Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

Sommario

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Abstract

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) è una nuova tecnica combinatoria, che consente la caratterizzazione simultanea delle proprietà fisiche e della composizione chimica del campione con risoluzione su scala nanometrica. Combinando AFM con IR, viene superata la limitazione della risoluzione spaziale dell'IR convenzionale, consentendo di raggiungere una risoluzione di 20-100 nm. Ciò apre la porta a una vasta gamma di nuove applicazioni dell'IR verso il sondaggio di campioni più piccoli di diversi micrometri, precedentemente irraggiungibili mediante la microscopia IR convenzionale. AFM-IR è eminentemente adatto per la ricerca batterica, fornendo informazioni sia spettrali che spaziali a livello di singola cellula e intracellulare. Le crescenti preoccupazioni per la salute globale e le previsioni future sfavorevoli riguardanti le infezioni batteriche e, in particolare, il rapido sviluppo della resistenza antimicrobica, hanno creato un urgente bisogno di uno strumento di ricerca in grado di sondare fenotipicamente a livello di singola cellula e subcellulare. AFM-IR offre il potenziale per rispondere a questa esigenza, consentendo la caratterizzazione dettagliata della composizione chimica di un singolo batterio. Qui forniamo un protocollo completo per la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati dei singoli spettri e la modalità di mappatura, per l'applicazione di AFM-IR verso studi batterici.

Introduzione

I batteri sono organismi procariotici a singola cellula, che si verificano in varie forme e dimensioni, in genere nell'intervallo da diverse centinaia di nanometri a micrometri. Esistono in una varietà di habitat e sono essenziali per l'esistenza della vita. All'interno del corpo umano, la maggior parte dei batteri presenti nell'intestino sono innocui e molti sono infatti benefici¹. Tuttavia, diverse specie batteriche sono patogene e causano una serie di malattie infettive. Le infezioni batteriche possono portare allo sviluppo di sepsi e shock settico: una condizione pericolosa per la vita, derivante dalla risposta del corpo a un'infezione². La sepsi è una grave minaccia per la salute globale, con un'alta prevalenza in tutto il mondo e gravi tassi di mortalità. Solo nel 2017, circa 50 milioni di casi di sepsi sono stati registrati in tutto il mondo, con 11 milioni di quelli che hanno provocato la morte (circa il 20%)². Inoltre, una diminuzione delle possibilità di sopravvivenza del paziente, a causa del ritardo della terapia, ha dimostrato di verificarsi in modo orario^3,4.

Le infezioni batteriche sono trattate con antibiotici. La gravità delle potenziali conseguenze delle infezioni batteriche del flusso sanguigno (BSI), insieme a un chiaro significato di un rapido inizio della terapia antimicrobica, richiedono la necessità di una somministrazione immediata di antibiotici. Tuttavia, poiché gli attuali approcci diagnostici utilizzati nella pratica clinica (ad esempio, la coltura del sangue) richiedono un tempo relativamente lungo, la somministrazione di antibiotici avviene spesso prima della diagnosi di BSI positiva⁵. Questo fattore porta a un ampio uso eccessivo di antibiotici, che – insieme all'uso eccessivo di antibiotici in altri settori come l'agricoltura – crea una forte pressione evolutiva verso lo sviluppo della resistenza antimicrobica (AMR)^6,7. La resistenza antimicrobica è attualmente uno dei problemi di salute globale più^{urgenti 7,8} e, entro il 2050, si prevede che diventerà la principale causa di morte⁹. Lo sviluppo della resistenza, insieme alla diffusione dei ceppi di AMR si sta verificando ad un ritmo allarmante^7,8,9 e supera, di gran lunga, il tasso di scoperta di nuovi antibiotici^10. Nuovi fenotipi resistenti emergono continuamente in tutto il mondo, mentre
la ricerca dedicata alla comprensione dei cambiamenti correlati alla resistenza antimicrobica è spesso lenta e limitata dagli approcci disponibili¹¹. Inoltre, i metodi comunemente usati, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento dell'intero gene (WGS), si concentrano solo sui cambiamenti genotipici. Questi non sono sufficienti a rivelare i meccanismi di resistenza¹¹, spingendo un urgente bisogno di uno strumento di ricerca che consenta di comprendere la composizione chimica dei batteri.

La spettroscopia infrarossa (IR) fornisce una caratterizzazione molecolare del campione ed è quindi un candidato promettente per il sondaggio batterico fenotipico. Fin dalle sue prime applicazioni¹², una grande grandezza di esempi del suo uso è stata dimostrata nella letteratura^13,14. Questi includono l'identificazione fenotipica dei batteri sul genere^15,specie¹⁶e ceppo^{17,livello 18.} Tuttavia, la risoluzione spaziale dell'IR convenzionale è limitata a diversi micron a causa del limite di risoluzione spaziale di diffrazione della lunghezza d'onda¹⁹. Poiché la dimensione della maggior parte dei batteri si trova al di sotto di tale limite (ad esempio, Staphylococcus aureus ≈ 400 nm di diametro), l'IR convenzionale non è applicabile per il sondaggio a livello a cellula singola o intracellulare.

La limitazione della risoluzione spaziale è stata recentemente superata combinando la spettroscopia IR con la microscopia a forza atomica (AFM-IR). In questo caso, l'assorbimento IR viene rilevato indirettamente, attraverso l'espansione termica del materiale^19,20,21,22. In breve, l'assorbimento della radiazione IR si traduce in un aumento della temperatura locale. Questo può essere misurato sia direttamente²³ che attraverso la misurazione dell'oscillazione della sonda a sbalzo AFM, risultante dall'impulso di forza creato dall'assorbimento IR^20,21. La tecnica combinatoria AFM-IR consente di raggiungere una risoluzione spaziale che si avvicina ai 20 nm, fornendo informazioni simultanee sulle proprietà fisiche locali di un campione (AFM) e sulla sua composizione chimica (AFM-IR). Sono possibili la raccolta di entrambi, singoli spettri da punti selezionati e la mappatura dell'intensità dei valori di numero d'onda selezionati all'interno di un'area scelta.

