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Cancer Research

HiBiT CRISPR सेल लाइनों का उपयोग करके लक्षित प्रोटीन अवक्रमण यौगिकों की उच्च-थ्रूपुट सेलुलर प्रोफाइलिंग

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Promega Corporation

Summary

यह प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन डिग्रेडेशन कैनेटीक्स के मात्रात्मक लुमिनेसेंट डिटेक्शन का वर्णन करता है, जिसे एक लक्ष्य प्रोटीन से जुड़े एंटीबॉडी मुक्त अंतर्जात प्रोटीन डिटेक्शन टैग को व्यक्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके इंजीनियर किया गया है। मात्रात्मक गिरावट मापदंडों, दर, डीमैक्स, डीसी 50 और डीमैक्स50 की गणना और प्राप्तकरने के लिए विस्तृत निर्देश शामिल हैं।

Abstract

लक्षित प्रोटीन क्षरण यौगिक, जिसमें आणविक गोंद या चिमेरा को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस शामिल हैं, छोटे अणु दवा की खोज में एक रोमांचक नई चिकित्सीय पद्धति है। यौगिकों का यह वर्ग लक्ष्य प्रोटीन और ई 3 लिगेज मशीनरी प्रोटीन को निकटता में लाकर प्रोटीन क्षरण को प्रेरित करता है जो यूबिकिटिन-प्रोटीसोमल मार्ग (यूपीपी) के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन को सर्वव्यापी और अंततः नीचा दिखाने के लिए आवश्यक होता है। हालांकि, उच्च-थ्रूपुट फैशन में लक्ष्य प्रोटीन गिरावट की रूपरेखा, गिरावट प्राप्त करने के लिए आवश्यक सेलुलर मार्गों की जटिलता को देखते हुए अत्यधिक चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। यहां हम 11 एमिनो एसिड हाईबीआईटी टैग के साथ लक्ष्य प्रोटीन के सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 अंतर्जात टैगिंग के उपयोग के आधार पर एक प्रोटोकॉल और स्क्रीनिंग रणनीति प्रस्तुत करते हैं, जो एक लुमिनेसेंट प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एलजीबीआईटी प्रोटीन के लिए उच्च आत्मीयता के साथ पूरक है। अंतर्जात टैग के साथ इन सीआरआईएसपीआर लक्षित सेल लाइनों का उपयोग ल्यूमिनेसेंट प्लेट-आधारित रीडर का उपयोग करके लुमिनेसेंट सिग्नल की निगरानी करके वास्तविक समय, गतिज लाइव सेल या एंडपॉइंट लिटिक मोड में यौगिक प्रेरित गिरावट को मापने के लिए किया जा सकता है। यहां हम विभिन्न प्रारूपों के लिए अनुशंसित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल को रेखांकित करते हैं, और दर, डीमैक्स, डीसी50, डीमैक्स50 के प्रमुख गिरावट मापदंडों की गणना के साथ-साथ सेल व्यवहार्यता परख के साथ मल्टीप्लेक्सिंग का भी वर्णन करते हैं। ये दृष्टिकोण प्रासंगिक सेलुलर पृष्ठभूमि में लक्ष्य प्रोटीन की अंतर्जात अभिव्यक्ति और विनियमन को बनाए रखते हुए प्रारंभिक चरण के यौगिकों की तेजी से खोज और ट्राइएजिंग को सक्षम करते हैं, जिससे लीड चिकित्सीय यौगिकों के कुशल अनुकूलन की अनुमति मिलती है।

Introduction

लक्षित प्रोटीन क्षरण छोटे अणु दवा की खोज में सबसे तेजी से बढ़ते क्षेत्रों में से एक के रूप में उभरा है, जो कैंसर के उपचार के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी आणविक गोंद यौगिकों (जैसे, आईएमआईडी) की चिकित्सीय सफलता से बहुत मजबूत है, और चिमेरायौगिकों को लक्षित करने वाले प्रोटियोलिसिस के प्रारंभिक नैदानिक परीक्षण डेटा का वादा करता है 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12. लक्षित प्रोटीन अवक्रमण यौगिक ई 3 लिगेज मशीनरी प्रोटीन 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 के साथ एक लक्ष्य प्रोटीन को निकटता में लाकर कार्य करते हैं . ई 3 लिगेज में लक्ष्य प्रोटीन की यह यौगिक-प्रेरित भर्ती यूबिकिटिन प्रोटीसोमल मार्ग (यूपीपी) 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन सर्वव्यापी और गिरावट की ओर ले जाती है . ऐतिहासिक रूप से, छोटे अणु दवा खोज स्क्रीनिंग कार्यक्रमों ने गतिविधि का आकलन करने और क्रम यौगिकों को रैंक करने के लिए प्रारंभिक जैव रासायनिक परख पर भरोसा किया है। हालांकि, इसने लक्षित प्रोटीन डिग्रेडर्स के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत की है, जिनकी अंतिम गतिविधि, प्रोटीसम के माध्यम से गिरावट, सेलुलर घटनाओं के कैस्केड 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17 पर निर्भर है। 18. सफल लक्ष्य क्षरण के लिए आवश्यक प्रोटीन परिसरों के कई मार्गों और जटिलता के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग और प्रारंभिक यौगिकों की ट्राइएजिंग के लिए सेलुलर परख दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, सेलुलर पर्यावरण के संदर्भ में उच्च-थ्रूपुट फैशन में लक्ष्य प्रोटीन गिरावट की निगरानी के लिए प्रौद्योगिकियों की उपलब्धता में गंभीर कमीहै। यहां हम CRISPR/Cas9 का उपयोग करके वास्तविक समय गतिज लाइव सेल या एंडपॉइंट लिटिक डिग्रेडेशन गतिविधि मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करेंगे, जो डाइग्रेडर यौगिकों 10,11,18,19, 19 के साथ उपचार के बाद ल्यूमिनेसेंट माप के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के नुकसान की निगरानी करने के लिए अंतर्जात रूप से टैग किए गए HiBiT लक्ष्य सेल लाइनोंका उपयोग करते हैं।

