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Biology

Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Abstract

Le séquençage de transposon (Tn-seq) est une méthode puissante qui combine la mutagenèse transposon et le séquençage parallèle massif pour identifier les gènes et les voies qui contribuent à la condition physique bactérienne dans un large éventail de conditions environnementales. Les applications Tn-seq sont étendues et ont non seulement permis l’examen des relations génotype-phénotype au niveau de l’organisme, mais aussi au niveau de la population, de la communauté et des systèmes. Les bactéries gramnégatives sont fortement associées aux phénotypes de résistance aux antimicrobiens, ce qui a augmenté les incidents d’échec du traitement antibiotique. La résistance aux antimicrobiens est définie comme une croissance bactérienne en présence d’antibiotiques autrement mortels. La colistine antimicrobienne de « dernière ligne » est utilisée pour traiter les infections bactériennes gramnégatives. Cependant, plusieurs agents pathogènes gramnégatifs, dont Acinetobacter baumannii, peuvent développer une résistance à la colistine par le biais d’une gamme de mécanismes moléculaires, dont certains ont été caractérisés à l’aide de Tn-seq. En outre, les voies de transduction de signal qui régulent la résistance à la colistine varient au sein des bactéries gram-négatives. Nous proposons ici une méthode efficace de transpsine mutagenesis dans A. baumannii qui simplifie la génération d’une bibliothèque d’insertion de transposon saturé et la construction de bibliothèque d’amplicon en éliminant la nécessité d’enzymes de restriction, de ligature d’adaptateur et de purification de gel. Les méthodes décrites dans le présent mécanisme permettront une analyse approfondie des déterminants moléculaires qui contribuent à la condition physique de A. baumannii lorsqu’elles sont confrontées à la colistine. Le protocole s’applique également à d’autres agents pathogènes Gram-négatifs de l’ESKAPE, qui sont principalement associés à des infections nosocomiales résistantes auxmédicaments.

Introduction

La découverte d’antibiotiques est sans aucun doute l’un des événements les plus importants liés à la santé duXXe siècle. Non seulement les antibiotiques résolvent rapidement les infections bactériennes graves, mais ils jouent également un rôle central dans la médecine moderne. Les chirurgies majeures, les transplantations et les progrès de la médecine néonatale et de la chimiothérapie laissent les patients vulnérables aux infections potentiellement mortelles et ces thérapies ne seraient pas possibles sans antibiotiques1,2. Cependant, le développement rapide et la propagation de la résistance aux antibiotiques chez les agents pathogènes humains ont considérablement diminué l’efficacité de toutes les classes cliniquement importantes d’antibiotiques3. De nombreuses infections bactériennes qui étaient autrefois facilement éliminées par un traitement antibiotique ne répondent plus aux protocoles de traitement classiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique mondiale1. La résistance aux antimicrobiens (AMR) est l’endroit où les cellules bactériennes se développent dans des concentrations autrement mortelles d’antibiotiques, quelle que soit la durée du traitement4,,5. Il est urgent de comprendre les facteurs moléculaires et biochimiques qui régulent la DMM, ce qui aidera à orienter le développement d’autres antimicrobiens. Plus précisément, les agents pathogènes de l’ESKAPE sont problématiques en milieu clinique et associés à une VASTE DMA. Il s’agit notamment Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa et Enterobacter spp. Bien que plusieurs mécanismes contribuent à l’AMR chez les agents pathogènes de l’ESKAPE, les quatre derniers organismes sont gramnégatifs.

Les bactéries gramnégatives assemblent une membrane extérieure qui les protège des conditions environnementales défavorables. La membrane externe sert de barrière de perméabilité pour limiter l’entrée de molécules toxiques, comme les antibiotiques, dans la cellule. Contrairement à d’autres membranes biologiques, la membrane externe est asymétrique. La notice extérieure est enrichie de lipopolysaccharide exposé à la surface, tandis que la notice interne est un mélange de phospholipides6. Les molécules de lipopolysaccharide sont ancrées à la membrane externe par un lipide conservé A moiety intégré dans la bicouche lipidique7. Le lipide canonique Un domaine d’Escherichia coli lipopolysaccharide est nécessaire pour la croissance de la plupart des bactéries gramnégatives et est synthétisé par une voie enzymatique en neuf étapes qui est l’une des voies les plus fondamentales et conservées dans les organismes gramnégatifs6,7,8.

Les polymyxines sont des peptides antimicrobiens cationiques qui ciblent le lipide Un domaine de lipopolysaccharide pour perturber la membrane externe et lyser la cellule. L’interaction électrostatique entre les résidus chargés positivement des polymyxines et les groupes de phosphate de lipides chargés négativement A perturbent la membrane cellulaire bactérienne menant finalement à la mort cellulaire9,10,11,12,13. Colistin (polymyxine E) est un antimicrobien de dernier recours utilisé pour traiter les infections causées par des agents pathogènes nosocomiques gramnégatifs multirésistants, tels que Acinetobacter baumannii14,15,16. Découvertes pour la première fois en 1947, les polymyxines sont produites par les bactéries du sol, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Les polymyxines ont été prescrites pour traiter les infections gramnégatives pendant des années avant que leur utilisation clinique ait été limitée en raison des rapports de nephro- et de neurotoxicitésignificatives 20,21.

A. baumannii est un agent pathogène gramnégatif nosocomial qui a considérablement augmenté la morbidité et la mortalité des résultats des patients au cours des dernières décennies22. Ce qui était autrefois considéré comme un agent pathogène de faible menace, pose maintenant un risque important pour l’infection acquise à l’hôpital dans le monde entier en raison de son incroyable capacité à acquérir AMR et à haut risque d’épidémie23,24. A. baumannii représente plus de 10 % des infections nosocomiales aux États-Unis. La maladie se manifeste comme pneumonie, bactériémie, infections urinaires, infections de la peau et des tissus mous, méningite et endocardite25. Les options de traitement pour les infections à A. baumannii ont diminué en raison de la résistance contre presque toutes les classes d’antibiotiques, y compris les β-lactams, fluoroquinolones, tétracycline, et aminoglycosides23,24. La prévalence des isolats multirésistants, résistants aux médicaments et panrésistants A. baumannii a conduit à une résurgence du traitement de la colistine, qui a été considéré comme l’une des rares options thérapeutiques restantes encore efficace contre multirésistant A. baumannii. Cependant, la résistance accrue à la colistine chez les isolats A. baumannii a encore amplifié sa menace pour la santé publique mondiale10,11,12,13,27,30,31.

