Descriviamo qui un protocollo per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra due proteine espresse in modo molto diverso nelle Pseudomonas aeruginosa vive usando misurazioni FLIM-FRET. Il protocollo include costruzioni di ceppo batterico, immobilizzazione dei batteri, routine di analisi dei dati di imaging e post-imaging.
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Articolo metodologico
Misurazioni FLIM-FRET delle interazioni proteina-proteina nei batteri vivi.
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina (IPP) controllano vari processi chiave nelle cellule. La microscopia a vita a fluorescenza (FLIM) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) fornisce informazioni accurate sugli IPP nelle cellule vive. FLIM-FRET si basa sulla misurazione del decadimento a vita della fluorescenza di un donatore FRET ad ogni pixel dell'immagine FLIM, fornendo informazioni quantitative e accurate sugli IPP e sulle loro organizzazioni cellulari spaziali. Proponiamo qui un protocollo dettagliato per le misurazioni FLIM-FRET che abbiamo applicato per monitorare gli IPP nelle Pseudomonas aeruginosa vive nel caso particolare di due proteine interagenti espresse con numeri di copia molto diversi per dimostrare la qualità e la robustezza della tecnica nel rivelare le caratteristiche critiche degli IPP. Questo protocollo descrive in dettaglio tutti i passaggi necessari per la caratterizzazione PPI, a partire dalle costruzioni mutanti batteriche fino all'analisi finale utilizzando strumenti sviluppati di recente che forniscono possibilità di visualizzazione avanzate per un'interpretazione diretta di dati FLIM-FRET complessi.
Introduzione
Le interazioni proteina-proteina (IPP) controllano vari processi chiave nellecellule 1. I ruoli degli IPP differiscono in base alla composizione proteica, alle funzioni di affinità e alle posizioni nellecellule 2. Gli IPP possono essere studiati attraverso diverse tecniche3. Ad esempio, la co-immunoprecipitazione è una tecnica relativamente semplice, robusta ed economica comunemente utilizzata per identificare o confermare gli IPP. Tuttavia, studiare gli IPP può essere impegnativo quando le proteine interagenti hanno bassi livelli di espressione o quando le interazioni sono transitori o rilevanti ....
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Protocollo
1. Costruzione plasmide
- Amplificare da due PCR (PCR1 e 3) le sequenze di DNA (utilizzare il DNA genomico di P. aeruginosa PAO1) delle 700 coppie di basi a monte e a valle delle regioni corrispondenti al sito di inserimento nel genoma di P. aeruginosa con DNA polimerasi ad alta fedeltà. Aggiungere siti di restrizione ai primer in blu e verde e aggiungere una sequenza sovrapposta con mCherry ai primer in rosso (Figura 2).
- Per il PvdA etichettato al C-terminale con eGFP, amplificare la regione di 700 bp a monte rispetto al codone di arresto dai primer in blu, e amplificare la regione a valle di 700 bp cont....
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Risultati
Le funzioni di distribuzione cumulativa empirica (ecdf) delle durate di fluorescenza misurate per i diversi ceppi batterici sono mostrate nella figura 8. Se si verifica fret, gli ecdf vengono spostati verso le vite di durata più breve (Figura 8A,8B). Si noti che quando l'interazione delle due proteine si traduce in una lunga distanza tra i due fluorofori, non può verificarsi alcun FRET (Figura 8C). Questa situazione.......
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Discussione
FLIM-FRET offre alcuni vantaggi chiave rispetto all'imaging FRET basato sull'intensità. La durata della fluorescenza è un parametro intrinseco del fluoroforo. Di conseguenza, non dipende dalle concentrazioni locali di fluorofori né dall'intensità dell'eccitazione della luce. La durata della fluorescenza è inoltre scarsamente influenzata dallo sbiancamento fotografico. È particolarmente interessante evidenza di IPP in cellule in cui le concentrazioni di proteine locali possono essere altamente eterogenee in tutti i compar.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il Dott. Ludovic Richert per la sua preziosa assistenza nell'acquisizione dei dati FLIM e per la manutenzione tecnica e lo sviluppo della configurazione FLIM. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN è finanziato dalla Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM è grata all'Institut Universitaire de France (IUF) per il sostegno e per aver fornito ulteriore tempo per dedicarsi alla ricerca. IJS e JG riconoscono l'Istituto per la distribuzione di droga di Strasburgo per il suo sostegno finanziario.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| filtro passa-banda 525/50 nm | F37-516, AHF, Germania | ||
| Filtro passa-corto 680 nm | F75-680, AHF, Germania | ||
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| solfato di ammonio (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polimerasi 5U/μ L | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fotodiodo da valanga accoppiato a fibra | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass vetrini coprioggetti (Spessore n. 1,5, 20&volte; Vetro | Knitel da | MS0011 | |
| polimerasi ad alta fedeltà Phusion 2U/μ L | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Brodo di lisogenia (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4 . 7H2O) | Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| Vetrini per microscopio (25× 75mm) | Knitel glass | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmide | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Potassio fosfato bibasico (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Potassio fosfato monobasico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodio Succinato (Disodico) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, software SPCM | Becker & Hickl | ||
| Anse di inoculazione sterile | Nunc | 7648-1PAK | |
| T4 DNA ligasi 1U/μ L | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| modulo TCSPC | SPC830, Becker & Hickl, Germania | ||
| Ti:Zaffiro laser | Insight DeepSee, Spectra Physics | ||
| Tubi 50mL | Falcon | 352070 |
Riferimenti
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
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Ristampe e permessi