चिकित्सीय लक्ष्यों के सफल क्षरण को प्राप्त करने और दवा योग्य प्रोटिओम का विस्तार करने के लिए, कई दृष्टिकोण और प्रकार के डिग्रेडर्स उभरे हैं जो विनाश के लिए प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित कर सकते हैं, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली, लाइसोसोम, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली, साइटोप्लाज्म और नाभिक21-57 पर या इसमें स्थानीयकृत शामिल हैं। सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किए गए यौगिकों के दो प्राथमिक वर्ग आणविक गोंद और प्रोटीन हैं जो सिमेरा 2,4,5,6,7,12,26 को लक्षित करते हैं। आणविक गोंद मोनोवेलेंट होते हैं, इस प्रकार आमतौर पर आकार में छोटे होते हैं, और ई 3 लिगेज घटक 2,12,26 से जुड़ने पर लक्ष्य प्रोटीन के साथ एक नया प्रोटीन: प्रोटीन इंटरैक्शन इंटरफ़ेस की सुविधा प्रदान करते हैं। वे सबसे अधिक डिग्रेडर्स हैं जो सेरेब्लॉन (सीआरबीएन) ई 3 लिगेज घटक 2,12,26,55,56,57 से जुड़ते हैं। हाल ही में हालांकि डीसीएएफ 1558,59,60 और डीडीबी 1 45 के लिए सीडीके / साइक्लिन भर्ती जैसे अन्य ई 3 लिगेज मशीनरी का उपयोग करने वाले रोमांचक नए उदाहरण यौगिकों के इस वर्ग के विस्तार की क्षमता दिखाते हैं। इसके विपरीत, प्रोटैक बड़े, द्विसंयोजक अणु होते हैं, जिसमें एक लक्ष्य बाध्यकारी लिगैंड होता है, जो अक्सर एक अवरोधक होता है, जो रासायनिक लिंकर के माध्यम से ई 3 लिगेज हैंडल 1,3,4,5,7,13 तक पुल किया जाता है। जैसे, ये यौगिक ई 3 लिगेज और लक्ष्य प्रोटीन 1,3,4,5,7,13 दोनों को सीधे बांधने में सक्षम हैं। इन द्विसंयोजक अणुओं के माध्यम से कई प्रोटीनों को नीचा दिखाया गया है, और सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले ई 3 लिगेज हैंडल या तो सीआरबीएन या वॉन हिप्पेल लिंडौ (वीएचएल) 1,3,4,5,7,13 की भर्ती करते हैं। हालांकि, प्रोटियोलिसिस डिजाइन को लक्षित करने वाले चिमेरा में ई 3 लिगेज भर्ती के लिए उपलब्ध हैंडल की संख्या तेजी से बढ़ रही है, जो विभिन्न लक्ष्य वर्गों को नीचा दिखाने के साथ-साथ सेल- या ऊतक-प्रकार विशिष्टता24,48,61,62 को बढ़ाने की क्षमता के साथ यौगिकों के इस वर्ग की क्षमताओं का विस्तार कर रही है। . एक लक्ष्य प्रोटीन को संलग्न करने की न्यूनतम आवश्यकता के साथ संयुक्त, यहां तक कि सीमांत आत्मीयता के साथ, गिरावट यौगिक दवा योग्य प्रोटिओम का विस्तार करने का वादा करते हैं।

प्रोटीन हानि की सेलुलर गतिशीलता को चिह्नित करना, साथ ही उपचार के बाद संभावित प्रोटीन वसूली, अवक्रमण यौगिक समारोह और प्रभावकारिता को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि पश्चिमी ब्लॉट एंटीबॉडी परख या मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रासंगिक सेलुलर प्रणालियों में अंतर्जात प्रोटीन स्तर के परिवर्तनों का अध्ययन करना संभव है, इन दृष्टिकोणों को उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रारूपों के अनुकूल बनाना मुश्किल है, सीमित परिमाणीकरण क्षमता है, या कई समयबिंदुओं पर गतिज परिवर्तनों को मापने की क्षमता है। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हमने अंतर्जात प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन की निगरानी के लिए एक प्लेट-आधारित सेलुलर ल्यूमिनेसेंट सिस्टम विकसित किया है, जो 11 एमिनो एसिड टैग, हाईबीआईटी के सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 के माध्यम से जीनोमिक सम्मिलन का उपयोग करता है। यह पेप्टाइड अपने सब्सट्रेट 18,19,20,63 की उपस्थिति में उज्ज्वल ल्यूमिनेसेंस का उत्पादन करने के लिए अपने बाध्यकारी साथी, एलजीबीआईटी के लिए उच्च आत्मीयता के साथ पूरक है, जिससे ये टैग किए गए अंतर्जात प्रोटीन कोशिकाओं या लाइसेट में ल्यूमिनेसेंट हो जाते हैं 18,19,20,63 . एक लुमिनोमीटर उपकरण के साथ मापा गया सापेक्ष प्रकाश इकाइयां (आरएलयू) सीधे टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन स्तर 18,19,20,63 के आनुपातिक हैं। स्थिर लूसिफेरस सब्सट्रेट्स के विकास के साथ, 24-48 घंटे के समय सीमा पर वास्तविक समय गतिज प्रोटीन स्तर माप 18,53,64 संभव हैं। यह किसी भी दिए गए यौगिक एकाग्रता पर किसी भी दिए गए लक्ष्य के लिए एक पूर्ण गिरावट प्रोफ़ाइल के निर्धारण की अनुमति देता है, जिसमें प्रारंभिक गिरावट दर, गिरावट अधिकतम (डीमैक्स), और यौगिक उपचार के बाद वसूली का मात्रात्मक विश्लेषणशामिल है। यदि अवक्रमण यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग की जाती है, हालांकि, समापन बिंदु विश्लेषण भी आसानी से विभिन्न दवा सांद्रता और निर्दिष्ट समय पर 384-वेल प्रारूप में किया जा सकता है।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल लक्षित प्रोटीन क्षरण यौगिकों के लिए सेलुलर स्क्रीनिंग रणनीतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो सभी प्रकार के डिग्रेडर्स के लिए लागू होते हैं। इन प्रोटोकॉल के साथ HiBiT CRISPR सेल लाइनों का उपयोग, हालांकि, प्रोटीन क्षरण तक सीमित नहीं है, बल्कि वे किसी भी अंतर्जात लक्ष्य प्रोटीन स्तर की निगरानी के लिए सामान्य उपकरण हैं जिन्हें यौगिकों या यहां तक कि प्रतिरोध तंत्र 20,65,66 के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपचार के बाद संशोधित किया जा सकता है। इन ल्यूमिनेसेंट-आधारित पहचान विधियों के लिए एक पूर्व-आवश्यकता एक सीआरआईएसपीआर अंतर्जात रूप से टैग की गई हाईबीआईटी लक्ष्य सेल लाइन है, जो महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संवेदनशील ल्यूमिनेसेंट डिटेक्शन को सक्षम बनाता है, जबकि अभी भी अंतर्जात लक्ष्य अभिव्यक्ति और देशी प्रमोटर विनियमन 18,19,20 को बनाए रखता है। जीनोमिक टैग के सम्मिलन के लिए क्रिसआरपी/कैस9 का उपयोग करने में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, विशेष रूप से स्केलेबिलिटी20 में और पहचान की उच्च संवेदनशीलता के साथ, सीआरआईएसपीआर पूल या क्लोन सहित विभिन्न प्रारूपों में या तो विषमयुग्मी या होमोजीगोस एलील सम्मिलन के साथक्लोन 18,19,20। अंतर्जात टैगिंग के बदले कोशिकाओं में HiBiT या अन्य रिपोर्टर संलयन की बहिर्जात अभिव्यक्ति का उपयोग संभव है, लेकिन प्रोटीन ओवरएक्प्रेशन14,18 के साथ सिस्टम का उपयोग करके महत्वपूर्ण सावधानी बरती जानी चाहिए। ये वास्तविक यौगिक शक्ति और प्रोटीन रिकवरी गतिशीलता14,18 को समझने में कलाकृतियों को जन्म दे सकते हैं, जिसमें लक्ष्य गिरावट के बाद सक्रिय संभावित ट्रांसक्रिप्शनल फीडबैक लूप शामिल हैं। इसके अलावा, कम शक्ति वाले प्रारंभिक चरण के यौगिकों को याद किया जा सकता है, और स्क्रीनिंग में खुद को झूठे नकारात्मक के रूप में पेश किया जा सकता है। चूंकि प्रोटीन हानि यौगिक-प्रेरित विषाक्तता और कोशिका मृत्यु के परिणामस्वरूप हो सकती है, यहां वर्णित प्रोटोकॉल में अत्यधिक अनुशंसित, लेकिन वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता लुमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट परख शामिल हैं जो गिरावट प्रोटोकॉल के साथ जोड़े जाते हैं। प्रोटोकॉल के दो प्रमुख खंड हैं, लिटिक एंडपॉइंट और लाइव सेल काइनेटिक स्क्रीनिंग। उन अनुभागों में से प्रत्येक के भीतर, समापन बिंदु या गतिज प्रारूपों में मल्टीप्लेक्स सेल व्यवहार्यता माप के लिए विकल्प शामिल हैं। टैग किए गए अंतर्जात प्रोटीन के परिवर्तनों की निगरानी के लिए कोशिकाओं में एलजीबीआईटी के साथ पूरक की आवश्यकता होती है। इसलिए, गतिज स्क्रीनिंग अनुभाग इसकी शुरूआत के लिए महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल का संदर्भ देता है, जिसे क्षणिक या स्थिर अभिव्यक्ति के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है और लाइव सेल ल्यूमिनेसेंट माप करने के लिए आवश्यक है। यहां प्रस्तुत सभी दृष्टिकोण यौगिकों के तेजी से रैंक ऑर्डरिंग और गतिविधि मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, जिससे प्रारंभिक चरण यौगिक स्क्रीनिंग प्रयासों और लीड डिग्रेडर्स की अधिक तेजी से पहचान हो सकती है।