Les progrès récents dans les technologies de séquençage à haut débit, telles que le séquençage de transposition (Tn-seq), ont fourni des outils importants pour faire progresser notre compréhension de la condition physique bactérienne in vitro et in vivo. Tn-seq est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les interactions génotype-phénotype chez les bactéries. Tn-seq est largement applicable à travers les pathogènes bactériens, où il combine la mutagenèse transposon traditionnelle avec le séquençage parallèle massif aux sites d’insertion de carte rapide, qui peuvent être utilisés pour relier les mutations d’ADN à des variantes phénotypiques sur une échelle32,33,34,35. Bien que les méthodes de mutagenesis transposon aient été précédemment décrites, les étapes générales sont similaires33. Tout d’abord, une bibliothèque d’insertion est générée à l’aide de la mutagenèse transposon, où chaque cellule bactérienne d’une population est limitée à une seule insertion de transposon dans l’ADN génomique (ADNG). Après la mutanéèse, les mutants individuels sont mis en commun. gDNA est extrait de la piscine mutante d’insertion et les jonctions transposons sont amplifiées et soumises au séquençage à haut débit. Les lectures représentent des sites d’insertion, qui peuvent être cartographiés au génome. Les insertions transposons qui réduisent la condition physique tombent rapidement hors de la population, tandis que les insertions bénéfiques sont enrichies. Tn-seq a joué un rôle déterminant pour faire progresser notre compréhension de l’impact des gènes sur la condition physique bactérienne dans le stress33.

Le système de transposon marin Himar1 codé en pJNW684 a été spécialement construit et optimisé aux fins de transposon mutagenesis. Il comprend un transposon de la famille des marinsflanquant le gène de résistance à la kanamycine, qui est utilisé pour la sélection des mutants d’insertion transposon dans A. baumannii. Il code également un promoteur spécifique A. baumannii qui conduit à l’expression du gène d’encodage transposase36. Le transposon basé sur le marincontient également deux terminateurs translationnels en aval du gène de résistance à la kanamycine, ce qui empêche la lecture en aval de l’insertion37. pJNW684 porte également une RP4/oriT/oriR6K-origine conditionnelle de la réplication qui exige le gène λpir contribué par la souche de donneur pour reproduire38. En l’absence du gène λpir, le vecteur pJNW684 transportant la machine de transposition ne sera pas en mesure de se répliquer dans la souche bénéficiaire A. baumannii 10,36,38. Par conséquent, lors de la conjugaison bactérienne, seul le transposon est inséré dans le génome receveur sans insertion de fond du plasmide, qui porte le gène transposase. Ceci est significatif parce que la perte de l’activité transposase avec le plasmide se traduit par un seul événement de transposition stable qui empêche le transposon de se déplacer à différents endroits une fois qu’il s’insère dans le génome du receveur.

pJNW648 a également été testé pour l’activité dans un autre organisme gram-négatif, E. coli. L’assemblage réussi d’une bibliothèque saturée de Tn-seq dans la souche W3110 de E. coli a indiqué que le système est susceptible d’effectuer la mutagènesis dans un large éventail d’agents pathogènes, y compris les entérobactéries. En outre, le promoteur spécifique A. baumannii qui conduit l’expression transposase peut rapidement être échangé avec un promoteur spécifique à l’espèce. Enfin, le gène de résistance à la kanamycine peut être échangé contre d’autres cassettes de résistance, selon le phénotype AMR de l’organisme étudié.

Un facteur qui contribue à la résistance à la colistine dans A. baumannii est l’administration de doses insuffisantes, où les bactéries sont exposées à une pression sélective à des niveaux non létaux39. Plusieurs rapports ont montré que les concentrations antimicrobiennes de subinhibitoire peuvent induire des réponses réglementées qui modifient la physiologie cellulaire pour réduire la susceptibilité de l’ensemble de la population bactérienne11,12,30,31. En utilisant Tn-seq, nous avons découvert des facteurs qui régulent la résistance à la colistine dans la souche A. baumannii ATCC 17978 après l’exposition aux concentrations inhibitrices10 et subinhibitoires de colistine. Cet exemple détaille une méthode Tn-seq qui simplifie la construction et l’enrichissement d’une bibliothèque mutante transposon saturée à l’aidede la famille de transposons40,41. Alors que plusieurs protocoles Tn-seq génèrent 20.000 - 100.000 mutants35,42,43,44,45,46,le protocole décrit ci-après peut rapidement générer une bibliothèque transposon de 400.000 + mutants, ce qui équivaut à peu près à une insertion transposon toutes les paires de 10 bases dans A. baumannii10. En outre, la taille de la bibliothèque peut être réduite sans effort supplémentaire significatif. Cette méthode élimine également l’exigence de restriction endonuclées, la ligature d’adaptateur et la purification de gel, qui peut réduire la diversité finale de bibliothèque.

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Protocol

1. Préparation de la souche bactérienne

  1. Streak de la souche « onair » (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Table of Materials) pour les colonies isolées sur luria-Bertani agar complétée par 600 μM d’acide diaminopimélique (DAP), 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine. Incuber toute la nuit à 37 °C. À l’aide d’une seule colonie isolée, inoculer 50 ml de bouillon de Luria (LB) complétés par 600 μM DAP, 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL et l’étiqueter comme « on donateur ».
  2. Streak la souche « e destinataire » (A. baumannii souche ATCC 17978, Table des matériaux) pour les colonies isolées sur Luria-Bertani agar. Incuber toute la nuit à 37 °C. À l’aide d’une seule colonie isolée, inoculer 50 ml de LB dans une fiole Erlenmeyer de 250 ml et l’étiqueter comme « destinataire ».
  3. Incuber les deux cultures (« onsentair » et « ésacré ») pendant la nuit à 37 °C avec tremblement.

