kunnen vervolgens worden gebruikt voor alle afbeeldingen. - Pas indien nodig de vervalparameters (cyaandoos) aan. Laat de verschuiving variëren, de meeste van de tijd verstrooiing en offset kan worden vastgesteld op nul als een blik op het verval functies laten zien dat hun bijdrage te verwaarlozen is. De offset kan worden geschat kijken naar de eerste kanalen van het verval - merk op dat de beeldvorming voor een lange tijd als gevolg van lage fluorescentie in het monster resulteert meestal in niet-nul offset. Verstrooiing vindt meestal plaats in dikke monsters en kan anders als verwaarloosbaar worden beschouwd.
- Voordat u de pasvorm uitvoert, selecteert u het montagealgoritme. Open het venster algoritmeinstellingen in Modelopties weergeven/verbergen. Selecteer het MLE-algoritme (Maximum likelihood estimation)(figuur 7A).
- Voer de montage van de afbeelding uit door op | vervalmatrix te klikken. Eenmaal voltooid, de levensduur gecodeerd flim afbeelding wordt weergegeven in de levensduur afbeelding paneel(Figuur 6 paars vak).
OPMERKING: Op het venster vervalcurve(afbeelding 6 groen vak) is het mogelijk om de levensduurwaarde te zien die overeenkomt met elke pixel van de afbeelding door het blauwe kruis te verplaatsen.
LET OP: om een groot aantal vergelijkbare FLIM-gegevensbestanden automatisch te verwerken, kan een batchverwerkingsmodus worden gebruikt. - Controleer de kwaliteit van de pasvorm kijken naar de resten (idealiter willekeurig verdeeld rond 0) en een Chi vierkante waarde dicht bij 1.
- Ingerichte gegevens kunnen in verschillende formaten worden geëxporteerd. Als u bestanden in txt-bestanden wilt exporteren, gaat u naar Bestand | Export. Kies Alles selecteren in het venster Opties exporteren (Figuur 7B)en klik vervolgens op Exporteren.
- Sla ten slotte het analysebestand op. Analysebestanden worden opgeslagen als *.img-bestanden en kunnen direct worden heropend in SPCImage.
OPMERKING: In bijzondere gevallen van onevenwichtige donor/acceptorhoeveelheden kan FLIM-FRET subpopulaties onthullen in een mengsel van interactief eiwitcomplexen - met name wanneer de concentraties van de twee partners zeer verschillend zijn, wat resulteert in mengsels van complexe en vrije soorten. Niet-interagerende soorten (gekenmerkt door een verval dat sterk lijkt op het bederf van de donor) kan worden gediscrimineerd van interactie die een ruimtelijke invariantie van de donorlevenscomponenten in de gegevensset aannemen. Evenzo kunnen zich niet-stoichiometrische interactiecomplexen met meer donoren of meer acceptorescentie vormen. De fluorescentie vervalt van dergelijke complexen zijn meestal moeilijk te interpreteren. Een FLIM diagram plot kan worden gebruikt om kritische informatie over stoichiometrie en bindende modus van PPR's20,23. De FLIM diagram plot is een grafische weergave van de kortste levensduur component als functie van de amplitude. Het kan worden gebruikt om pixels te visualiseren met vergelijkbare vervalhandtekeningen. Om dergelijke voorstellingen te tekenen, experimentele fluorescentie verval moet worden uitgerust met een twee exponentieel model. De volgende stappen kunnen een leidraad zijn voor dit proces. - Begin met het analyseren van de gegevens van de donor alleen constructie. Het zal het mogelijk maken het bepalen van de levensduur waarde van de donor. In het ideale gewill meet deze waarde over meerdere beelden die zijn opgenomen in dezelfde omstandigheden als de donor/acceptorconstructies om een robuuste levensduurwaarde voor de donor op te halen.
- Eenmaal bepaald, past de fluorescentie verval van donor / acceptor constructies met een twee-exponentiële model. Stel in het parametervak cyaanverval (figuur 6) het aantal componenten in op 2. Fix t2(ps) parameter to the robust lifetime value of the donor determined in step 1 and check the box to fix this parameter.