यह प्रोटोकॉल एक HiBiT CRISPR सेल लाइन के संयोजन में गिरावट यौगिकों के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है। कई लक्ष्यों के लिए हाईबिट सीआरआईएसपीआर सम्मिलन के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल को हाल के कई प्रकाशनों 18,19,20 में रेखांकित किया गया है।

Protocol

1. वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता प्रतिदीप्ति विश्लेषण के साथ लिटिक प्रारूप में हाईबिट सीआरआईएसपीआर लक्ष्य प्रोटीन के साथ समापन बिंदु गिरावट अध्ययन

  1. स्तनधारी अनुयायी या निलंबन सेल लाइन की तैयारी और चढ़ाना
    1. पासिंग और सेल विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त सेल मीडिया में कमजोर पड़ने से सेल घनत्व को 2.22 x 105 / एमएल तक समायोजित करें।
    2. प्रति प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्थिति में न्यूनतम 3 कुओं के साथ प्लेटों में कोशिकाओं को वितरित करें। 96-अच्छी तरह से सफेद प्लेटों में सेल निलंबन के प्रति कुएं में 90 μL (20,000 कोशिकाएं) वितरित करें। 384-वेल प्रारूप के लिए, 384-अच्छी तरह से सफेद प्लेटों में सेल निलंबन के प्रति कुएं 36 μL (8,000 कोशिकाएं) वितरित करें।
  2. यौगिकों की तैयारी और जोड़
    1. 100% डीएमएसओ में 1,000 x अंतिम सांद्रता पर क्रमिक रूप से पतला प्रोटेक या डिग्रेडर टेस्ट यौगिक प्लेटें तैयार करें। फिर इसे सेल कल्चर माध्यम में 10x अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। माध्यम में डीएमएसओ की एक समान मात्रा जोड़ें, जिसे बिना किसी यौगिक डीएमएसओ नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
    2. 96-वेल प्रारूप के लिए 10x यौगिक के 10 μL जोड़ें और 90 μL कोशिकाओं के लिए समाधान नियंत्रित करें। 384-वेल प्रारूप के लिए 10x यौगिक के 4 μL जोड़ें और 36 μL कोशिकाओं के लिए समाधान नियंत्रित करें।
    3. प्लेटों को एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर वांछित समय के लिए या उन स्थितियों में इनक्यूबेट करें जो उनके विकास के लिए इष्टतम हैं।
      नोट: चूंकि यह एक समापन बिंदु परख है, कई समय बिंदुओं के परीक्षण के लिए प्रत्येक समय बिंदु के लिए अलग-अलग अवक्रमण प्लेटों की तैयारी की आवश्यकता होगी, जैसा कि ऊपर चरण 1.1.2 में वर्णित है। यौगिक-मध्यस्थता गिरावट का पता लगाने के लिए इनक्यूबेशन समय अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं और यौगिक एकाग्रता पर भी निर्भर होते हैं। सुझाए गए प्रारंभिक समय बिंदु 6 घंटे और 24 घंटे होंगे।
    4. यदि वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता माप के बिना समापन बिंदु लुमिनेसेंट डिटेक्शन को मापते हैं, तो सीधे नीचे दिए गए चरण 1.3 पर आगे बढ़ें। यदि सेल व्यवहार्यता माप के साथ मल्टीप्लेक्सिंग कर रहे हैं, तो नीचे दिए गए अगले खंड 1.4 पर आगे बढ़ें।
  3. कोशिकाओं का लिटिक माप
    1. हाईबीआईटी लिटिक माप से तुरंत पहले, लिटिक बफर के हर 1 एमएल में 20 μL लिटिक सब्सट्रेट और 10 μL LgBiT प्रोटीन जोड़कर 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक तैयार करें। जांच किए जाने वाले कुओं की संख्या के लिए पर्याप्त 2x डिटेक्शन अभिकर्मक तैयार करें, जिसमें पाइपिंग त्रुटि (यानी, कुओं की संख्या + 10%) के लिए अतिरिक्त मात्रा शामिल है।
    2. कोशिकाओं में तैयार लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक जोड़ें। 96-वेल प्रारूप के लिए, 100 μL कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं में 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक के 100 μL जोड़ें। 384-वेल प्रारूप के लिए, 40 μL कोशिकाओं वाले प्रत्येक कुएं में 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक का 40 μL जोड़ें। प्लेट को माइक्रोप्लेट वोर्टेक्स मिक्सर पर 10-20 मिनट के लिए 350 आरपीएम पर मिलाएं।
    3. 96- या 384-वेल प्लेट में ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने में सक्षम एक लुमिनेसेंस पर ल्यूमिनेसेंस को मापें।
  4. वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता मल्टीप्लेक्सिंग
    नोट: यह चरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेलटिटर-फ्लोर (सीटीएफ) किट का उपयोग करके किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. वांछित समापन बिंदु माप से 30-40 मिनट पहले, परख बफर के 2 एमएल में सब्सट्रेट के 10 μL जोड़कर 6x सेल व्यवहार्यता पहचान अभिकर्मक समाधान तैयार करें। प्रत्येक कुएं की परख के लिए पर्याप्त 6x अभिकर्मक तैयार करें, जिसमें पाइपिंग त्रुटि के लिए अतिरिक्त मात्रा (यानी, कुओं की संख्या + 10%) शामिल है।
    2. तैयार अभिकर्मक को कुओं में जोड़ें। 96-वेल प्रारूप के लिए प्रत्येक कुएं में 6x अभिकर्मक के 20 μL जोड़ें जिसमें पहले से ही 100 μL वॉल्यूम है। 384-वेल प्रारूप के लिए प्रत्येक कुएं में 6x अभिकर्मक का 8 μL जोड़ें जिसमें 40 μL कोशिकाएँ होती हैं। माइक्रोप्लेट भंवर मिक्सर पर संक्षेप में मिलाएं, फिर प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. माप के वांछित समापन बिंदु पर (यानी, उपचार के बाद 6 या 24 घंटे, चरण 1.2.3), 96- या 384-वेल प्रारूप में प्रतिदीप्ति (380-400 एनएमएक्स / 505 एनएमईएम) पढ़ने में सक्षम उपकरण पर प्रतिदीप्ति को मापें।
    4. लिटिक बफर के प्रति 1 एमएल लिटिक सब्सट्रेट के 20 μL और LgBiT प्रोटीन के 10 μL को जोड़कर 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक तैयार करें। जांच किए जाने वाले कुओं की संख्या के लिए पर्याप्त 2x डिटेक्शन अभिकर्मक तैयार करें, जिसमें पाइपिंग त्रुटि (जैसे, कुओं की संख्या + 10%) के लिए अतिरिक्त मात्रा शामिल है।
    5. तैयार लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक को कुओं में जोड़ें। 96-वेल प्रारूप के लिए पहले से ही 120 μL वॉल्यूम वाले प्रत्येक कुएं में 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक के 120 μL जोड़ें। 384-वेल प्रारूप के लिए पहले से ही 48 μL वॉल्यूम वाले प्रत्येक कुएं में 2x लिटिक डिटेक्शन अभिकर्मक के 48 μL जोड़ें। प्लेट को माइक्रोप्लेट वोर्टेक्स मिक्सर पर 10-20 मिनट के लिए मिलाएं।
    6. 96- या 384- वेल प्लेटों में ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने में सक्षम एक लुमिनेसेंस पर ल्यूमिनेसेंस को मापें।
  5. अवक्रमण और सेल व्यवहार्यता का परिमाणीकरण
    1. मापा समय बिंदु पर डीएमएसओ नियंत्रण से सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) का औसत निकालें। इस मान को लक्ष्य के बेसलाइन प्रोटीन स्तर के रूप में उपयोग करें ताकि इस मूल्य के लिए इस समय परीक्षण किए गए अन्य सभी उपचारों को सामान्य करके आंशिक गिरावट की गणना की जा सके। उदाहरण के लिए, यदि 6 घंटे पर डीएमएसओ नियंत्रण कुओं के लिए औसत आरएलयू 10,000 था, और 6 घंटे पर दिए गए यौगिक उपचार के लिए आरएलयू 5,000 था, तो आंशिक गिरावट की गणना 5,000 ÷ 10,000 = 0.5 (समीकरण 1) के रूप में की जाएगी।
      समीकरण 1: Equation
    2. आंशिक आरएलयू से प्रतिशत गिरावट का निर्धारण करें:
      समीकरण 2: Equation
    3. यौगिकों की गतिविधि को रैंक करने के लिए विशिष्ट समय बिंदुओं पर आंशिक आरएलयू या % गिरावट को प्लॉट करें।
    4. वैकल्पिक रूप से, डीएमएसओ नियंत्रण के लिए सभी उपचारों से मूल्यों की तुलना करके सेल व्यवहार्यता परख माप के लिए सापेक्ष फ्लोरेसेकेन्स यूनिट (आरएफयू) डेटा का विश्लेषण करें। यदि डीएमएसओ नियंत्रण के सापेक्ष किसी भी उपचार के लिए आरएफयू में महत्वपूर्ण गिरावट देखी जाती है, तो सेल व्यवहार्यता में नुकसान के सापेक्ष प्रोटीन स्तर में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए सेल व्यवहार्यता परख डेटा के लिए गिरावट डेटा को अतिरिक्त रूप से सामान्यीकृत किया जा सकता है।