2. Accouplement bactérien

  1. Transférer les cultures de nuit dans des tubes coniques de 50 mL.
  2. Granulés de cultures de receveur et de donneur utilisant la centrifuge à 5 000 x g pendant 7 min.
  3. Jetez le supernatant et resuspendez le granulé de souche « donneur » dans 35 mL de LB complété par du DAP pour laver les antibiotiques résiduels.
  4. Pelleter les cellules de souche « onor » en utilisant la centrifuge à 5000 x g pendant 7 min.
  5. Jetez le supernatant et resuspendez le granulé de souche « donneur » dans 4,5 mL de LB complété par du DAP. Utilisez une pipette sérologique de 10 mL.
  6. Transférer la souche « donneur » réessublé dans le tube de souche « receveur », qui contient les cellules « résorant » granulées. Utilisez la même pipette sérologique de 10 mL de l’étape 2.5 pour mélanger les cultures. Passez immédiatement à l’étape suivante.
    REMARQUE : Le volume total de la suspension finale doit être de 5 mL.
  7. Distribuer la suspension d’accouplement sous forme individuelle de 100 gouttelettes de μL sur des plaques d’agar LB complétées par du DAP (5-7 gouttelettes par plaque)(figure 1A).
  8. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min.
  9. Sans déranger les gouttelettes, transférer soigneusement les plaques dans un incubateur de 37 °C et permettre aux cultures de s’accoupler pendant 1h.
    REMARQUE : Les périodes d’incubation supérieures à 1 h risquent la génération de mutants sœurs.
  10. Après l’incubation, ajouter 1,5 mL de LB sur chaque assiette et récolter en réutilisant les bactéries des assiettes. Utilisez une micropiplette de 1 mL pour la resuspension. Le volume final devrait être d’environ 12 à 15 mL.
  11. Mélanger les cellules récoltées dans un tube conique de 50 ml.
  12. Pelleter les cellules accouplées à l’aide de centrifugation à 5 000 x g pendant 7 min.
  13. Jetez les cellules supernatantes et resuspendez dans 50 mL de LB pour enlever le DAP résiduel.
  14. Pelleter l’accouplement à l’aide de centrifugation à 5 000 x g pendant 7 min.
  15. Répétez l’étape de lavage (étapes 2.13 et 2.14).
  16. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, resuspendez le granulé dans 10 mL de LB complété par 25% de glycérol.
  17. À l’aide de cellules lavées, faire cinq dilutions en série dans le bouillon LB (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000, 1:100,000).
  18. Étendre 100 μL de chaque dilution sur 4 plaques différentes à l’aide de perles de verre stériles : Agar Luria-Bertani complété par de la kanamycine, agar complété par de l’ampicilline, agar complété avec du DAP et de l’agar seulement.
  19. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
  20. Aliquot l’accouplement restant dans 1 mL aliquots et stocker à -80 °C.

3. Déterminer la dilution appropriée de la bibliothèque transposon

  1. Enregistrer les unités de formation de colonies (CFU) à partir de plaques de nuit.
  2. Imager une plaque avec des colonies dénombrements pour chaque condition de plaque différente (figure 2A).
    REMARQUE : Les souches « donatrices » et « receveurs » devraient pousser sur des plaques d’agar complétées par du DAP, de sorte que la plupart des dilutions plaquées donneront une pelouse. Seule la souche « e destinataire » peut pousser sur des plaques d’agar. Ni le « donneur » ni la souche « bénéficiaire » ne peuvent pousser sur des plaques d’agar complétées par de l’ampicilline, de sorte qu’il ne devrait y avoir aucune croissance ou croissance minimale. Seules les cellules de souche cible encodantes l’insertion de transposon peuvent se développer sur des plaques d’agar complétées par de la kanamycine. Les colonies devraient varier en taille, ce qui indique les insertions transposons dans les gènes qui contribuent à la condition physique sur l’agar complété par la kanamycine.
  3. Calculer le nombre de mutants transposons dans l’accouplement gelé en comptant le nombre de colonies sur des plaques d’agar LB complétées par de la kanamycine.
    REMARQUE : Pour le génome de A. baumannii (environ 4 Mbps), l’objectif était d’obtenir environ 400 000 colonies afin de générer une bibliothèque mutante à haute résolution (environ une insertion transposon/10 paires de base). Toutefois, ce nombre devrait être optimisé en fonction de la taille du génome de l’espèce cible).

4. Génération de la bibliothèque finale de mutants bactériens

  1. Décongeler un aliquot de l’accouplement gelé sur la glace.
  2. Accouplement de plaques sur des plaques d’agar Luria-Bertani de 150 mm complétées par de la kanamycine sur la base des CPU calculées à l’étape 3.1. Ajuster le volume avec lb pour qu’il donne 13 333 colonies par 150 μL avant le placage.
    REMARQUE : Le nombre de CFU ici a été déterminé à environ 105 CFU/mL, de sorte que le volume d’accouplement a été ajusté pour obtenir 13 333 colonies par plaque, car cela fournirait un nombre optimal de colonies sur 30 plaques pour une bibliothèque mutante à haute résolution sans surpeuplement des plaques.
  3. Utiliser des perles de verre stériles pour étaler 150 μL de la dilution par plaque sur des plaques d’agar Luria-Bertani de 30 x 150 mm complétées par de la kanamycine pour obtenir 400 000 colonies (figure 1C).
    REMARQUE : Des tiges stériles ou tout autre type d’outil d’épandeur stérile (c.-à-d. des perles de verre) peuvent être utilisées pour répandre les bactéries sur les plaques.
  4. Disposer du tube utilisé contenant un excès d’accouplement.
    REMARQUE : Les cycles de gel/dégel ajoutent des pressions sélectives sur la culture bactérienne, qui peut fausser les résultats de l’expérience Tn-seq. Utilisez un aliquot frais à chaque fois.
  5. Incuber les plaques à 37 °C pendant 14 h.
    REMARQUE : Le temps d’incubation est optimisé pour prévenir la surcroissance (les colonies touchant). Il est suggéré de réduire la croissance en réduisant le temps d’incubation.

5. Estimation de la densité de la bibliothèque et mise en commun pour le stockage

  1. Comptez les CLU sur chaque plaque pour estimer le nombre total de mutants dans la bibliothèque transposon. Compter 20 % d’au moins 3 plaques pour déterminer l’estimation du nombre de colonies pour l’ensemble du groupe de plaques (figure 2A). Assurez-vous que les colonies ne touchent pas une autre colonie.
  2. Après avoir calculé le rendement estimé de la colonie, ajouter 3 à 5 mL de LB (ou plus si nécessaire) à chaque plaque et gratter les bactéries à l’aide d’un outil de grattage stérile.
    REMARQUE : Des boucles d’inoculation stériles ont été utilisées pour gratter efficacement les plaques.
  3. Piscine des suspensions bactériennes de toutes les plaques en tubes coniques de 50 mL (Figure 1D). Cela nécessitera plusieurs tubes coniques de 50 mL, au moins 3.
  4. Suspension bactérienne en piscine de granulés utilisant la centrifugement à 5.000 x g pendant 7 min.
  5. Jeter le granulé supernatant et resuspend dans 5 mL de LB complété avec 30% de glycérol.
  6. Aliquot 1 mL de la bibliothèque transposon en cryocials et stocker à -80 °C.