Considerando la risoluzione spaziale raggiungibile di AFM-IR, è evidente che la tecnica apre la possibilità di sondare chimicamente/fenotipicamente singole cellule batteriche e la loro composizione intracellulare^24. Finora, diversi esempi dell'applicazione di AFM-IR per singoli batteri sono stati dimostrati in letteratura^{19,20,21,22,25,26,27,28.} Questi coinvolgono l'analisi spettrale singola^19,21,22 e la mappatura a livello subcellulare^{19,22,25,26,27,28.} Ad esempio, è stata descritta la capacità di rilevare le vescicole lipidiche intracellulari²⁷ e i virus²⁸ all'interno di un singolo batterio. Questi risultati dimostrano l'utilità di AFM-IR per studi su scala nanometrica di singoli batteri e patogeni clinicamente rilevanti¹⁹.

Quindi, presentiamo un metodo di preparazione e raccolta del campione per i dati AFM-IR di campioni batterici multistrato, monostrato e monocellulare. Il protocollo qui descritto è stato applicato per studiare diverse specie di batteri²² e i cambiamenti nella loro composizione chimica. In particolare, lo sviluppo in vivo della resistenza alla vancomicina e della non suscettibilità alla daptomicina è stato studiato in coppie cliniche di S. aureus^19. Sia la resistenza intermittente alla vancomicina che la non suscettibilità alla daptomicina in S. aureus (VISA e DpR) sono emerse relativamente di recente, a seguito dell'aumento dell'uso e dell'introduzione di questi antibiotici nelle cliniche, costituendo un problema medico significativo. Inoltre, in particolare, il meccanismo di non suscettibilità alla daptomicina rimane ancora sfuggente, ostacolando lo sviluppo di farmaci alternativi^19,29. Il protocollo presentato si concentra sulla fornitura di spettri AFM-IR affidabili di singoli batteri, che possono essere ulteriormente analizzati utilizzando una varietà di approcci chemiometrici, secondo gli obiettivi sperimentali. Include inoltre l'approccio di mappatura, che è applicabile per gli studi intracellulari.

Protocollo

Tutti i lavori condotti con batteri patogeni devono essere intrapresi con adeguate misure di sicurezza. Questi includono il lavoro in un laboratorio con un adeguato livello di biosicurezza e in una cabina di biosicurezza (PC2), nonché un'attenta decontaminazione dell'area di lavoro con un disinfettante appropriato, ad esempio una soluzione di etanolo all'80%. I DPI appropriati devono essere indossati tutto il tempo.

1. Preparazione di solventi e materiali

1. Solventi: utilizzare acqua ultrapura come solvente. Utilizzare acqua purificata, autoclavata prima dell'esperimento per evitare qualsiasi potenziale contaminazione incrociata.
2. Substrato: utilizzare uno di questi substrati per AFM-IR, ad esempio ZnSe, CaF_2,BaF_2,ecc. Poiché AFM-IR è, in linea di principio, una tecnica non distruttiva, è possibile applicare una varietà di altri strumenti di ricerca allo stesso campione dopo l'analisi AFM-IR. Ad esempio, la correlazione dei risultati con la spettroscopia Raman può essere eseguita se vengono utilizzati vetrini CaF₂ o BaF₂ di grado Raman.
3. Utilizzare flaconcini di vetro invece di tubi di plastica poiché la plastica può contaminare il campione.