OPMERKING: Het is belangrijk om de langlevende levensduur vast te stellen τ2 om over-fitting te beperken, om de montageconvergentie te verbeteren en om betrouwbaardere twee-exponentiële pasvormparameters24,25,26te verkrijgen . - Sla het *img-bestand op en exporteer gegevens als *.asc-bestanden zoals in stap 7.1.11.
Figuur 7: (A) Algoritme-instellingen voor het monteren van de vervalsingen met exponentiële modellen. Het selecteren van MLE (algoritme met maximale waarschijnlijkheid of schatting van maximale waarschijnlijkheid, MLE) als het venster Geschikte model en (B) exportopties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
- Geavanceerde analyse van de FLIM beelden in R
- Installeer indien nodig R (https://cran.r-project.org) en RStudio (https://rstudio.com).
- Open RStudio en maak een nieuw project.
- Alle analyse *.asc-bestand verplaatsen in een map met de naam "gegevens" in de hoofdmap van het project.
- Open een nieuw scriptbestand (of open het aanvullende script FLIM_analysis. R).
- Installeer het speciale flimDiagRam-pakket voor flim data-analyse https://github.com/jgodet/flimDiagRam. Bel het pakket in de werkruimte. (Zie de mededeling HowTo_FlimDiagRam)
LET OP: De installatie van pakketten hoeft slechts één keer te gebeuren. Eenmaal geïnstalleerd, kunnen pakketten worden opgeroepen vanuit elke nieuwe R-sessie. Het downloaden van R-pakketten van github vereist het installeren van 'devtools' pakket. De installatie van 'devtools' kan enkele minuten duren. Het flimDiagRam-pakket kan worden gebruikt om de parameters en distributies van de FLIM-gegevens weer te geven, FLIM-gegevens te extraheren op het niveau van afzonderlijke geïndividualiseerde cellen, om FLIM-resultaten over omstandigheden of stammen te vergelijken en FLIM-gegevens te verkennen met behulp van geavanceerde visualisatietools zoals de FLIM-diagramplot. - Gebruik de stapsgewijze commentaarcode en de gegevens worden beschikbaar gesteld om alle subcijfers die in de sectie Representatieve resultaten worden gepresenteerd, onafhankelijk te reproduceren. Deze tutorial is te vinden in de mededeling HowTo_FlimDiagRam op https://github.com/jgodet/flimDiagRam/blob/master/HowTo.pdf. De code kan eenvoudig worden omgezet om de gegevens te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Empirische cumulatieve verdelingsfuncties (ecdf) van de fluorescentielevensduur gemeten voor de verschillende bacteriestammen worden weergegeven in figuur 8. Als FRET optreedt, worden de ecdfs verschoven naar de kortere levensduur(figuur 8A,8B). Merk op dat wanneer de interactie van de twee eiwitten resulteert in een lange afstand tussen de twee fluoroforen, geen FRET kan optreden(figuur 8C). Deze situatie kan niet worden onderscheiden van het ontbreken van interactie tussen de twee partners in FLIM. Het is daarom belangrijk, wanneer inter-dye afstand niet kan worden voorspeld van moleculaire modellen of bekende architecturen van het complex, om te overwegen etikettering van de eiwitten op verschillende posities om de kansen om de interactie sonde te maximaliseren. Ook door het grote verschil in eiwitexpressies tussen PvdA (zeer uitgedrukt) en het niet-ribosomale peptide synthetase PvdL (weinig kopieën per cel) leidt hetzelfde PvdA/PvdL-complex niet tot vergelijkbare FLIM-FRET-gegevens. Onevenwichtige stoichiometrie kan de interpretatie van FLIM-FRET-gegevens zelfs bemoeilijken. Afhankelijk van welk eiwit bij de donor wordt geëtiketteerd, leiden onevenwichtige stoichiometrie tot verschillen in de bijdrage van de vrije in vergelijking met de gebonden met een donor geëtiketteerde eiwitten in de geregistreerde fluorescentielevensverdeling (figuur 8A,8B).