2. HiBiT CRISPR लक्ष्य प्रोटीन और वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता ल्यूमिनेसेंस परख के वास्तविक समय गतिज क्षरण

नोट: गतिज स्क्रीनिंग और गिरावट करने की क्षमता के लिए सेल में एलजीबीआईटी प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, जिसे पहले 18,19,63 वर्णित किया गया है। यह LgBiT वेक्टर के क्षणिक अभिकर्मक, BacMam LgBiT के उपयोग, या LgBiT स्थिर सेल लाइन में HiBiT CRISPR सम्मिलन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।

  1. अनुयायी सेल लाइनों की प्लेटिंग।
    1. आकांक्षा द्वारा सेल फ्लास्क से माध्यम को हटा दें, डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं, 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को अलग करें, और कोशिकाओं को फ्लास्क तल से अलग करने की अनुमति दें। निलंबन सेल लाइनों के लिए, धारा 2.2 पर आगे बढ़ें।
    2. सीरम युक्त सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करके ट्रिप्सिन को बेअसर करें, कोशिकाओं को इकट्ठा करने और पुन: निलंबित करने के लिए मिलाएं, और सेल निलंबन को शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. 5 मिनट के लिए 125 x g पर कोशिकाओं को स्पिन करें। सेल कल्चर माध्यम को त्याग दें और ताजा सेल संस्कृति माध्यम की समान मात्रा में पुन: निलंबित करें।
    4. प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्थिति के अनुसार न्यूनतम तीन प्रतियों वाले परख प्लेटों में प्लेट कोशिकाएं। सेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए 96-वेल प्रारूप गणना के लिए, परख माध्यम में घनत्व को 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें और 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से 100 μL (20,000 कोशिकाएं) वितरित करें। सेल घनत्व का अनुमान लगाने के लिए 384-वेल प्रारूप गणना के लिए, परख माध्यम में घनत्व को 4.44 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक समायोजित करें और प्रति अच्छी तरह से 18 μL (8,000 कोशिकाएं) वितरित करें।
    5. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर रात भर या उन स्थितियों में इनक्यूबेट करें जो उनके विकास के लिए इष्टतम हैं।
  2. निलंबन कोशिकाओं की प्लेटिंग
    1. सीओ 2-स्वतंत्र माध्यम में सेल घनत्व को 2.22 x 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें, जो 10% एफबीएस और 1 एक्स एंडुराज़िन (स्टॉक अभिकर्मक का 1: 100 कमजोर पड़ना) के साथ पूरक है।
    2. प्रति प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्थिति में न्यूनतम 3 कुओं के साथ परख प्लेटों में प्लेट कोशिकाएं। 96-वेल प्रारूप के लिए प्रति अच्छी तरह से 90 μL (20,000 सेल) वितरित करें। 384-वेल प्रारूप के लिए प्रति अच्छी तरह से 36 μL (8,000 सेल) वितरित करें।
      नोट: निलंबन सेल लाइनों के लिए जिनके पास पृष्ठभूमि (एस: बी) ल्यूमिनेसेंस के लिए कम संकेत हैं, उदाहरण के लिए, क्लोन के बजाय सीआरआईएसपीआर पूल के साथ काम करते समय, 96-वेल प्रारूप में 100,000 कोशिकाओं / कुएं तक, या 384-वेल प्रारूप में 40,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से प्लेटेड कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करके ल्यूमिनेसेंस को बढ़ाना संभव है।
  3. LgBiT को व्यक्त करने वाली HiBiT CRISPR कोशिकाओं का उपयोग करके काइनेटिक अवक्रमण परीक्षण
    1. पहले से ही एंडुराज़िन युक्त निलंबन कोशिकाओं के लिए, जिसे 2.2 में चढ़ाना चरण में शामिल किया गया था, सीधे चरण 2.3.3 पर आगे बढ़ें। अनुयायी सेल लाइनों के लिए नैनो-ग्लो एंडुराज़िन समाधान तैयार करें। 96-वेल प्रारूप के लिए, स्टॉक अभिकर्मक 1:100 को 10% एफबीएस के साथ पूरक सीओ2-स्वतंत्र माध्यम में पतला करके एंडुराज़िन का 1x समाधान तैयार करें। 384-वेल प्रारूप के लिए, स्टॉक अभिकर्मक 1:50 को 10% एफबीएस के साथ पूरक सीओ 2-स्वतंत्र माध्यम में पतला करके एंडुराज़िन का2x समाधान तैयार करें।
    2. अनुयायी कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं में एंडुराज़िन समाधान जोड़ें। 96-वेल प्रारूप के लिए एस्पिरेट माध्यम और 1x Endurazine समाधान का 90 μL जोड़ें। 384-वेल प्रारूप के लिए, 18 μL कोशिकाओं में 2x Endurazine समाधान के 18 μL जोड़ें। एस्पिरेट माध्यम न करें क्योंकि अवक्रमण परख 384-वेल प्रारूप में संस्कृति माध्यम और सीओ2 स्वतंत्र माध्यम के 50:50 मिश्रण में की जाती है।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में 2.5 घंटे के लिए एंडुराज़िन युक्त एंडोराज़िन युक्त सस्पेंशन या अनुयायी सेल प्लेटों को इनक्यूबेट करें ताकि ल्यूमिनेसेंस को बराबर करने की अनुमति मिल सके।