2. Preparazione del campione per AFM-IR

1. Crescita/incubazione del campione
   1. Coltiva i batteri in mezzi liquidi o su piastre solide. Selezionare il tipo di mezzo, le condizioni di crescita (ad esempio, temperatura, disponibilità di ossigeno) e il tempo di crescita in base alle esigenze specifiche delle specie di batteri in esame. Ad esempio, per S. aureus Heart Infusion (HI) possono essere utilizzate piastre di agar, con crescita per 16 ore a 37 °C in condizioni aerobiche.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, la crescita / incubazione dovrebbe produrre abbastanza batteri che consentirebbero la raccolta di un micro-pellet di campione. Il numero specifico di unità formanti colonie o cellule batteriche dipende dal tipo e dalle dimensioni del batterio.
2. Deposizione del campione
   1. Usando un anello sterile, raccogli con cura i batteri dalle colonie sulla piastra di agar e trasferiscili in un tubo di vetro. Raccogli i batteri solo dalla parte superiore delle colonie. Se si raccolgono campioni da una coltura liquida, utilizzando una pipetta, trasferire circa 1 mL della sospensione batterica in un tubo di vetro. Il volume può essere modificato a seconda della carica batterica.
      NOTA: è importante cercare di non raccogliere (o minimizzare il più possibile la raccolta di) qualsiasi mezzo da sotto la colonia. Le fasi successive della preparazione del campione mirano a rimuovere qualsiasi potenziale residuo di supporto. La minimizzazione del potenziale mezzo residuo fin dall'inizio consente l'acquisizione spettrale di dati da cellule batteriche purificate. I passaggi 2.2.2 e 2.2.3 si applicano ai campioni preparati da piastre di agar. Per i campioni preparati a partire da mezzi liquidi, passare al punto 2.2.4.
   2. Aggiungere 1 mL di acqua ultrapura al tubo. Vortice fino a quando il pellet batterico raccolto non è più visibile sul fondo del tubo (in genere 1-2 min).
   3. Stimare la torbidità approssimativa della soluzione utilizzando, ad esempio, gli standard McFarland mediante confronto visivo³⁰ tra la soluzione preparata e gli standard McFarland. Se la torbidità della sospensione batterica sembra essere molto bassa, aggiungere più batteri dalla piastra usando un anello sterile e un vortice di nuovo. Ripetere fino a quando la torbidità approssimativa della soluzione è paragonabile agli standard McFarland 0,5 e 1. Questo generalmente produrrà una buona quantità di pellet batterico.
   4. Centrifugare la sospensione batterica a 3.000 x g per 5 min per ottenere un pellet.
      NOTA: I parametri di centrifugazione possono essere modificati per ottenere pellet batterico. Si deve prestare attenzione se si aumenta la forza g, per non indurre la rottura dei batteri (specialmente in caso di batteri Gram-negativi).
   5. Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente il surnatante da sopra il pellet. Aggiungere 1 mL di acqua ultrapura al tubo e vortice per sospendere nuovamente il pellet. Successivamente, centrifugare il campione come è stato fatto nel passaggio 2.2.4.
   6. Ripetere la procedura di lavaggio (passaggi 2.2.2 e 2.2.4) almeno tre volte. In caso di prelievo del campione iniziale da mezzi liquidi, ripetere la procedura almeno quattro volte (rimozione del supporto seguita da tre lavaggi).
   7. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante, aggiungere acqua ultrapura e vortice per almeno 2 minuti. Successivamente, depositare 5 μL del campione sul substrato (ad esempio, grado Raman CaF₂).
   8. Se lo spessore desiderato del campione è un multistrato di batteri, lasciare asciugare il campione all'aria.
   9. Se lo spessore desiderato è monostrato o singoli batteri, subito dopo aver depositato il campione (punto 2.2.7) aggiungere tra 20-100 μL di acqua ultrapura e mescolare delicatamente con una punta di pipetta. Lasciare asciugare all'aria.
      NOTA: Il volume esatto di acqua può variare tra gli esperimenti in quanto dipende da molti fattori (ad esempio, dimensioni dell'organismo, densità del pellet, ecc.) ed è, quindi, meglio determinato empiricamente. La preparazione di una serie di campioni con volumi variabili di acqua ultrapura aggiunta consente di selezionare un campione con lo spessore / densità desiderata di batteri. Lo spessore/densità dei batteri può essere facilmente visualizzato tramite AFM nelle fasi successive. Esempi di immagini AFM da campioni monostrato e a cella singola sono mostrati nella Figura 1A–H.
   10. Montare il substrato su un disco campione metallico AFM utilizzando nastro biadesivo.

3. Preparazione dello strumento

NOTA: Le procedure strumentali qui descritte sono per lo strumento elencato nella Tabella dei Materiali. La procedura strumentale di dettaglio può differire leggermente da quella qui descritta se si utilizza un modello più recente dello strumento AFM-IR.

1. Accendere e inizializzare lo strumento premendo il pulsante Inizializza. Assicurarsi che l'otturatore laser sia in posizione aperta per il test laser.
2. Se è impostato un sistema di spurgo, spurgare lo strumento con N₂ attivando il flusso di N₂. Regolare lo spurgo dell'azoto per ottenere un livello di umidità stabile (ad esempio, il 20%). Assicurarsi che l'umidità non fluttui durante le misurazioni e tra la raccolta dei dati di fondo e del campione. Si consiglia di consentire circa 20 minuti per stabilizzare i livelli di umidità.
3. Caricare il campione nella camera del campione premendo il pulsante Carica. Il caricamento dei campioni viene eseguito tramite la procedura guidata del software. Durante il funzionamento della procedura guidata del software, concentrarsi prima sulla punta, utilizzando le frecce per spostare lo stadio del microscopio nella direzione Z e fare clic su Avanti. In secondo luogo, regolare il punto di raccolta dei dati, utilizzando frecce che guidano il movimento in piano e allineare il laser AFM e il rilevatore AFM utilizzando le manopole sulla parte superiore della testa AFM. Successivamente, concentrarsi sulla superficie del campione spostando lo stadio del microscopio in direzione Z.
   NOTA: illustrazioni dettagliate di ogni fase del caricamento del campione sono fornite nel manuale del software³¹. Concentrarsi sul campione dovrebbe essere condotto con cura. Quando ci si avvicina alla superficie del campione nella direzione Z, utilizzare una velocità del motore lenta.
4. Avvicinati all'esempio senza impegnarti facendo clic sul pulsante Approccio.