6. Identification des facteurs qui régulent la résistance à la colistine chez A. baumannii

  1. Préparer des flacons Erlenmeyer de 4 x 250 ml contenant chacune du bouillon et de l’étiquette de 50 ml lb (figure 2B)
    1. A. baumannii souche ATCC 17978 Bibliothèque Tn-seq; (-) colistin_1
    2. A. baumannii souche ATCC 17978 Bibliothèque Tn-seq; (-) colistin_2
    3. A. baumannii souche ATCC 17978 Bibliothèque Tn-seq; (+) colistin_1
    4. A. baumannii souche ATCC 17978 Bibliothèque Tn-seq; (+) colistin_2
      NOTE : Dans le défi de croissance décrit ici, chaque condition, (-) contrôle de la colistine et (+) défi de colistine, est testée en double. Par conséquent, la configuration nécessite 4 x 250 mL Erlenmeyer flacons, deux par condition.
  2. Ajouter 50 μL de 0,5 mg/L de colistine aux flacons de colistine (+) (6.1,3 et 6,1,4) et 50 μL d’eau aux flacons (-) de colistine (6.1.1 et 6.1.2).
  3. Décongeler un alquot gelé de la bibliothèque Tn-seq à partir de l’étape 5 sur la glace.
  4. Pipette 1 μL de la bibliothèque décongelée en 1 mL de PBS.
  5. Mesurez la densité optique à 600 nm (OD600)et multipliez par 1 000.
    REMARQUE : Cela détermine l’OD600 de 1 μL de la bibliothèque Tn.
  6. Sur la base du calcul à l’étape 6.5, inoculer chaque flacon contenant 50 ml LB à un OD final600 0,001.
  7. Cultiver des cultures dans un incubateur de secousses à 37 °C àOD 600 0,5.
    REMARQUE : Il est important que les cultures restent en phase de croissance logarithmique, donc si votre souche est à un OD600 différent pendant la croissance exponentielle, l’OD600 doit être ajusté pour s’assurer que la culture se reproduit autant de fois que possible dans la phase de croissance logarithmique. Si la culture ne se reproduit que 3 fois, le pouvoir de détecter les défauts de forme physique chez les mutants est plafonné à 3 fois les différences, en théorie. Puisque différentes bactéries ont des temps de doublement différents, il est important de semer les cultures à un OD600 fixe pour normaliser l’inoculum de départ. Cela garantit une représentation cohérente de l’ensemble de la bibliothèque dans toutes les cultures.
  8. Récoltez les cultures utilisant la centrifuge à 5 000 x g à 4 °C pendant 7 min.
  9. Retirer le supernatant et laver avec 50 mL de PBS.
  10. Granulé utilisant la centrifuge à 5 000 x g à 4 °C pendant 7 min.
  11. Retirer le supernatant et resuspender le granulé dans 1 mL de PBS. Aliquot ~ 200 μL en 5 tubes de microcentrifuge.
  12. Granulé utilisant la centrifuge à 5 000 x g à 4 °C pendant 5 min. Retirez tous les supernatants à l’aide d’une pointe de pipette.
  13. Conserver les granulés à -20 °C ou procéder à l’extraction de l’ADG.

7. extraction gDNA

  1. Décongeler une boulette de cellule sur la glace.
  2. Ajouter un tampon de lyse de 0,6 mL (Table des matériaux)et vortex pour réutiliser complètement le granulé.
  3. Incuber à 37 °C pendant 1 h.
  4. Ajouter 0,6 mL d’alcool phénol/chloroforme/isoamyl à l’échantillon et vortexner vigoureusement.
  5. Phases séparées utilisant la centrifuge dans une microcentrifuge à vitesse maximale à la température ambiante pendant 5 min.
  6. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube. Évitez de perturber l’interface de phase pendant le transfert.
  7. Ajouter un volume égal de chloroforme à la phase aqueuse obtenue ci-dessus et vortex vigoureusement.
  8. Phases séparées utilisant la centrifuge dans la microcentrifuge à la vitesse maximale à la température ambiante pendant 5 min.
  9. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
    REMARQUE : Assurez-vous d’éviter de perturber l’interface pendant le transfert.
  10. Ajouter 2,5 x volume de phase aqueuse de froid 100 % éthanol et mélanger doucement. L’ADN précipité sera visible.
  11. Placer le tube à -80 °C pendant au moins 1 h.
  12. Adn de granulé utilisant la centrifugement à la vitesse maximale à 4 °C pendant 30 min.
  13. Retirez soigneusement le supernatant sans perturber la pastille d’ADN et lavez-le avec 150 μL d’éthanol à 70 % par pipetage.
  14. Adn de granulé utilisant la centrifugement à vitesse maximale à 4 °C pendant 2 min.
  15. Retirez soigneusement le supernatant.
  16. Répétez l’étape 7.14 une fois. Retirez soigneusement tout éthanol restant.
  17. Sécher l’ADN en cousant à la température ambiante pendant 5-10 min.
  18. Resuspend de granulé d’ADN dans un tampon TE de 100 μL par pipetage.

8. Cisaillement de l’ADN (figure 3A)

  1. Diluer l’ADG avec la mémoire tampon TE à une concentration de 250 ng/mL dans un volume total de 200 μL.
  2. Placez les tubes dans un sonicator de bain d’eau.
  3. Sonicate ADN pour produire des fragments d’environ 300 nucléotides. Puissance: 60 %, Temps total : 20 min, Cycles : 10 s ON et 10 s OFF à 4 °C (Figure 3A).
  4. Confirmer que l’ADN est cisalé de façon appropriée en séparant 10 μL d’ADN non entendu et 10 μL d’ADN cisalé sur un gel agarose de 1%. Répétez la soniation ou optimisez au besoin (Figure 3B).

9. Ajout de queue poly-C à l’extrémité de 3' (Figure 3A)

  1. Configuration de la réaction poly-C selon le tableau 1.
  2. Réaction incubere à 37 °C pendant 1 h.
  3. Purifier la réaction poly-C avec 40 μL de perles paramagnétiques de sélection de taille (Figure 3A) en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Ajouter 40 μL de perles paramagnétiques de sélection de taille à chaque échantillon. Vortex ~ 5 s ou pipette de haut en bas.
    2. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 5 min.
    3. En bref, des tubes de centrifugeuse pour recueillir le liquide dans le fond du tube (~ 2 s).
    4. Transférer les tubes sur un support magnétique et incuber à température ambiante pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    5. Avec des tubes sur support magnétique, retirez soigneusement le supernatant.
    6. Avec des tubes sur support magnétique, ajouter 200 μL d’éthanol fraîchement préparé à 80% (ne pas déranger les perles).
    7. Incuber les échantillons pendant au moins 30 s jusqu’à ce que la solution soit claire.
    8. Avec des tubes sur support magnétique, retirez soigneusement le supernatant.
    9. Répétez l’étape de lavage (étapes 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Recueillir le liquide dans le fond du tube à l’aide d’une brève étape de centrifugation (~ 2 s).
    11. Transférer les tubes sur la grille magnétique et enlever tout liquide restant.
    12. Incuber à température ambiante pendant 2-5 min pour sécher les échantillons. Ne pas sécher trop.
    13. Retirer les tubes de la grille magnétique et ajouter 25 μL d’eau à chacun. Vortex pour ~ 5 s ou pipette de haut en bas.
    14. En bref, des tubes de centrifugeuse pour recueillir le liquide dans le fond du tube (~ 2 s).
    15. Transférer les tubes sur le support magnétique et laisser reposer pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    16. Avec les tubes sur la grille magnétique, retirer le liquide sans déranger les perles et transférer dans un nouveau tube (~ 23 μL d’ADN).