    4. सीओ2-स्वतंत्र माध्यम में परीक्षण प्रोटेक अनुमापन की 10x सांद्रता तैयार करें और 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 10 μL या 384-वेल प्लेट के लिए 4 μL जोड़ें। अज्ञात प्रभावकारिता वाले यौगिकों के लिए, उच्चतम बिंदु पर 1-10 μM की अंतिम एकाग्रता को प्रारंभिक बिंदु के रूप में अनुशंसित किया जाता है।
    5. 0-48 घंटे के बीच की अवधि के लिए ल्यूमिनोमीटर में ल्यूमिनेसेंस के गतिज माप को 37 डिग्री सेल्सियस तक एकत्र करें। माप की समय वृद्धि को प्रत्येक प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन एक अनुशंसित प्रारंभिक प्रयोग 24 घंटे या वांछित समय के लिए हर 5-15 मिनट में ल्यूमिनेसेंस माप होगा।
  4. अंतिम गतिज माप के बाद वैकल्पिक सेल व्यवहार्यता समान-अच्छी तरह से मल्टीप्लेक्स विश्लेषण
    नोट: यह परख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेलटिटर-ग्लो (सीटीजी) किट के साथ किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. कमरे के तापमान के लिए सीटीजी अभिकर्मक को बराबर करें।
    2. गतिज विश्लेषण के अंतिम समय बिंदु पर अवक्रमण माप के बाद, प्लेट के प्रति कुएं अभिकर्मक के 100 μL (96-वेल प्लेट) या 40 μL (384-वेल प्लेट) जोड़ें, और 5 मिनट के लिए 500-700 आरपीएम (96-वेल प्लेट) या माइक्रोप्लेट भंवर मिक्सर (384-वेल प्लेट) पर प्लेट शेकर पर मिलाएं।
    3. सेल लाइसिस और हाईबिट सिग्नल के शमन की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    4. निर्माता की सिफारिश का पालन करके एक लुमिनोमीटर पर कुल ल्यूमिनेसेंस को मापें।
  5. गतिज अवक्रमण प्रोफाइल का परिमाणीकरण
    1. एकत्र किए गए गतिज ल्यूमिनेसेंस मापों का उपयोग करके, प्रत्येक प्रोटेक एकाग्रता के लिए कच्चे आरएलयू को समय के साथ मुक्त फुरिमाज़िन एकाग्रता में परिवर्तन के लिए हर समय औसत डीएमएसओ स्थिति को दोहराने के लिए सामान्य करें। समीकरण 1 का उपयोग करके आंशिक आरएलयू की गणना करें।
      समीकरण 1: Equation
    2. अवक्रमण वक्रों से, समीकरण 2 का उपयोग करके एक एकल-घटक घातीय क्षय मॉडल को प्रत्येक वक्र के प्रारंभिक अवक्रमण भाग से उस बिंदु तक फिट करें जहां डेटा एक पठार तक पहुंचता है।
      नोट: पहले कुछ डेटा बिंदुओं को फिट से बाहर करना उपयोगी हो सकता है क्योंकि गिरावट देखे जाने से पहले एक संक्षिप्त अंतराल हो सकता है।
      समीकरण 2: Equation
    3. समीकरण 2 से, पैरामीटर निर्धारित करें, जो अवक्रमण दर स्थिर और पठार का प्रतिनिधित्व करता है, जो शेष प्रोटीन की सबसे कम मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है।
    4. डीमैक्स की गणना करें, जो अवक्रमित प्रोटीन की अधिकतम आंशिक मात्रा है और इसकी गणना 1-पठार के रूप में की जाती है।
    5. समय-स्वतंत्र अवक्रमण शक्ति वक्र निर्धारित करने के लिए प्रोटेक की प्रत्येक एकाग्रता के लिए डीमैक्स प्लॉट करें।
    6. यौगिकों की प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए 2.3.5 में प्लॉट के लिए डीमैक्स50 मान निर्धारित करें।
      नोट: एक विशिष्ट समय बिंदु पर डीसी50 निर्धारित करने के लिए, चुने हुए समय पर प्रत्येक एकाग्रता के लिए गणना किए गए प्रतिशत गिरावट को प्लॉट करें। इसे डीसी50 टी = 4 एच या डीसी50 टी = 12 एच के रूप में निर्दिष्ट किया जा सकता है।

Representative Results

एकल एकाग्रता समापन बिंदु लिटिक गिरावट विश्लेषण प्रदर्शित करने के लिए, कई सीडीके लक्षित प्रोटीन; सीडीके 2, सीडीके 4, सीडीके 7, और सीडीके 10 को एचईके 293 कोशिकाओं में उनके सी-टर्मिनस पर हाइबिट के साथ अंतर्जात रूप से टैग किया गया था और पैन-किनेज सेरेब्लॉन-आधारित प्रोटेक, टीएल 12-18654 (चित्रा 1 ए) की 1 एसएम एकाग्रता के साथ इलाज किया गया था। सीडीके प्रोटीन का स्तर अलग-अलग समय बिंदुओं पर मापा गया था और डीएमएसओ नियंत्रण के सापेक्ष आंशिक आरएलयू निर्धारित किया गया था (चित्रा 1 ए)। प्रत्येक सीडीके प्रोटीन ने यौगिक उपचार और विभिन्न समय बिंदुओं (चित्रा 1 ए) के जवाब में गिरावट की अलग-अलग सीमाएं दिखाईं। यह समझने के लिए कि सीडीके प्रोटीन प्रोटीन हानि के संदर्भ में सीधे एक दूसरे की तुलना कैसे करते हैं, चित्रा 1 ए में आंशिक आरएलयू की गणना कुल % गिरावट के रूप में की गई थी और चित्रा 1 बी में प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्लॉट किया गया था। इससे पता चलता है कि शुरुआती समय बिंदुओं पर भी, 2 या 4 घंटे, सीडीके परिवार के कुछ सदस्य गिरावट के उच्च स्तर दिखाते हैं जो समय के साथ ऊपर की ओर बढ़ते रहते हैं (चित्रा 1 बी)।