4. Raccolta dei dati

1. Sfondo
   1. Prima dell'acquisizione dei dati, raccogliere lo sfondo. Per la raccolta dello sfondo, assicurarsi che l'otturatore laser sia in posizione Aperta. Selezionare l'intervallo spettrale e la risoluzione (a seconda dello scopo dell'analisi) e il numero di scansioni e il numero di co-medie di sfondo. Questi sono generalmente raccomandati per essere alti (ad esempio, 1024 scansioni e 3 co-medie).
      NOTA: In generale, si raccomanda una risoluzione spettrale di 4 cm^-1 o 8 cm^-1 e intervalli spettrali di 3.200 cm^-1-2.800 cm^-1 e 1.800 cm^-1-900 cm^-1.
   2. Dopo l'acquisizione dello sfondo, salvare il file di sfondo. Il file non viene memorizzato automaticamente. Modificate la posizione dell'otturatore laser su Chiudi .
2. Campione – spettri singoli
   1. Premere il pulsante Attiva per interagire con l'esempio. Il sistema inizierà ad avvicinarsi alla superficie del campione, fino a quando non viene rilevato il contatto diretto.
      NOTA: il set point utilizzato in questo lavoro variava tra 0,15-2 V e i guadagni di feedback (I Gain e P Gain) erano in genere impostati su 3 e 10. Le sonde a contatto NIR2 sono comunemente utilizzate con il sistema nanoIR2 (modello: PR-EX-nIR2-10, frequenza di risonanza (kHz): 13 +/−4 kHz, costante di molla (N/m): 0,07−0,4 Nm^-1).
   2. Raccogliete un'immagine AFM per visualizzare la superficie. In primo luogo, eseguire la scansione di un'area più ampia (ad esempio, 50 x 50 μm) con una risoluzione spaziale inferiore (ad esempio, 200 x 200 punti) (Figura 1I).
      NOTA: i dati AFM-IR vengono sempre raccolti in modalità contatto, tuttavia, i dati AFM possono essere raccolti in modalità contatto o tocco.
   3. Dall'immagine di altezza/deflessione AFM, selezionare un'area specifica di interesse e ri-immaginerla con una risoluzione spaziale più elevata (Figura 1J–K). Assicurarsi che la velocità di raccolta dei dati sia appropriata, con un movimento lento della punta (ad esempio, velocità di scansione 0,2-0,4 Hz).
   4. Selezionare il punto di misurazione (ad esempio, singolo batterio) e spostare la punta sul punto.
   5. Allineare il laser IR. A tale scopo, utilizzare un numero d'onda in cui il campione assorbirà. Per i materiali biologici questo può essere, ad esempio, ammide I (1655 cm^-1). Assicurarsi che il filtro passa banda sia disattivato e fare clic su Avvia IR. Il grafico a destra nel nanoIRmetro (FFT della deflessione visualizzata come ampiezza vs frequenza) dovrebbe mostrare almeno un picco chiaro e il grafico a sinistra (deflessione vs tempo) dovrebbe avere una forma d'onda periodica. In caso contrario, procedere all'ottimizzazione dei punti IR.
      NOTA: anche se la trasformata di Fourier veloce (FFT) e la deflessione mostrano un profilo previsto, si consiglia di eseguire l'ottimizzazione degli spot IR per almeno diversi numeri d'onda, in cui sono previste bande.
   6. Ottimizzare gli hot spot per la raccolta dei dati IR utilizzando i valori del numero d'onda selezionati. Può essere utile utilizzare uno spettro IR convenzionale dei batteri (ad esempio, spettro ATR del pellet batterico) per identificare le posizioni delle bande e utilizzarle per ottimizzare i punti caldi. Selezionare vari valori di numero d'onda (ad esempio, 8-10) da varie regioni spettrali.
      NOTA: Se lo spettro IR convenzionale dei batteri di interesse non può essere raccolto prima della raccolta dei dati AFM-IR, gli spettri batterici disponibili in letteratura possono essere utilizzati come guida approssimativa. Il risultato dell'ottimizzazione di uno spot IR è un'immagine, che presenta una mappa del segnale di magnitudo FFT in ogni posizione x e y. La posizione con il segnale più grande viene selezionata automaticamente. Esempi di tali immagini sono forniti nel manuale del software³¹.
   7. Dopo aver ottimizzato gli spot IR per i valori del numero d'onda selezionati, definire i parametri di raccolta dei dati spettrali: regione spettrale, risoluzione spettrale, numero di scansioni e potenza applicata e inserirli nelle finestre appropriate del software. La risoluzione spettrale deve corrispondere alla risoluzione di fondo e la regione spettrale deve trovarsi all'interno della regione spettrale per la quale è stato raccolto lo sfondo.
      NOTA: Un set iniziale generico di parametri potrebbe essere: intervallo spettrale: 3200 cm^-1-2800 cm^-1 e 1800 cm^-1-900 cm^-1, risoluzione spettrale: 4 cm^-1 o 8 cm^-1, numero di scansioni: 512-2048.
   8. Se necessario, regolare la potenza del laser in base al segnale. In generale, valori compresi tra l'8% e il 10% della potenza del laser dovrebbero essere sufficienti per una buona qualità del segnale. Valori più elevati possono essere utilizzati con cautela, in quanto possono causare danni al campione.
      NOTA: la potenza percentuale del laser può variare a seconda del tipo di laser IR. I valori percentuali indicati qui sono per il laser OPO.
   9. Fare clic su Acquisisci per raccogliere lo spettro AFM-IR.
   10. Raccogliere nuovamente i dati AFM dalla stessa area dopo la raccolta dello spettro AFM-IR. Questo è altamente raccomandato in quanto rivelerà qualsiasi potenziale deriva e / o influenza distruttiva sul campione.
   11. Se lo spettro AFM-IR è soddisfacente e non si osserva alcuna influenza distruttiva sul campione, procedere con la raccolta dei dati. Se necessario, definite una serie di punti per la raccolta dei dati utilizzando l'opzione Array e l'immagine di altezza o deflessione AFM raccolta. Questa opzione permette di raccogliere spettri consecutivamente da ogni punto con gli stessi parametri spettrali definiti per un singolo spettro.
   12. Se l'immagine AFM raccolta dopo la raccolta dello spettro AFM-IR rivela un'influenza distruttiva sul campione (tipicamente un punto bruciato), ridurre la potenza; selezionate un punto diverso e ripetete i passaggi da 4.3.8 a 4.3.11.
   13. Se il segnale nello spettro AFM-IR non è soddisfacente, verificare la correttezza dell'ottimizzazione degli spot IR (passo 4.3.6). Se è corretto, aumentare leggermente la potenza del laser e ripetere i passaggi 4.3.7–4.3.11. Questo può essere ripetuto fino a raggiungere un segnale soddisfacente.
3. Esempio – approccio di imaging
   NOTA: si consiglia vivamente di registrare un singolo spettro AFM-IR del batterio prima di raccogliere un'immagine di distribuzione dell'intensità per un valore di numero d'onda selezionato.
   1. Registrare un'immagine AFM dell'area campione scelta. Per fare ciò, prima raccogli l'immagine AFM di un'area più ampia con una risoluzione spaziale inferiore (ad esempio, 50 x 50 μm, 200 x 200 punti), quindi seleziona una regione di interesse e raccogli un'immagine AFM con una risoluzione spaziale aumentata (come illustrato nella Figura 1I-K).
   2. Selezionare i valori del numero d'onda per l'imaging AFM-IR.
   3. Assicurarsi che lo spot IR del laser sia ottimizzato per i valori del numero d'onda selezionato (passaggio 4.3.6). Se lo spot IR non è ottimizzato per alcuni numeri d'onda (nessun massimo chiaro), ottimizzarlo per loro.
   4. Definire i parametri dell'area definita: la larghezza e l'altezza, il numero di punti dati in direzione X e Y.
      NOTA: se viene applicata la selezione consecutiva di punti dalle immagini AFM precedenti (come illustrato nella Figura 1I-K),i campi di larghezza e altezza verranno riempiti automaticamente, al momento della marcatura dell'area.
   5. Definire i parametri di acquisizione del segnale spettrale: la lunghezza d'onda, il numero di scansioni e la potenza del laser.
      NOTA: il numero di scansioni deve essere mantenuto entro limiti ragionevoli. 64 o 32 scansioni in genere consentono una quantità sufficiente di segnale.
   6. Definite i parametri del movimento della punta AFM facendo clic su Scan Rate. Maggiore è il numero di scansioni nel passaggio precedente e il numero di punti dati in direzione X, più lenti dovranno essere i movimenti della punta. La mancanza di regolazione tra questi parametri comporterà un movimento troppo veloce della punta, impedendo l'effettiva acquisizione di un numero definito di scansioni da ciascun punto.
      NOTA: ad esempio, per una raccolta appropriata di segnale IR con 64 co-aggiunte e 200 punti, impostare la velocità di scansione su 0,07 kHz.
   7. Assicurarsi che la casella Abilita imaging IR sia selezionata.
   8. Inizia l'imaging. AFM-IR dell'intensità del segnale al numero d'onda selezionato sarà raccolto contemporaneamente ai dati AFM da quell'area.
      NOTA: Quando si utilizza il laser OPO, è possibile raccogliere contemporaneamente l'immagine della frequenza di picco di risonanza del contatto. Questo può essere utilizzato per ottenere informazioni sulla rigidità relativa del campione in diverse posizioni.
   9. Utilizzare la finestra Sequenza di acquisizione per impostare una raccolta consecutiva di dati AFM-IR dalla stessa area con gli stessi parametri, ma per valori di numero d'onda diversi. Per fare ciò, apri la finestra Sequenza di acquisizione, digita ogni numero d'onda e definisci la potenza laser applicata (per ogni numero d'onda).
   10. Esportare i dati raccolti (AFM e AFM-IR, spettri singoli e imaging) in vari formati e analizzarli utilizzando metodi adeguati a specifici scopi di ricerca.