10. Amplification de jonction de transposée (Figure 3A)

  1. Installation pcr 1 comme décrit dans le tableau 1 pour le premier PCR imbriqué (Tableau 2).
  2. Effectuez pcr 1 en utilisant les conditions décrites dans le tableau 1.
  3. Purifier les produits PCR avec 40 μL de perles paramagnétiques de sélection de taille (étapes 9.3.1 – 9.3-12). Elute dans 50 μL d’eau (étapes 9.3.13 – 9.3.16). À ce stade, les échantillons peuvent être stockés à -20 °C.
  4. Préparer des perles paramagnétiques doublées de Streptavidin :
    1. Resuspend Streptavidin perles en secouant vigoureusement.
    2. Ajouter 32 μL de perles par échantillon à un tube de microcentrifuge frais.
      REMARQUE : Les perles pour 6 + échantillons peuvent être préparées dans un seul tube.
    3. Transférer le tube sur un support magnétique. Incuber pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    4. Avec le tube sur la grille magnétique, enlever le supernatant.
    5. Retirez le tube du support magnétique. Lavez les perles en résuspendant en tampon b&w de 1 mL 1x en faisant des tuyaux de haut en bas.
    6. Transférer le tube sur un support magnétique. Incuber pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    7. Avec le tube sur la grille magnétique, retirez le supernatant.
    8. Répétez l’étape de lavage avec la mémoire tampon B&W de 1 mL (étapes 10.4.5 – 10.4.7) deux fois plus pour un total de 3 lavages.
    9. Retirez le tube de la grille magnétique et resuspendez les perles dans 52 μL de tampon b&w 2x par échantillon.
  5. Mélanger 50 μL des perles préparées avec 50 μL de PCR1 purifié (à partir de l’étape 10.3). Pipette à mélanger.
  6. Tourner à température ambiante pendant 30 min.
  7. Laver l’ADN non lié :
    1. En bref, centrifugeuse pour recueillir le liquide au fond du tube (~ 2 s).
    2. Transférer le tube sur un support magnétique. Incuber pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    3. Avec le tube sur la grille magnétique, retirez le supernatant.
    4. Retirez le tube de la grille magnétique, lavez les perles en les résutilisant dans un tampon de 100 μL 1x B&W et en tirant de haut en bas.
    5. Transférer le tube sur support magnétique. Incuber pendant ~ 2 min jusqu’à ce que la solution soit claire.
    6. Avec le tube sur la grille magnétique, enlever le supernatant.
    7. Répétez les étapes de lavage avec 100 LoTE μL (étapes 10.7.4 – 10.7.6) deux fois plus pour un total de 3 lavages.
  8. Installation pcr 2 tel que décrit dans le tableau 1 pour amplifier les jonctions transposons et ajouter un seul code-barres à chaque échantillon (tableau 2 et tableau 3).
  9. Effectuez pcr 2 en utilisant les conditions décrites dans le tableau 1.
  10. Purifier avec 40 μL de perles paramagnétiques de sélection de taille (étapes 9.3.1 – 9.3.12). Elute dans 17 μL d’eau (étapes 9.3.13 – 9.3.16), collecte ~ 15 μL.
  11. Quantifier la concentration d’ADN à l’aide d’un fluoromètre. Les concentrations finales doivent être de ~ 50 à 250 ng/μl.
  12. Évaluer la qualité de l’ADN à l’aide d’une électrophorèse capillaire à base de puces (figure 4A).

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Representative Results

Les méthodes décrites décrivent la génération d’une bibliothèque transposon à haute densité dans la souche A. baumannii ATCC 17978 par conjugaison bactérienne à l’aide de E. coli MFD DAP-, qui reproduit le plasmid pJNW684 (Figure 4B). Le protocole détaillé utilise la conjugaison bactérienne biparentale pour le transfert de pJNW684 de la souche E. coli λpir+ donneur à la souche receveur A. baumannii. Il s’agit d’une méthode efficace et peu coûteuse pour générer des bibliothèques mutantes transposons denses. Les bactéries ont été mélangées à des ratios optimisés et des accouplements ont été repérés sur les plaques d’agar luria-bertani pendant 1 h (figure 1A). Pendant l’accouplement, le transposon a été transféré du donneur à la souche receveur, où il s’est inséré dans l’ADNg gDN (figure 1B). Des accouplements ont été collectés, environ10 5 CFU/mL ont été calculés et plaqués sur des plaques d’agar de 150 mm x 15 mm complétées par de la kanamycine.. Après 14 h de croissance à 37 °C, les plaques contenaient des milliers de colonies de taille variable (figure 1C) indiquant la production réussie d’une bibliothèque mutante transposon. Les mutants d’insertion de transposon ont été mis en commun (Figure 1D) et congelés dans des aliquots pour empêcher les cycles répétés de gel-dégel, ce qui pourrait ajouter une pression sélective sur la bibliothèque d’insertion.

La bibliothèque mutante A. baumannii transposon a été utilisée pour identifier les facteurs de forme physique importants pour la résistance à la colistine sous les concentrations subinhibitoires de l’antimicrobien (figure 2B). La bibliothèque mutante a été cultivée en phase logarithmique en l’absence/présence de 0,5 mg/L de colistine en double pour épuiser les insertions de cellules mutantes dans les gènes qui contribuent à la résistance à la colistine. L’ADNg total du pool de bibliothèque restant a été isolé des cultures témoins et expérimentales et traité pour préparer l’ADN pour le séquençage (figure 3A).

L’ADNg isolé a été fragmenté à l’aide de cisaillements mécaniques et une queue poly-C a été ajoutée sur les fragments d’ADN (figure 3A). Suite à l’ajout de la queue poly-C, l’ADN a été purifié et les jonctions transposon-génome ont été enrichies à l’aide de l’amorce spécifique poly-C suivie d’une deuxième série de PCR à l’aide d’une autre amorce spécifique poly-C qui a introduit le site de séquençage P7 qui est nécessaire pour lier la cellule de flux Illumina et la génération de cluster, et un code-barres à six bases qui est utilisé pour démultiplex bibliothèques après séquençage37,47. Les concentrations d’ADN ont été calculées et les échantillons ont été analysés à l’aide d’une électrophorèse capillaire à base de copeaux pour confirmer les constructions réussies de bibliothèques (figure 4A), qui sont prêtes pour le séquençage à haut débit.