गतिज गिरावट विश्लेषण का प्रदर्शन करने के लिए, बीईटी परिवार के सदस्य प्रोटीन में से प्रत्येक; बीआरडी 2, बीआरडी 3, और बीआरडी 4 को एचईके 293 कोशिकाओं में उनके एन-टर्मिनस पर एचआईबीआईटी के साथ अंतर्जात रूप से टैग किया गया था, जो एलजीबीआईटी प्रोटीन18 को स्थिर रूप से व्यक्त करते थे। फिर इन्हें पैन-बीईटी प्रोटैक की तीन अलग-अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया; सेरेब्लॉन-आधारित dBET650 (चित्रा 2A) और VHL-आधारित ARV-77141 (चित्रा 2B)। काइनेटिक माप 24 घंटे की अवधि में एकत्र किए गए थे, और प्रत्येक एकाग्रता पर प्रोफाइल से, बीईटी परिवार के सदस्य प्रतिक्रिया में अंतर आसानी से स्पष्ट हैं। बीआरडी 2 की गिरावट के बाद अधिक तेजी से वसूली प्रतिक्रिया शुरू करने की क्षमता (चित्रा 2ए, बी) पहले अन्य पैन-बीईटी प्रोटैक के साथ देखी गई है और गिरावट प्रक्रिया18 के लिए प्रतिस्पर्धी ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया प्रतिक्रिया के कारण होने की संभावना है।

समापन बिंदु और गतिज विश्लेषण दोनों को पूर्ण यौगिक खुराक प्रतिक्रिया उपचार के साथ किया जा सकता है। चित्र 3 में दिखाया गया है कि इकारोस / आईकेजेडएफ 1-एचआईबीआईटी सीआरआईएसपीआर जुरकट कोशिकाओं के उपचार के गतिज खुराक प्रतिक्रिया गिरावट प्रोफाइल स्थिर रूप से चार अलग-अलग आणविक गोंद यौगिकों 2,26,55,57 के साथ एलजीबीआईटी प्रोटीन को व्यक्त करते हैं; लेनलिडोमाइड (चित्रा 3 ए), इबर्डोमाइड (सीसी -220) (चित्रा 3 बी), थैलिडोमाइड (चित्रा 3 सी), और पोमलिडोमाइड (चित्रा 3 डी)। ये डिग्रेडर्स यौगिकों के साथ-साथ एकाग्रता श्रृंखला में गिरावट प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं (चित्रा 3)।

मात्रात्मक रूप से गिरावट का आकलन करने और चित्रा 3 में यौगिकों को रैंक करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया प्रोफाइल का उपयोग गिरावट दर (चित्रा 4 ए), डीमैक्स (चित्रा 4 बी), और डीमैक्स50 मानों (चित्रा 4 बी) सहित प्रमुख गिरावट मापदंडों की गणना करने के लिए किया गया था। इन विश्लेषणों से पता चलता है कि इबर्डोमाइड (सीसी -220) और पोमलिडोमाइड में बहुत समान तेजी से प्रारंभिक गिरावट दर (चित्रा 4 ए) है, फिर भी इबर्डोमाइड (सीसी -220) में उच्चतम शक्ति है जैसा कि पहले ऑर्थोगोनल अध्ययन55,57 (चित्रा 4 बी) में देखा गया है। चूंकि इबरडोमाइड इस तरह की उच्च शक्ति प्रदर्शित करता है, और परीक्षण की गई सभी सांद्रता 50% से अधिक गिरावट दिखाती है, इसलिए इबर्डोमाइड के लिए प्राप्त डीमैक्स50 मान डेटा को सटीक रूप से फिट करने में सीमा के आधार पर एक अनुमान का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 3 सी, डी और चित्रा 4 बी में रेखांकन से, न तो लेनालिडोमाइड और न ही थैलिडोमाइड परीक्षण किए गए उच्चतम सांद्रता पर पूरा करने के लिए इकारोस / आईकेजेडएफ 1 लक्ष्य को कम करते हैं। थैलिडोमाइड के साथ देखे गए बहुत कम क्षरण के कारण, गिरावट के निशान को घातीय क्षय मॉडल के लिए सटीक रूप से फिट नहीं किया जा सकता था, इसलिए, इस उपचार के लिए गिरावट दर निर्धारित नहीं की गई थी। सबसे शक्तिशाली अवक्रमक के लिए, इबरडोमाइड (सीसी -220) 55,57 (चित्रा 4 बी)। सेल व्यवहार्यता मल्टीप्लेक्स परख ने परीक्षण की गई सांद्रता के लिए सेल व्यवहार्यता में कोई नुकसान नहीं दिखाया (चित्रा 4 सी)।