Figuur 8: Illustratie van veranderingen die zich voordoen in de donor gemiddelde fluorescentie levenslange verdeling in reactie op FRET (enkele exponentiële model). Vertegenwoordiging van de interacties van PvdL (grijze vorm) met PvdA (blauwe vorm) (A en B) of PvdJ (gele vorm) (C) eiwitten gelabeld met eGFP (groen) of mCherry (rode) fluorescerende eiwitten. De empirische cumulatieve distributiefuncties (lagere grafieken) kunnen duidelijk de verschillen tussen de fluorescentielevensverdelingen benadrukken. (A) In aanwezigheid van een overmaat aan PvdA gelabeld met de donor van fluorescentie, wordt de gemiddelde levenslange verdeling van eGFP-donoren gedomineerd door donoren die geen FRET ondergaan, maar ook de levensduur integreren van de weinige donoren die FRET ondergaan met mCherry-PvdL. In deze situatie is de levenslange verdeling van het mengsel (groen-oranje curve) dicht bij de levenslange verdeling van hetzelfde mengsel gevormd met niet-gelabelde PvdL alleen (groene curve). (B) Als de volgorde van de etikettering wordt gewijzigd en een teveel aan PvdA-gelabeld met acceptoren aanwezig is, wordt de gemiddelde levenslange verdeling geregeld door de overbrengende soorten, met inbegrip van eventueel donoren die FRET ondergaan met meerdere acceptoren (oranje curve). Deze verdeling is dus heel anders dan hetzelfde complex gevormd met niet-gelabelde PvdA (groene curve). (C) Als er geen FRET optreedt omdat eiwitten niet interageren of omdat de interverf dye afstand in het complex te groot is, zijn veranderingen in de levenslange verdeling bijna superimposeerbaar voor die van de donor alleen (vergelijk de lichtgroene curve die overeenkomt met de fluorescentielevensverdeling van de PvdJ-eGFP/mCherry-PvdL met de groene curve die overeenkomt met PvdJ-eGFP). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De diagramplot kan worden gebruikt om kritieke informatie te verstrekken over de stoichiometrie zoals te zien in figuur 9. In de PvdA-eGFP/mCherry PvdL mutant, de hoeveelheid donor-geëtiketteerd PvdA is veel hoger dan de hoeveelheid mCherry PvdL. Van alle donoren aanwezig in de steekproef, slechts een paar van hen zijn interactie met PvdL. In tegenstelling tot de gemiddelde FLIM waarde verdeling, de FLIM diagram plot geeft alleen de specifieke informatie in het verval component van de donoren ondergaan FRET. In figuur 9Akan een enkele tau1-waarde worden waargenomen die is gecentreerd op ~ 2,3 ns, wat neerkomt op ongeveer 30-40% van de soorten in het mengsel. De enkele tau1-waarde suggereert dat elke PvdA-eGFP-donor slechts met één mCherry PvdL-acceptor kan overstappen.
Van de omgekeerde etikettering (PvdA-mCherry/eGFP PvdL) wordt verwacht dat de meeste eGFP PvdL-eiwitten in wisselwerking staan met PvdA-mCherry, vanwege het lage aantal PvdL ten opzichte van PvdA. Dit wordt bevestigd door de alfa1-waarden die worden verschoven naar hogere waarden. Bovendien werden de tau1-waarden veel meer verdeeld (figuur 9B) met de verschijning van kortlevende soorten met levens zo laag als ~ 1,5 ns. Dit suggereert dat er extra overdrachten plaatsvinden in vergelijking met de situatie in figuur 9A en dus dat meerdere PvdA-eiwitten zich kunnen binden aan één PvdL-eiwit. Als gevolg hiervan zal de levensduur van de EGFP voor elk complex afhangen van het aantal en de distributie van mCherry-eiwitten waarmee eGFP energie overdraagt. Samen suggereren de gegevens dat elk PvdL-eiwit kan interageren met meerdere PvdA-eiwitten
Figuur 9: FLIM-diagramkloten in geval van overmaat van donoren (A) of acceptoren (B) en meerdere bindende sites. De FLIM diagram plot geeft de specifieke informatie in het verval component van de donor ondergaan FRET opgehaald met behulp van een twee-exponentiële pasvorm. In de PvdA-eGFP/mCherry-PvdL mutant (A), een enkele tau1 waarde wordt waargenomen en de amplitude gegeven door de verspreide positie van de gegevens punten op de horizontale as is informatief over de bevolking van donoren die betrokken zijn bij FRET. In het PvdA-mCherry/eGFP-PvdL-systeem(B)zijn de tau1-waarden veel meer verdeeld, wat aangeeft dat één PvdL-eiwit (grijze vorm) kan interageren met meerdere PvdA-eiwitten (blauwe vorm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FLIM-FRET biedt een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van op intensiteit gebaseerde FRET-beeldvorming. Fluorescentie leven is een intrinsieke parameter van de fluorofoër. Als gevolg hiervan is het niet afhankelijk van lokale concentraties fluoroforen, noch van de intensiteit van de lichte excitatie. De fluorescentieleven wordt bovendien ook slecht beïnvloed door foto-bleken. Het is vooral interessant om ppr's te bewijzen in cellen waar de concentraties van lokale eiwitten zeer heterogeen kunnen zijn in de subcellulaire compartimenten of regio's. FLIM-FRET is ook interessant in alle situaties waar de concentratie van complex laag is omdat de expressieniveaus van zowel eiwitten als van een van de eiwitten laag zijn.