Les bibliothèques d’ADN ont été séquencées par le séquençage de la prochaine génération. Une course à un extrémité, 50 cycles a été effectuée, qui a donné 30 millions de lectures de haute qualité / échantillon fournissant 62,5 fois la couverture de la bibliothèque transposon. Les jonctions transposons (lectures) ont été cartographiées au génome de référence48, à l’aide d’un logiciel d’analyse bioinformatique disponible dans le commerce. Le nombre de lectures à chaque site d’insertion dans les échantillons d’entrée, (-) condition de contrôle de la colistine, ont été comparés au nombre de lectures dans les échantillons de sortie, (+) condition expérimentale de colistine, et les scores de forme physique pour chaque site d’insertion ont été calculés. Les scores de remise en forme ont ensuite été regroupés par gène. Les gènes démontrant des scores réduits lorsque la bibliothèque a été cultivée en présence de colistine par rapport aux échantillons d’intrants ont été considérés comme des déterminants de la condition physique pour la survie de A. baumannii à des concentrations de colistine. Par exemple, des insertions de transposons dans le système à deux composants PmrAB étaient présentes dans l’échantillon d’entrée, mais n’ont pas été trouvées dans l’échantillon de sortie. PmrAB régule directement l’expression de pmrC, qui transfère la phosphoéthanolamine sur les lipides A pour neutraliser la charge sur la surface cellulaire12,31. La neutralisation de la charge de surface bactérienne est censée réduire le potentiel électrostatique requis pour l’abattage sous médiation de colistine. L’identification des gènes épuisés connus pour contribuer au phénotype de résistance a validé la méthode.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la construction de la bibliothèque mutante transposon. (A) Conjugaison bactérienne. La souche « donneur », qui code la machine de transposition, a été mélangée à la souche « bénéficiaire ». Le mélange a été repéré sur des plaques d’agar LB et a permis de s’accoupler pendant 1 h. (B) Génération de bibliothèque transposon. Le plasmide porteur de la machine de transposition a été transféré de la souche « donneur » à la souche « bénéficiaire » et le transposon a été inséré au hasard dans tout le génome de la souche « bénéficiaire ». (C) Sélection. Les cellules résultantes ont été plaquées sur des plaques d’agar complétées par de la kanamycine à sélectionner pour les mutants d’insertion de transposon. (D) Bibliothèque mise en commun. Les colonies étaient grattées des plaques, réesspensées en LB et mises en commun. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs de la conjugaison bactérienne et schéma de l’expérience colistine Tn-seq. (A) Plaque de sélection de kanamycine représentative. La plaque est divisée en cinq sections égales. Les points bleus représentent le comptage des colonies pour l’estimation des mutants d’insertion de transposon A. baumannii. Au moins trois plaques distinctes ont été comptées pour calculer l’estimation finale. (B) Identification des facteurs de forme physique aux concentrations de colistine de subinhibitoriry. La bibliothèque de transposon mise en commun a été développée à la phase de croissance logarithmique soit en l’absence (contrôle) ou en présence (expérimentale) de colistine. Une fois que les cultures ont atteint la densité optique appropriée, les cellules ont été granulées et gDNA a été extraite de chaque échantillon. Chaque condition a été testée en double pour un total de quatre échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Organigramme de la bibliothèque d’adn amplicon construire pour le séquençage parallèle massif et le gDNA cisalé représentatif. (A) Tn-seq bibliothèque d’ADN construire schématique. Après l’extraction, l’ADG a été fragmenté par le cisaillement mécanique. La transférase terminale de désoxynucléotyl a été utilisée pour ajouter une queue poly-C à l’extrémité de 3' de l’ADN fragmenté avant l’amplification de PCR des jonctions transposon-génome et de l’addition de code-barres. (B) 1% gel agarose des bibliothèques mutantes A. baumannii non auditionnées et cisapdées suivant l’étape de cisaillement gDNA. 1 Ko échelle a été utilisé comme un marqueur d’ADN. Le frottis de gDNA cisaillement varie principalement entre ~ 100 et 500 paires de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résultats représentatifs du contrôle de la qualité (QC) et carte du plasmide porteur des gènes de transposition. (A) QC trace pour une bibliothèque d’ADN construire. Il ya un pic à ~ 350 paires de base, indiquant la construction réussie bibliothèque. Si un peu plus d’ADN a été détecté dans les résultats qc, les échantillons peuvent être nettoyés plus loin pour enlever de grands fragments d’ADN. (B) Plasmid pJNW684 se compose d’un transposon marin Himar1 (vert) avec une cassette de résistance à la kanamycine (violet) pour la sélection mutante, un gène codant le marin hyperactif Hhear1 C9 transposase (rouge) sous le contrôle d’un promoteur spécifique A. baumannii 17978 (bleu), d’un gène de résistance à l’ampicilline(bla,orange) et d’une origine conditionnelle RP4/oriT/oriR6K de réplication (jaune). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Réaction Configuration Conditions
Réaction poly-C 30 μL d’ADN gDN Cisalé
2,5 μL de 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL de tampon de réaction de transaction de de deoxynucléotille terminal (Tdt) 5X
1,25 μL de rTdt
6,25 μL d’eau à 50 μL		 Incuber à 37ºC pendant 1 heure
PCR 1 23 μL 3'-poly-C ADN purifié (échantillon entier de l’étape précédente)
10 μL 10x mélange de réaction à haute fidélité de polymérase d’ADN
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotine
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL d’ADN polymérase haute fidélité
8,5 μL d’eau pure à 50 μL au total		 1 cycle: 2 min 94 ºC
15 cycles: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cycle: 4 min 68 ºC
Cale: ∞ 4 ºC
PCR 2 Perles liées à l’ADN de l’étape précédente
10 μL 10x mélange de réaction à haute fidélité de polymérase d’ADN
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 amorce de code-barres μL 30 μM (tableau 2)
0,5 μL d’ADN polymérase haute fidélité
33,5 μL d’eau pure à 50 μL		 1 cycle: 2 min 94 ºC
15 cycles: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cycle: 4 min 68 ºC
Cale: ∞ 4 ºC

Tableau 1 : Configuration des réactions. Configuration et conditions pour les réactions poly-C, PCR 1 et PCR 2.

But Nom Séquence
Anneals à transposon olj510-Biotin Biotin-GATGGCCTTTTTGTTTTTTTTCCTGCGGGCGGCG
Anneals à la queue poly-C olj376 GTGACTGGAGTTTAGAGACTGTGCTTCCTGCTT
GGGGGGGGGGGGGG
Imbriqué à transposon + adaptateur P5 :
Site de capture P5 – Site de séquençage P5 – N5 –Tn		 olj511 AATGATAGCGCGACCACCGAGATCTACCTTT
CCCTACACGACGCTCCTTCGCTNNNNGGGACTTA
TCACCAACCTGTTAG
Imbriqué à olj376: Site de séquençage P7
– code-barres XXXXXX – Site de capture P7)		 Bc ## CAAGCAGAGAGCGATAGGATAGAXXxxxxGTGA
CTGGAGTTCAGAGATTGTG
voir le tableau 2 pour les codes à barres spécifiques***

Tableau 2 : amorces d’amplification PCR. Amorces d’amplification PCR utilisées dans le protocole pour amplifier les jonctions transposons. Le but de chacun est répertorié dans la première colonne.