Figure 1
चित्रा 1: पैन-काइनेज प्रोटेक, टीएल 12-18654 के साथ सीडीके एंडपॉइंट गिरावट और विषाक्तता। (ए) सीआरआईएसपीआर/सीएएस9 के माध्यम से सी-टर्मिनस पर हाईबीआईटी के साथ जुड़े अंतर्जात सीडीके लक्ष्य प्रोटीन के पैनल का चयन करें और 2 घंटे, 4 घंटे, 8 घंटे और 24 घंटे उपचार पर 1 μM TL12-186 PROTAC54 के साथ गिरावट के लिए मूल्यांकन किया। मानों को प्रत्येक समय बिंदु पर मापा गया डीएमएसओ नियंत्रण के सापेक्ष आंशिक आरएलयू के रूप में दर्शाया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ 3 तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य के एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। (बी) सीडीके लक्ष्य प्रोटीन के पैनल का प्रतिशत क्षरण (ए) से गणना की जाती है जो 2, 4, 8 और 24 घंटे के समय बिंदुओं पर देखे गए प्रत्येक परिवार के सदस्य के क्षरण की मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है। त्रुटि पट्टियाँ 3 तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य के एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बीईटी डिग्रेडर्स, डीबीईटी 650 और एआरवी -77141 के साथ बीईटी परिवार के सदस्यों की गतिज गिरावट चयनात्मकता की रूपरेखा। अंतर्जात बीईटी परिवार के सदस्यों, बीआरडी 2, बीआरडी 3, और बीआरडी 4 की काइनेटिक गिरावट प्रोफाइल, जिसे सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 के माध्यम से एन-टर्मिनस पर 1 एनएम (बाएं), 10 एनएम (मध्य), या 100 एनएम (दाएं) बीडीईटी 650 (ए) या एआरवी -77141 (बी) प्रोटैक की एकल सांद्रता के उपचार के साथ टैग किया गया है। मानों को प्रत्येक गतिज समय बिंदु पर डीएमएसओ नियंत्रण से गणना की गई आंशिक आरएलयू के रूप में दर्शाया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ 4 तकनीकी प्रतिकृतियों के माध्य के एसडी का प्रतिनिधित्व करती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: आणविक गोंद पैनल 2,26,55,57 के साथ इकारोस / आईकेजेडएफ 1-हाईबिट की लाइव सेल गतिज गिरावट खुराक प्रतिक्रिया प्रोफाइल। एलजीबीआईटी प्रोटीन को स्थिर रूप से व्यक्त करने वाली जुरकट कोशिकाओं को CRISPR / Cas9 का उपयोग करके Ikaros / IKZF1 के C-टर्मिनस को HiBiT पेप्टाइड के साथ टैग करने के लिए इंजीनियर किया गया था। कोशिकाओं को 8 बिंदु खुराक प्रतिक्रिया एकाग्रता श्रृंखला के साथ इलाज किया गया था जिसमें चार अलग-अलग आणविक गोंदयौगिकों 2,26,55,57 के डीएमएसओ शामिल थे: (ए) लेनिलिडोमाइड, (बी) इबरडोमाइड (सीसी -220), (सी) थैलिडोमाइड, या (डी) पोमलिडोमाइड। ल्यूमिनेसेंस को कुल 19.5 घंटे के लिए हर 5 मिनट में मापा गया था। (ए-डी) से सापेक्ष प्रकाश इकाई (आरएलयू) डेटा को चरण 2.4.1 में वर्णित के रूप में आंशिक आरएलयू में परिवर्तित किया गया था और समय के कार्य के रूप में ग्राफकिया गया था। त्रुटि पट्टियाँ 3 तकनीकी प्रतिकृतियों के SD का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: इकारोस / आईकेजेडएफ 1-एचआईबीआईटी के लिए गिरावट दर और डीमैक्स 50 की गणना, और मल्टीप्लेक्सिंग सेल स्वास्थ्य परख। चित्रा 3 से काइनेटिक गिरावट डेटा का उपयोग मात्रात्मक गिरावट मापदंडों की गणना करने के लिए किया गया था। (ए) गिरावट दर और (बी) गिरावट अधिकतम मान (डीमैक्स) को संकेतित आणविक गोंद यौगिकों 2,26,55,57 के लिए प्रत्येक दवा एकाग्रता पर ग्राफ किया जाता है। (बी) प्रत्येक यौगिक के लिए डीमैक्स50 मानों की गणना 1 के सीमित हिल ढलान के साथ खुराक-प्रतिक्रिया मॉडल का उपयोग करके की गई थी, जिसका उपयोग लक्ष्य के लिए ऑर्डर डिग्रेडेशन यौगिकों को रैंक करने के लिए किया जा सकता है। (ग) चित्र 3बी से इबरडोमाइड (सीसी-220)55,57 अवक्रमण खुराक प्रतिक्रिया के साथ सेल व्यवहार्यता परीक्षण गतिज अवक्रमण माप के पूरा होने पर समापन बिंदु माप के रूप में किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ 3 तकनीकी प्रतिकृतियों के SD का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम यहां एंडपॉइंट लिटिक प्रारूप या लाइव-सेल काइनेटिक मोड में गिरावट यौगिक गतिविधि की स्क्रीनिंग के दो तरीकों को प्रस्तुत करते हैं। ये दृष्टिकोण एक ही लुमिनेसेंट माप सिद्धांतों पर आधारित हैं, फिर भी विस्तार और समझ के विभिन्न स्तर प्रदान करते हैं। किसी भी दृष्टिकोण का विकल्प स्क्रीनिंग लक्ष्यों और यौगिक पुस्तकालय के आकार पर निर्भर करेगा। किसी भी पता लगाने योग्य गिरावट का निरीक्षण करने के लिए बड़े यौगिक स्क्रीनिंग डेक या प्राथमिक स्क्रीन के लिए, एंडपॉइंट लिटिक स्क्रीनिंग संवेदनशील और कुशल उच्च-थ्रूपुट संगतता प्रदान करती है जहां अन्य समापन बिंदु दृष्टिकोण, जैसे कि पश्चिमी धब्बा या मास स्पेक्ट्रोमेट्रीया तो अव्यावहारिक या अनुकूलन करना मुश्किल हो सकता है। इन स्क्रीन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु सीमित सांद्रता और समय बिंदुओं के साथ किया जा सकता है। परीक्षण के लिए अनुशंसित प्रारंभिक सांद्रता 100 एनएम -10 μM की सीमा में हैं, जो कम शक्ति, खराब पारगम्यता, या कुछ मामलों में अत्यधिक शक्तिशाली यौगिकों के साथ, हुक प्रभाव की उपस्थिति वाले प्रारंभिक अवक्रमकों के लिए जिम्मेदार हैं। यह भी सिफारिश की जाती है कि 4-6 घंटे पर प्रारंभिक शुरुआती गिरावट और 18-24 घंटे पर अव्यक्त या निरंतर गिरावट स्थापित करने के लिए कम से कम दो अलग-अलग समय बिंदुओं का परीक्षण किया जाना चाहिए। उच्च अवक्रमण शक्ति और ऑन-टारगेट तंत्र प्रदर्शित करने वाले यौगिक 4-6 घंटे की समय सीमा के भीतर आसानी से देखे जाते हैं, जबकि केवल बाद के समय बिंदुओं पर देखी गई गिरावट या स्पष्ट प्रोटीन हानि विभिन्न तंत्रों के कारण हो सकती है। प्रारंभिक और देर से दोनों समय बिंदुओं पर सेल व्यवहार्यता की निगरानी करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जैसे कि प्रोटीन हानि को कोशिका मृत्यु के कारण नुकसान से अलग किया जा सकता है। किसी भी प्रकार के लुमिनेसेंट या फ्लोरोसेंट परख के समान, पुस्तकालयों के भीतर यौगिकों के लिए सिग्नल में हस्तक्षेप करने या बाधित करने की क्षमता है, इसलिए, प्रोटीन स्तर की निगरानी के लिए असंबंधित संलयन या वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग करके लीड यौगिकों के साथ ऑर्थोगोनल अनुवर्ती प्रयोग यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण होंगे कि इन परखों में आरएलयू का नुकसान सीधे लक्ष्य प्रोटीन क्षरण से जुड़ा हुआ है।

विस्तारित अवधि में लाइव सेल गतिज प्रारूप में स्क्रीन करने की क्षमता पृष्ठभूमि (एस: बी) के परख संकेत पर बहुत अधिक निर्भर करती है। एस: बी में योगदान करने वाले कारकों में लक्ष्य प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर शामिल है, जो परिमाण के कई आदेशों को फैला सकता है, पेप्टाइड सम्मिलन के लिए चुनी गई सेल लाइन में एलजीबीआईटी अभिव्यक्ति की दक्षता, और इसके विभिन्न देशी परिसरों में पूरक के लिए टैग किए गए लक्ष्य की उपलब्धता। हमने एंडुराज़िन या विवाज़िन के साथ गतिज मोड में गिरावट को सफलतापूर्वक मापने के लिए 15 के एस: बी से युक्त एक सामान्य कटऑफ आवश्यकता स्थापित की है। एस: बी को एंडुराजिन या विवाज़िन लाइव सेल सब्सट्रेट्स की उपस्थिति में अकेले एलजीबीआईटी व्यक्त करने वाली असंपादित पैतृक कोशिकाओं के सापेक्ष एलजीबीआईटी को सह-व्यक्त करने वाली एचआईबीआईटी-संपादित कोशिकाओं के बेसलाइन सिग्नल को मापकर निर्धारित किया जाता है। विवाज़िन एक उच्च लुमिनेसेंट सिग्नल का उत्पादन करेगा लेकिन एंडुराज़िन की तुलना में तेजी से क्षय होगा और सिग्नल अधिग्रहण को 24 घंटे या उससे कम तक सीमित कर सकता है। इसके अलावा, एस: बी इस बात पर भी अत्यधिक निर्भर हो सकता है कि सीआरआईएसपीआर पूल या क्लोन का उपयोग किया जाता है या नहीं। सेल लाइनों में लक्ष्यों के लिए जो अधिक उत्तरदायी हैं और सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 इंजीनियरिंग के लिए उच्च दक्षता रखते हैं, संपादित कोशिकाओं की एक विषम सीआरआईएसपीआर पूल आबादी में गतिज विश्लेषण के लिए पर्याप्त एस: बी हो सकता है। अधिक कठिन सेल लाइनों में लक्ष्यों के लिए जहां सीआरआईएसपीआर के माध्यम से कम कुशल जीनोमिक एकीकरण के परिणामस्वरूप कम एस: बी वाले पूल होते हैं, संपादित आबादी को समृद्ध करने और गतिज विश्लेषण के लिए पर्याप्त रूप से उच्च एस: बी प्राप्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर क्लोन को अलग करना आवश्यक हो सकता है। इनमें से किसी भी परिदृश्य के लिए, यदि एस: बी एंडुराज़िन या विवाज़िन सब्सट्रेट्स के साथ 15 से कम है, तो एंडपॉइंट लिटिक स्क्रीनिंग की सलाह दी जाती है।