Risultati

Il protocollo descritto consente di ottenere una serie di tipi di distribuzioni cellulari di batteri sul substrato, a seconda della concentrazione iniziale del campione e della quantità di acqua aggiunta. La Figura 1 illustra gli esempi di immagini AFM (altezza e deflessione) registrate da monostrati e campioni monocellulari preparati utilizzando il protocollo descritto da batteri Gram-positivi(S. aureus)e Gram-negativi(Escherichia coli).

Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per l'imaging AFM-IR di strutture intra ed extracellulari di singoli batteri. Un esempio di questa applicazione è mostrato nella Figura 2, che dimostra i risultati del monitoraggio dei cambiamenti chimici localizzati spazialmente che si verificano durante la divisione di una cellula di S. aureus. Sebbene l'essiccazione all'aria sia comunemente considerata un approccio di fissazione per la preparazione batterica, i batteri, per natura, mostrano una resistenza molto elevata a fattori esterni come la temperatura e sono stati segnalati per sopravvivere alla disidratazione³². I risultati qui presentati sono stati acquisiti da un campione essiccato all'aria. La formazione di un setto, che si verifica prima della divisione cellulare, è stata osservata e monitorata tramite imaging AFM (Figura 2A-D) mediante raccolta di 12 immagini della stessa area consecutivamente (raccolta di una singola immagine ≈ 20 min). La Figura 2A-D mostra 4 immagini AFM selezionate, con un tempo tra la raccolta di ciascuna immagine di circa 40 minuti. La struttura formata (setto) è alta 45 nm. Il setto formato è chiaramente visibile nelle immagini di altezza e deflessione AFM (Figura 2E-F). Gli spettri AFM-IR registrati dall'area cellulare e del setto (Figura 2G, punti di origine contrassegnati in Figura 2F) sono stati normalizzati alla banda ammidica I prima del confronto, per minimizzare l'influenza del diverso spessore del campione tra i punti di raccolta dei dati. Lo spettro AFM-IR del setto è caratterizzato da una maggiore intensità relativa delle bande a 1240 e 1090 cm^-1 rispetto allo spettro AFM-IR raccolto dall'area cellulare. Questi sono attribuiti a gruppi di carboidrati e fosfodiesteri di componenti della parete cellulare (tra cui, ad esempio, peptidoglicano e acido teicoico)²².