In het kader van PPR's zijn de FRET-mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de verkorting van de levensduur en dus informatie over de aard van de interacties moeilijk af te leiden, gezien alleen de gemiddelde levensduur. Een verkorting van de gemiddelde levensduur kan te wijten zijn aan een groot deel van de soorten die interageren met matige FRET, of aan de andere kant van een laag percentage donoren dat op korte afstand met de acceptor in wisselwerking staat. Deze situatie is nog ingewikkelder wanneer complexen met onevenwichtige stoichiometries vormen. Grafische visualisatietools die de weergave van verschillende dimensies mogelijk maken (in het geval van de diagramplot tau1, alfa en
Kiezen hoe de eiwitten van belang tag is een belangrijk punt voor succesvolle FLIM-FRET experimenten. Het meest kritisch, tags mogen niet wijzigen of wijzigen van de interactie van eiwitten. Helaas, behalve in zeldzame gevallen waarin de structuren van de eiwitten bekend zijn of kunnen worden voorspeld, is men in de meeste gevallen gedwongen om trial-and-error benaderingen. Interpretaties van FLIM-FRET bij afwezigheid van energieoverdracht hebben daarom altijd rekening gehouden met de mogelijkheid dat etiketten de interactie kunnen veranderen. Om deze reden kan FLIM-FRET worden gezien als een bevestigende techniek in die zin dat als een interactie wordt waargenomen, het moet bestaan bij afwezigheid van label. Het verwijderen van een externe functionele uitlezing - zoals het controleren of de productie van pyoverdine door de gemuteerde stammen die dubbel geëtiketteerde eiwitten uitdrukken vergelijkbaar is met stammen van wilde typen - is bijzonder nuttig om FLIM-FRET-resultaten te interpreteren.
Imaging is geen methode voor het opsporen van PPR's met een hoge doorvoer en is tot nu toe misbruikt om verdachte of voorspelde PPR's te bevestigen. In deze bevestigende context is het zinvol om de analyse te pushen om zoveel mogelijk informatie uit de gegevens te halen. Sommige pogingen worden uitgevoerd29,30,31 om FLIM-FRET setups aangepast aan screening strategieën beurt. Het ontwikkelen van geavanceerde gemakkelijk beschikbare en geautomatiseerde analyse zal de mogelijkheid garanderen om de grote hoeveelheid gegevens die door high-throughput screening methoden worden geproduceerd te verwerken. In deze context kunnen montageprocedures met de minst vierkante methoden waarvoor statistieken met een hoog aantal vereisen, slecht worden aangepast om FRET te schatten. Er zijn verschillende alternatieve methoden ontwikkeld16,32, waaronder niet-passende methoden (herzien in Padilla-Parra et al. 2011 33). Deze methoden verschillen in berekeningssnelheid, minimaal aantal fotonen dat nodig is voor een goede analyse, nauwkeurigheid, complexiteit en type gegevens die efficiënt kunnen worden verwerkt. Technieken zoals de minimale fractie van de interactie donor34 of phasor aanpak35,36,37 hebben het potentieel om hoge snelheid acquisities uit te voeren in FRET-FLIM en nog steeds kwantitatief om grote hoeveelheid gegevens te verwerken of zelfs om video-snelheid snelheden te bereiken.