Amorce Lire Code-barres Séquence
BC1 ATCACG CGTGAT CAAGCAGAGACGGCATACAPGAGATGCT
GATGTGATCHGGAGGTTCAGAGAGAGGTGTG
BC2 CGATGT ACATCG CAAGCAGAGAGGCATACGAGATAC
ATCGGGACTGGAGGTTCATGAGAGGTGTGTG
BC3 TTAGGC GCCTAA CAAGCAGAGACGGCATACAPGAGATGCC
TAAGGTGATCHGGGTTAGAGGAGGTGTGTG
BC4 TCACCA TGGTCA CAAGCAGAGAGCTAGTAGATAGAGATATT
GGTCAGTGATCHGGAGTTTCAGAGAGAGGTGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
CACTGTGTGATCHGGAGGTTCAGGAGAGCATTGTG
BC6 GCCAAT ATTGGC CAAGCAGAGACGGCATACGAGATA
TTGGGCGGATCHGGGTTCAGAGAGACTTGTGTGTG
BC7 CAGAGC GATCTG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GATCTGGGGATCHGGGTTCAGAGAGAGGTGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TCAAGGTGATCHGGGGTTAGGAGAGGTGTGTG
BC9 GATCAG CTGATC CAAGCAGAGAGAGCTAGATACGAGA
TCTGATGCGTGATCHGGGTAGGAGAGAGGTGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCTA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
AAGCTAGTAGGATCHGGGTCAGGAGAGGTGTGTG
BC11 GGCTAC GTAGCC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GTAGCCGTGATCHGGAGTTTCAGAGAGACTGTGTGGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAGAGCTAGTAGATAGAGATATT
ACAAGGTGATCHGGAGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC13 AGTCAA TTGACT CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TTGACTGTGATCHGGGATTTCAGAGAGACTTGTGTG
BC14 AGTTCC GGAACT CAAGCAGAGACGGCATACACGAGATG
GAACTGTGATCHGGGATTCAGAGAGAGACTGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT CAAGCAGAGAGAGCTAGATACGAGA
TTGACATGTGATCHGGGGCAGGAGAGGTGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GGACGGGTGATCHGGGGATCTTTAGAGAGAGACTTGTGTG
BC17 GTAGAG CCTAC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
CCTACTAGGGATCHGGTCAGGAGAGGTGTGTG
BC18 GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GCGGAGGAGGGGATTCAGGAGGTGTGTG
BC19 GTGAAA TTTCAC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TTTCACGGGATCHGGGTTTAGAGAGAGACTGTGTG
BC20 GTGGCC GGCCACC CAAGCAGAGACGGCATACACGAGATG
GCCACGTGATCHGGAGTTTCAGAGAGACTTGTGTG
BC21 GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
CGAAAACGTGATCHGGAGTTTCAGAGAGATTGTGTG
BC22 CGTACG CGTACG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
CGTACGGGAGGGGAGTTTCAGAGAGACTTGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAGAGGCATACGATAGATTC
CACTCGTGATCHGGAGGTTCAGAGAGAGAGATTGTGTG
BC24 GGTAGC GCTACC CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GCTACCGTGATCHGGAGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC25 ACTGAT ATCATT CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
ATCATGTGGATCHGGGTTCATGAGAGGTGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GCTCATGTGATCHGGAGGTTCAGGAGATTGTGTG
BC27 ATTCCT AGAAT CAAGCAGAGACGGCATACGAGATA
GGAATGTGATCHGGGATTTCAGGAGGTGTGTG
BC28 CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAGAGGCATACGATAGATTC
TTTTGGGGATCHGGGGATTCAGGAGGTGTGTG
BC29 CAACTA TAGTTG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TAGTTGGGACTGGAGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC30 CACCGG CVGGTG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
CGGGGGGGATCHGGGATTTCAGAGAGAGACTGTGTG
BC39 CTATAC GTATAG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GTATAGGGATCHGGGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC40 CTCAGA TCTGAG CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TCTGAGGGACTGGAGGTTCAGGAGAGGTGTGTG
BC42 TAATCG CGATTA CAAGCAGAGAGGCATACGATAGATTC
GATTAGGGATCHGGAGTTTCAGAGAGACTGTGTG
BC43 TACAGC GCTGTA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GCTGTAGGATCHGGAGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC44 TATAAT ATTATA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
ATTATAGGACTGGAGTTTTAGAGAGAGACTGTGTG
BC45 TCATTC GAATGA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
GAATGAGTGATCHGGAGTTTCAGAGAGACTGTGTG
BC46 TCCCGA TCGGGA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TTAGGAGTGATCHGGAGGTTCAGGAGGTGTGTG
BC47 TCGAAG CTTCGA CAAGCAGAGAGGCATACGATAGATTC
TTCGAGTGATCHGGAGGTTCAGGAGAGGTGTGGTG
BC48 TCGGCA TGCCGA CAAGCAGAGACGGCATACGAGAT
TGCCGAGTGATCHGGAGGTTCAGAGAGAGACTTGTGTG

Tableau 3 : Amorces de codes à barres. Les amorces de code-barres sont utilisées dans la deuxième étape pcr pour amplifier les jonctions transposon tout en ajoutant un site de séquençage P7 et des codes-barres à l’amplicon. Tous les amorces de codes à barres ne sont pas nécessaires pour générer une bibliothèque. Seuls les amorces de code-barres pour le nombre d’échantillons sont nécessaires.

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Discussion

A. baumannii est une menace émergente pour la santé publique mondiale en raison de l’acquisition rapide d’AMR contre les thérapeutiques de « dernière ligne », telles que la colistine10,11,12,23,24,30,31. Au cours des dernières décennies, Tn-seq a joué un rôle crucial dans l’élucidation des interactions génotype-phénotype à travers de nombreuses espèces bactériennes et l’expansion de notre compréhension de la génétique bactérienne34,35,42,43. Les protocoles Tn-seq ont joué un rôle déterminant dans l’identification des gènes essentiels dans diverses espèces bactériennes telles que Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, l’agent pathogène parodontal Porphyromonas gingivalis, et même Mycobacterium tuberculosis37,49,50,51. Au-delà de l’identification des gènes essentiels, Tn-seq a été utilisé pour identifier les gènes de résistance aux antibiotiques dans Pseudomonas aeruginosa, plusieurs gènes conditionnellement essentiels dans Salmonella typhimurium, et de nombreuses relations génotype-phénotype dans Streptococcus pneumoniae52,53,54. Plus récemment, le séquençage de transposon de Vibrio cholerae a été utilisé dans le modèle de lapin infantile du choléra pour identifier les gènes qui sont importants pour la condition physique in vivo pendant l’infection47. Ces études démontrent la polyvalence du Tn-seq car il peut être utilisé pour les études in vitro et in vivo.