Il protocollo descritto può anche essere utilizzato per il confronto di un singolo spettro tra un numero di campioni diversi. Un esempio di questa applicazione insieme ai risultati è mostrato nella Figura 3 e nella Figura 4. Lo scopo dello studio è determinare i cambiamenti chimici che si verificano a seguito dello sviluppo in vivo della resistenza intermittente alla vancomicina in S. aureus (VISA). A tal fine, sono state raccolte coppie cliniche di campioni da pazienti, con il ceppo genitore isolato al momento del ricovero in ospedale e prima della terapia antibiotica (vancomicina suscettibile S. aureus, VSSA) e il ceppo figlio isolato dallo stesso paziente dopo l'ammissione di antibiotici e l'insufficienza clinica. I campioni sono stati ulteriormente coltivati su terreno agar e preparati secondo il protocollo (Figura 3A-B). Gli spettri AFM-IR sono stati raccolti da più singoli batteri (e più campioni) per VSSA e VISA e successivamente analizzati utilizzando diversi approcci chemiometrici (Figura 3C).

Non sono state osservate differenze morfologiche tra cellule VSSA e VISA (Figura 4A–C). Tuttavia, gli spettri AFM-IR (Figura 4D,F) e i loro derivati secondi (Figura 4E,G) hanno dimostrato una chiara differenza nella composizione chimica tra ceppi resistenti e sensibili. L'intensità relativa delle bande associate ai gruppi di carboidrati e fosfodiestere dai componenti della parete cellulare (in particolare, la banda a 1088 cm^-1) è chiaramente aumentata nel ceppo resistente, rispetto alla controparte suscettibile. Da notare il fatto che tutti gli spettri ricodificati (VISA: 81, VSSA: 88) mostrano una piccola deviazione standard. Ciò dimostra una buona riproducibilità dei dati registrati da vari campioni preparati dallo stesso ceppo, in quanto non era possibile alcuna discriminazione tra spettri registrati da campioni diversi dello stesso ceppo. Le differenze osservate hanno indicato un aumento dello spessore della parete cellulare in ceppi resistenti, rispetto alla controparte suscettibile, che rimane in accordo con altri rapporti di letteratura^33,34.

Figura 1: Immagini AFM rappresentative di vari campioni batterici per misurazioni AFM-IR. A seconda della diluizione sul substrato, il protocollo consente di ottenere multistrati e monostrati di batteri e campioni unicellulari. Immagini AFM rappresentative di: (A-D) monostrato e (E-H) campione monocellulare per (A, B, E, F) Gram-positivo (S. aureus) e (C, D, G, H) Gram negativo (E. coli) batteri. (A,C,E,G) mostrano immagini di altezza e (B,D,F,H) mostrano immagini di deflessione corrispondenti. Dimensioni delle aree immaginate: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I–K) selezione consecutiva di un'area per la mappatura AFM-IR. Ciò si ottiene utilizzando l'imaging AFM con risoluzione spaziale crescente nell'esempio di una singola cellula di S. aureus. Ogni immagine viene raccolta campionando 200 x 200 punti, con una risoluzione spaziale crescente dovuta alla riduzione delle dimensioni dell'area grafata. Dimensioni delle aree con immagini: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm e (K) 2,24 x 2,24 μm. Il quadrato nero in (I) segna l'area immaginata in (J). Il quadrato nero in (J) segna l'area immaginata in (K). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Monitoraggio della divisione cellulare di S. aureus tramite AFM-IR. (A–D) Immagini AFM della cellula di S. aureus che mostrano la formazione del setto prima della divisione cellulare. Dimensione dell'area dell'immagine: 2 x 2 μm. Le immagini sono state selezionate da una serie più ampia (12 immagini registrate ogni 20 min) e rappresentano i dati registrati ogni 40 min.(E-F)AFM altezza e deflessione dell'immagine registrata alla fine della formazione del setto cellulare con punti marcati di raccolta di spettri AFM-IR. Dimensioni dell'area grafata 1,17 x 1,15 μm. L'altezza della struttura appena formata è di 45 nm. (G) Spettri AFM-IR registrati dall'area cellulare (nera) e dall'area del setto (rosso) (contrassegnati in (F)), nell'intervallo 1400-900 cm^-1. Entrambi gli spettri sono stati normalizzati alla banda ammidica I e dimostrano un aumento dell'intensità relativa dei componenti della parete cellulare dal setto. Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.²². Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Una panoramica del progetto sperimentale per lo studio AFM-IR della resistenza antimicrobica. (A)Origine del campione e preparazione iniziale: il ceppo genitore suscettibile è stato raccolto da un paziente prima della terapia antibiotica e il ceppo resistente alla figlia è stato ottenuto dallo stesso paziente dopo terapia antibiotica e fallimento clinico (sviluppo di resistenza in vivo). I batteri sono stati isolati e coltivati all'agar heart infusion (HI) per 16 ore a 37 °C. B)Successiva preparazione del campione per aFM-IR, compresa la raccolta del campione seguita dal lavaggio della paletta batterica (3×) e dalla deposizione del campione. (C) Raccolta e analisi dei dati AFM-IR: altezza AFM e spettro AFM-IR (1800-900 cm^-1). Dimensioni dell'area grafata AFM: 1,7 x 1,4 μm. Lo spettro AFM-IR è stato raccolto dal centro della cellula. I dati sono stati successivamente analizzati utilizzando approcci chemiometrici, compresa l'analisi gerarchica dei cluster. Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.¹⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati AFM e AFM-IR dello studio dei cambiamenti chimici nella vancomicina intermedia S. aureus (VISA) rispetto alla vancomicina suscettibile a S. aureus (VSSA) in coppie cliniche. Immagini AFM di campioni a cella singola (A-B) VISA e (C) VSSA. Dimensioni delle aree immaginate: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Spettri AFM-IR medi e loro derivati secondi (F-G) per: (D, F) celle VISA e (E, G) VSSA, nell'intervallo spettrale 1800-900 cm^-1. Gli spettri presentati sono una media di 81 (VISA) e 88 (VSSA) spettri individuali e sono presentati insieme alla deviazione standard (SD). La media è stata condotta dopo la normalizzazione di tutti i singoli spettri insieme. Le bande maggiori sono contrassegnate in (F-G). Questa figura è stata modificata da K. Kochan et al.¹⁹. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Deriva dell'immagine sulla registrazione consecutiva di mappe AFM-IR a valori di numero d'onda selezionati per la cella di S. aureus.  (Riga superiore): Le immagini AFM sono state registrate contemporaneamente alle corrispondenti mappe AFM-IR(riga inferiore)in base all'intensità del segnale IR ai valori del numero d'onda selezionati. I valori del numero d'onda (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm^-1) sono annotati sopra la riga inferiore. Ogni set (immagine AFM e mappa AFM-IR) è stato registrato direttamente dopo l'immagine precedente (circa 40 minuti per set). La dimensione dell'area grafata/mappata: 1,54 x 1,57 μm. Una chiara deriva è visibile tra le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'utilità della spettroscopia IR per la caratterizzazione di una vasta gamma di campioni biologici nel contesto della loro composizione chimica è ben consolidata. Negli ultimi dieci anni, la spettroscopia IR è emersa come uno strumento promettente per gli studi batterici^{12,13,14,15,16,17.} Continua ad attirare un notevole interesse nel campo della microbiologia, come una delle poche tecniche che consentono una caratterizzazione fenotipica attraverso la composizione chimica. In questo contesto, il principale svantaggio della microscopia FTIR convenzionale risiede nella limitata risoluzione spaziale, impedendo studi su singole cellule e subcellulari sui batteri. In effetti, le piccole dimensioni dei batteri rappresentano un impedimento non solo per l'IR, ma per la stragrande maggioranza delle tecniche. Pertanto, gli strumenti di ricerca disponibili per gli studi su singole cellule e subcellulari sui batteri sono significativamente limitati. La combinazione di AFM con IR consente di superare la limitazione della risoluzione spaziale della spettroscopia IR, fornendo un nuovo strumento per la ricerca batterica, in grado di sondare su scala nanometrica la composizione chimica.