De eis van de bouw van fluorescerend geëtiketteerd eiwit dat niet verstoren de inheemse functies van de eiwitten in cellen is een grote zorg voor het opschalen van de snelheid en het aantal PPI onderzocht. Alternatieve nieuwe etiketteringsstrategieën, bijvoorbeeld gebaseerd op fluorogene sondes met kleine moleculen38,39, kunnen een manier zijn om deze kritische beperking te omzeilen. Het verwijderen van fluorescerende sondes die compatibel zijn met FLIM-FRET en in staat zijn om andere celcomponenten (zoals nucleïnezuren of membraan) te labelen, zal ook de aard van de interacties verbreden die FLIM-FRET kan karakteriseren.
In een korte toekomst geloven we dat de grootste doorbraak op het gebied van FLIM-FRET het gevolg zal zijn van innovatie in gegevensverwerking. Methoden zoals gecomprimeerde sensing40 moeten een efficiënte en nauwkeurige reconstructie van FLIM-beeld van schaarse vervalgegevens mogelijk maken - mogelijk het versnellen van de acquisitiesnelheid die het mogelijk zou maken om real-time FLIM-FRET uit te voeren op snel veranderend proces. Op dezelfde manier zal machine learning die wordt toegepast op FLIM-gegevens met betrekking tot pixelclassificatie of regressie, denoising of signaalherstel een uitstekende beeldreconstructie en -analyse mogelijk maken die de interesse van FRET-FLIM-methoden41,42verder zullen vergroten .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen Dr Ludovic Richert voor zijn waardevolle hulp bij het verwerven van FLIM data en voor het technisch onderhoud en de ontwikkeling van de FLIM setup. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN wordt gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM is het Institut Universitaire de France (IUF) dankbaar voor de ondersteuning en het verstrekken van extra tijd om te worden besteed aan onderzoek. IJS en JG erkennen het Instituut voor De Levering van de Drug van Straatsburg voor zijn financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 525/50 nm band-pass filter | F37-516, AHF, Germany | ||
| 680 nm short pass filter | F75-680, AHF, Germany | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polymerase 5U/μL | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fiber-coupled avalanche photo-diode | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass coverslips (Thickness No. 1.5, 20×20mm | Knitel glass | MS0011 | |
| High-Fidelity DNA polymerase Phusion 2U/μL | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Lysogeny broth (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Microscope slides (25×75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmid | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium Succinate (Disodium) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, SPCM software | Becker & Hickl | ||
| Sterile inoculating loop | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligase 1U/μL | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| TCSPC module | SPC830, Becker & Hickl, Germany | ||
| Ti:Sapphire laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubes 50mL | Falcon | 352070 |
References
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).
- Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions. Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).
- Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).
- Ringel, M. T., Brüser, T.
- Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization. Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).
- Cui, Y., et al. Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. Science China Life Sciences. , (2019).
- Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. Springer Series in Chemical Physics. 111, 249-276 (2015).
- Bastiaens, P. I. H., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).
- Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells. Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A guide to fluorescent protein FRET pairs. Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).
- Leray, A., et al. Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements. Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).
- Elson, D. S., et al. Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier. New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).
- Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M.
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8, 393-399 (2011).
- Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).
- Imperi, F., Visca, P. Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'. FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).
- Gasser, V., et al. In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa. Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).
- Rietsch, A., Mekalanos, J. J. Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).
- Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).
- Godet, J., Mély, Y. Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET. Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007 (2019).
- El Meshri, S. E., et al. Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation. Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).
- Becker, W.
- Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy. Springer Series in Chemical Physics. , 111 (2015).
- Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging. Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).
- Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study. Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003 (2017).
- Margineanu, A., et al. Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Scientific Reports. 6, (2016).
- Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions. Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).
- Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer. Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).
- Liu, X., et al. Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells. Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).
- Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
- Stringari, C., et al. Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).
- Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis. Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).
- Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data. Data in Brief. 30, 105401 (2020).
- Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 113, Elsevier Inc. (2013).
- Li, L., Sun, H. Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging. Biochemistry. 59, 216-217 (2020).
- Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach. Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).
- Smith, J. T., et al. Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).
- Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging. Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).