Le principal avantage du Tn-seq par rapport à d’autres méthodes, telles que les technologies microarray, l’électrophorèse de gel 2D, et qPCR, est qu’il ne nécessite pas de connaissance préalable du génome ou de l’information génomique55. Par conséquent, la mutagèse transposon couplée à un séquençage massif parallèle permet l’étude de gènes et de génomes connus ainsi que la découverte de nouvelles interactions génétiques. Ici, nous avons présenté une méthode complète pour générer une bibliothèque mutante transposon très dense à A. baumannii pour identifier les facteurs qui sont essentiels pour la condition physique bactérienne lorsqu’ils sont exposés à des concentrations subinhibitoires de colistine. La méthode décrite a également été utilisée avec succès dans E. coli (données non publiées), démontrant que le système est susceptible d’effectuer l’analyse Tn-seq dans d’autres agents pathogènes gramnégatifs, y compris les entérobactéries.

L’utilisation de transposons marins pour la mutagenèse insertionnelle présente plusieurs avantages. La famille transposon provient d’hôtes eucaryotes et a été largement utilisée pour générer des bibliothèques mutantes saturantes dans diverses populations bactériennes. Les transposons mariners sont indépendants de l’hôte, ce qui signifie que des insertions aléatoires stables peuvent être réalisées en l’absence de facteurs d’hôte spécifiques40,41. En outre, les transposons marins ont un nombre défini d’événements d’insertion parce qu’ils s’insèrent préférentiellement dans les motifs thymine-adénine (« » ( », ce qui réduit le biais d’insertion et conduit à une analyse statistique plus robuste37,56,57,58.

Plusieurs méthodes Tn-seq basées sur le marinutilisent la digestion de restriction MmeI pour la fragmentation gDNA32,42,43. Bien que la fragmentation enzymatique de l’ADN soit une méthode populaire et réussie, elle ajoute des étapes inutiles à la procédure et augmente le biais potentiel37. Non seulement ces techniques nécessitent de grandes quantités de matériaux de départ, mais elles peuvent également conduire à une représentation inégale des séquences d’insertion dans les analyses en aval37,59. Comme d’autres méthodes qui ne reposent pas sur l’activité des noyaux MmeI52,60,61, la méthode décrite ci-après repose sur le cisaillement mécanique pour fragmenter l’ADN, et TdT pour ajouter une queue poly-C à l’extrémité 3' des fragments d’ADN. Par rapport aux méthodes de fragmentation enzymatique de l’ADN et de ligature des adaptateurs, cette approche nécessite des quantités significativement plus petites d’ADN de départ tout en fournissant des résultats plus cohérents, elle réduit également le risque de contamination croisée de l’ADN et réduit la perte d’échantillon due au confinement dans un tube scellé37,59,62. En outre, cette méthode donne des lectures de séquençage plus longues et de haute qualité de 50 nucléotides qui aident à une cartographie plus efficace et plus précise des séquences et une analyse en aval plus robuste37,59. L’ajout d’une queue synthétique poly-C ne tient pas compte des surplombs potentiels qui peuvent résulter de la fragmentation car cette méthode s’appuie sur la queue poly-C exogènement ajoutée comme site de reconnaissance pour l’amorce inversée, qui contient 16 nucléotides dG à son extrémité de 3' et une séquence spécifique au séquençage de la prochaine génération (par exemple, séquençage d’Illumina) à l’extrémité 5', à la synthèse principale47,59. L’utilisation d’une queue de nucléotide synthétique élargit l’application de cette méthode à de nombreux génomes distincts indépendamment de leur contenu natif59. Par la suite, les jonctions transposon-génome sont amplifiées à l’aide de l’amorce spécifique au poly-C37. Cette alternative simplifie la procédure en éliminant le besoin d’enzymes de restriction coûteuses, la ligature de l’adaptateur, la formation de dimers adaptateur et les étapes de purification du gel. Nous avons encore optimisé le protocole pour générer efficacement des bibliothèques d’insertion de transposons hautement saturées dans plusieurs pathogènes Gram-négatifs ESKAPE, y compris Acinetobacter baumannii et peut être utilisé pour étudier les interactions génétiques dans diverses conditions in vitro et in vivo 10.

Une limitation de Tn mutagènesis est qu’il s’appuie sur les marqueurs de résistance aux antibiotiques pour la sélection. Cependant, de nombreux agents pathogènes Gram-négatifs ESKAPE sont multirésistants ou largement résistants aux médicaments, ce qui signifie que l’utilisateur peut avoir besoin d’échanger la cassette de résistance en fonction de l’agent pathogène spécifique d’intérêt. En outre, certains isolats cliniques ne sont pas passibles de transposon mutagenesis à l’aide du transposon à base de marin.

Une étape critique du protocole est le calcul du nombre de mutants Tn à plaque. Le placage de trop de colonies se traduira par une pelouse qui peut compliquer l’analyse en aval. Si les colonies sont trop proches ou touchantes, elles peuvent ajouter une pression sélective non désirée sur la bibliothèque qui peut entraîner des artefacts. Idéalement, les colonies ne seraient pas touchées et espacées uniformément sur la plaque, comme l’a démontré lafigure 2A. Inversement, si trop peu de colonies sont plaquées, il sera difficile d’isoler plusieurs insertions de Tn dans chaque gène.

Il est également important d’effectuer les contrôles énumérés à l’étape 2.18. Comme indiqué dans la note de la section 3. 2, ni la souche « ondon » ou « e receveur » ne devrait pousser sur des assiettes complétées par de l’ampicilline. Étant donné que le DAP exogène est nécessaire pour la croissance de la souche « donatrice », toute croissance indiquerait que la souche « bénéficiaire » reproduit pJNW684. Il s’agit d’un problème important parce que si le transposon ne s’intègre pas dans l’ADG gDN, le séquençage ne sera que la carte au plasmide, pas un site d’intégration. Dans ce cas, l’expérience ne produira probablement pas de données utilisables.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été appuyé par le financement de l’Institut national de la santé (Grant AI146829 à J.M.B.) et est reconnaissant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

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Biologie Numéro 161 transposon séquençage à haut débit Gram-négatif Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit
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Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

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