La tecnica non si limita agli studi su singole cellule e consente di sondare una varietà di campioni, di spessore vario. Indubbiamente, una preparazione del campione pulita e attenta è fondamentale per ottenere immagini di alta qualità. Il protocollo qui fornito fornisce un metodo per preparare campioni multistrato, monostrato e/o a singola cellula di vari batteri (Figura 1). Il campione preparato dipende da diversi fattori, tra cui la carica batterica iniziale, la diluizione post-lavaggio e un'ulteriore diluizione sul substrato. La quantità di campione ottenuta dopo aver diluito il pellet lavato e prima della deposizione sul substrato consente tipicamente la preparazione di numerosi campioni. Pertanto, per ottenere la distribuzione desiderata del campione sul substrato, è spesso utile preparare una serie di campioni, che vanno nella loro diluizione. Per gli studi finalizzati alla raccolta di spettri AFM-IR piuttosto che all'imaging subcellulare, modificare la quantità di campione (ad esempio, da monostrato a multistrato) può essere utile per aumentare l'intensità del segnale.

Un altro aspetto critico nella preparazione del campione è l'appropriata rimozione dei residui medi. A seconda dei metodi di coltivazione del campione selezionati, il campione viene raccolto da un mezzo liquido o da una piastra di agar. In entrambi i casi, è probabile che il residuo medio sia presente nel campione, anche se in misura molto minore al momento della raccolta da piastre di agar. Poiché i mezzi di crescita batterica contengono un'abbondanza di vari componenti biologici, è fondamentale garantire un'adeguata rimozione del mezzo. Raccomandiamo tre lavaggi con acqua ultrapura per i campioni di piastre di agar e almeno quattro lavaggi per i campioni raccolti dal mezzo. Il numero di lavaggi può essere aumentato, se necessario; tuttavia, per il confronto tra vari campioni, è importante mantenerlo coerente tra i campioni. Il protocollo dimostrato utilizza acqua, piuttosto che solventi come la soluzione tampone fosfato (PBS) o la soluzione salina. Sia pbS che soluzione salina portano alla formazione di cristalli dopo l'essiccazione all'aria, che può danneggiare i batteri. Inoltre, entrambi sono una fonte di bande IR intense, con PBS, in particolare, contenente più bande nella regione delle impronte digitali. La mancanza di capacità per l'uso di soluzione salina o PBS, rappresenta attualmente un limite importante per la tecnica. Tipicamente, l'uso di acqua per il lavaggio non causa alcuna influenza distruttiva sui batteri; tuttavia, si dovrebbe prestare attenzione e, se possibile, il tempo di esposizione all'acqua dovrebbe essere limitato. Se il protocollo di preparazione del campione deve essere messo in pausa nella fase di lavaggio, si consiglia di lasciare il campione in forma pellettizzata dopo aver rimosso l'acqua. Questo è di particolare importanza per i batteri Gram-negativi, contenenti una parete cellulare più sottile in quanto sono più inclini alla rottura.

Per garantire dati AFM-IR adeguati e di alta qualità, diversi aspetti del protocollo di raccolta dati sono di fondamentale importanza. In primo luogo, la corretta raccolta dello sfondo è essenziale per l'acquisizione dei dati. In particolare, è necessario il mantenimento di livelli di umidità stabili durante tutta la raccolta dello sfondo e tra la raccolta dello sfondo e del campione. Per garantire ciò, si consiglia di spurgare lo strumento con azoto e mantenere i livelli di umidità non superiori al 25%. La mancanza di spurgo può imporre una limitazione significativa, in particolare in luoghi con elevata umidità. In secondo luogo, dovrebbe essere evidenziata l'importanza di una corretta ottimizzazione dei punti IR. Per ottenere i migliori risultati, la conoscenza a priori della posizione dei massimi di banda può essere utile. Ad esempio, uno spettro IR convenzionale di pellet batterico può essere utilizzato per determinare le posizioni delle bande attese da un campione. Se ciò non è possibile acquisire, come approccio alternativo, l'utente può utilizzare gli spettri IR disponibili in letteratura o iniziare l'ottimizzazione utilizzando una posizione di banda che è ragionevole aspettarsi nel batterio (ad esempio, ammide I e ammide II). In terzo luogo, per la raccolta dei dati, è importante sottolineare l'importanza di un'attenta selezione della potenza (che consente di ottenere un buon rapporto S / N), in quanto può avere un effetto distruttivo. La potenza consigliata dipende dallo spessore del campione, con guida approssimativa disponibile nel manuale dello strumento³¹. Raccomandiamo di testare empiricamente lo stato del campione post-misurazione mediante la raccolta di un'immagine AFM, in quanto rivelerà qualsiasi influenza distruttiva. Inoltre, la raccolta di immagini AFM dalla stessa area prima e dopo la raccolta di spettri AFM-IR serve come una buona conferma che non si è verificata alcuna deriva e che gli spettri provengono effettivamente dal punto selezionato nella cellula. La possibilità di deriva è particolarmente importante quando si applica la modalità di imaging, attraverso l'imaging consecutivo dell'intensità IR a valori di numero d'onda selezionati. Un esempio di questo è illustrato nella Figura 5. L'area definita all'inizio dell'esperimento è stata definita ed è pensata per essere coerente per tutti i valori del numero d'onda. Tuttavia, è visibile una chiara deriva tra ogni immagine di altezza AFM (e l'intensità del numero d'onda IR corrispondente), con un tempo di acquisizione di ciascuna mappa di circa 40 minuti. Per questo ciò, per gli utenti che raccolgono dati di imaging, si consiglia di selezionare sempre un'area leggermente più grande del campione di interesse, per garantire che anche in caso di esistenza di deriva, il campione di interesse rimanga all'interno dell'area stessa.

I potenziali limiti del protocollo includono la mancanza di capacità di raccogliere dati in uno stato idratato nelle soluzioni fisiologiche (ad esempio, soluzione salina o PBS) sopra descritte. Inoltre, soprattutto nelle aree ad alta umidità, c'è spesso bisogno di spurgo dell'azoto. Inoltre, il protocollo consente di sondare organismi fino a 100 nm di dimensione, escludendo la possibilità del suo utilizzo per strutture più piccole. Sebbene questo possa essere superato utilizzando un laser diverso (ad esempio, laser a cascata quantistica che consente di raggiungere la risoluzione spaziale di 20 nm), è anche associato a una gamma spettrale limitata e alle difficoltà nell'ottenere un buon rapporto segnale / rumore. Infine, il sondaggio di superfici morbide può rappresentare una sfida con la punta che non rileva correttamente la superficie e procede oltre il punto di contatto, fino alla rottura. Anche se questo in genere non è un problema con i campioni batterici, può verificarsi su misurazioni di campioni più morbidi. In questi casi, si consiglia di tentare di impegnarsi sulla superficie pulita del substrato in prossimità del campione.

Il protocollo descritto può essere utilizzato per numerosi tipi di ricerca batterica, compresi studi comparativi tra vari campioni e l'esame subcellulare. I dati possono essere analizzati utilizzando approcci chemiometrici per singoli spettri e modalità di imaging³⁵, a seconda dello scopo della ricerca. Inoltre, il protocollo può anche essere modificato per l'applicazione ad altro materiale biologico (come funghi, lieviti, cellule, ecc.), attraverso l'aggiunta di fissazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Disco per campioni in metallo AFM	PST ProSciTech Pty Ltd	GA530-15	Consigliato 15 mm
Anasys AFM-IR nanoIR2	Anaysys Instruments		Modello: nanoIR2
Modalità di contatto NIR2 Sonde per nanoIR 2	Bruker / Anasys	Instruments-Modello	: Modello: PR-EX-NIR2
Heraeus Pico 17 Microcentrifuga	Thermo Scientific	-	-
Matlab	Mathworks	Inc-Software	di analisi dati multivariato
Provette per microcentrifuga, 1,5 mL	Heathrow Scientific	HEA4323	Può essere sostituito con qualsiasi altra provetta per microcentrifuga
Strumento NanoIR 2	Bruker / Anasys Instruments	-	-
Cassetta degli attrezzi PLS	Mathworks	Inc-GUI	per Matlab
Mezzo batterico selezionato (ad es. HBA Columbia Plates)	Thermo Fisher	PP2001	Il tipo di terreno fornito è un esempio e può essere sostituito da altri, a seconda del tipo di esperimento
Ceppo batterico selezionato	:		la fonte dipende dall'obiettivo della ricerca (isolati di pazienti, ceppi di ATCC, ecc.)
Substrato (ad es. CaF2)	Crystran	CAFP13-2R	Dimensioni consigliate: 13 mm Ø x 2,0 mm
Pipetta per puntali 1000 &; l	Pipetta Axygen	T-1000-B-Tip
200 & micro; l	Pipetta Axygen	T-200-C-Tip
0,5-10 &; l	Axygen	T-300-R-Acqua
ultrapura	-	-	-