यौगिकों की बेहतर समझ और लक्षण वर्णन के लिए, मात्रात्मक मापदंडों के साथ गिरावट प्रोफ़ाइल का निर्धारण सहित, जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय गतिज विश्लेषण अनुशंसित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण14,18 है। ऊपर चर्चा किए गए समापन बिंदु विश्लेषण की तरह, प्रारंभिक गतिज स्क्रीनिंग उच्च-थ्रूपुट फैशन में 100 एनएम-10 किमी की सीमा में सीमित सांद्रता के साथ की जा सकती है। 384-वेल प्रारूप में, 100 से अधिक यौगिकों को आसानी से एक प्लेट पर एक एकाग्रता पर तीन प्रतियों में जांचा जा सकता है। परिणामी अवक्रमण प्रोफाइल न केवल देखे गए क्षरण की सीमा पर मार्गदर्शन प्रदान करेंगे, बल्कि गिरावट की दर, गिरावट की अवधि और प्रोटीन14,18 की संभावित वसूली (चित्रा 2 और चित्रा 3)। अवक्रमण प्रोफ़ाइल के आकार भी मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं। विशिष्ट और शक्तिशाली डिग्रेडर्स अक्सर18,53 घंटों में एक पठार में लक्ष्य प्रोटीन का प्रारंभिक तेजी से नुकसान दिखाते हैं, जबकि ट्रांसक्रिप्शनल फीडबैक या यौगिक विषाक्तता जैसे अन्य तंत्र आमतौर पर समय के साथ प्रोटीन के अधिक रैखिक नुकसान का परिणाम देते हैं। इन विवरणों और बारीकियों को समापन बिंदु लिटिक विश्लेषण के साथ याद किया जाता है, और 24-48 घंटों में वास्तविक समय के विश्लेषण के साथ, किसी को नए या अज्ञात यौगिकों के सेट के भीतर सच्चे डीमैक्स को पकड़ने के लिए समय की भविष्यवाणी करने की आवश्यकता नहीं होती है।

वास्तविक समय कैनेटीक्स यौगिक प्रभावकारिता को बेहतर ढंग से समझने के लिए कुशल खुराक प्रतिक्रिया स्क्रीनिंग की भी अनुमति देता है, यौगिक एकाग्रता प्रारंभिक गिरावट दर को कैसे प्रभावित करती है, और एक से अधिक पैरामीटर के आधार पर यौगिकों को रैंक करने की संभावनाएं प्रदान करती है। अवक्रमण क्षमता के शास्त्रीय माप में स्पष्ट अवक्रमण मैक्सिमा के आधार पर एक विशिष्ट बिंदु पर डीसी50 गणना शामिल होती है। इसके विपरीत, शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए हमारा गतिज दृष्टिकोण प्रत्येक एकाग्रता पर वास्तविक गिरावट को अधिकतम शामिल करता है, भले ही यह समय18 में हो। हम गतिज अवक्रमण शक्ति के इस माप को डीमैक्स5018 कहते हैं। इस फैशन में विश्लेषण उन यौगिकों के लिए जिम्मेदार है जो कम सांद्रता पर अधिक धीरे-धीरे गिरावट शुरू कर सकते हैं और इसलिए अपने डीमैक्स तक पहुंचने के लिए उपचार के बाद लंबा समय लेते हैं। यह गिरावट दर और डीमैक्स दोनों पर यौगिकों को रैंक करने के लिए विशेष रूप से जानकारीपूर्ण हो सकता है। सबसे शक्तिशाली डिग्रेडर्स के लिए यह उन लोगों से धीमी, लेकिन शक्तिशाली डिग्रेडर्स को अलग करेगा जो तेज और शक्तिशाली दोनों हैं। साथ में, हाईबिट सीआरआईएसपीआर सेल लाइनों का उपयोग करके लिटिक और लाइव सेल काइनेटिक स्क्रीनिंग दोनों शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं जो लक्षित प्रोटीन क्षरण, यौगिक कार्य की अधिक व्यापक तस्वीर उत्पन्न करते हैं, और प्रमुख गिरावट मापदंडों को बढ़ाने के माध्यम से प्रारंभिक गतिविधि मूल्यांकन से डाउनस्ट्रीम रासायनिक अनुकूलन तक स्क्रीनिंग प्रक्रिया को सक्षम करते हैं।

Disclosures

Promega Corporation HiBiT और NanoLuc प्रौद्योगिकियों और अनुप्रयोगों के पेटेंट के असाइनमेंट द्वारा वाणिज्यिक मालिक है।

Acknowledgments

के.एम.आर., एस.डी.एम., एम.यू. और डी.एल.डी. सभी प्रोमेगा कॉर्पोरेशन के कर्मचारी हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CellTiter-Glo 2.0 reagent Promega G9241 Cell Viability luminescent assay
CellTiter-Fluor Cell Viability Assay Promega G6080 Cell Viability fluorescent assay
CO2-independent medium ThermoFisher 18045-088 Cell culture
DMSO Sigma Aldrich D2650 For compound dilution and control
DPBS Gibco 14190 Cell culture
Fetal Bovine Serum Seradigm 89510-194 Cell culture
HEK293 LgBiT stable cell line Promega N2672 For complementation with HiBiT to generate luminescence
HiBiT CRISPR mammalian cell line Promega https://www.promega.com/crispr-tpd
Hygromycin B solution Gibco 10-687-010 Cell culture
LgBiT BacMam Promega CS1956C01 For complementation with HiBiT to generate luminescence
LgBiT Expression Vector Promega N2681 For complementation with HiBiT to generate luminescence
Luminometer Plate Reader Luminomenter capable of measuring luminescence and fluorescence (e.g. GloMax Discover System, Promega GM3000)
NanoGlo Endurazine live cell substrate Promega N2570 Kinetic HiBiT reagent
NanoGlo Vivazine live cell substrate Promega N2580 Kinetic HiBiT reagent
NanoGlo HiBiT Lytic Detection system Promega N3030 Enpoint lytic HiBiT reagent
Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher) ThermoFisher 11058-021 Cell culture
Tissue culture plates, white, 96 well plate Costar 3917 Cell culture
Tissue culture plates, white, 384 well plate Corning 3570 Cell culture
Trypsin/EDTA Gibco 25300 Cell culture

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 165 PROTACs लक्षित प्रोटीन क्षरण HiBiT CRISPR कैनेटीक्स लाइव सेल
HiBiT CRISPR सेल लाइनों का उपयोग करके लक्षित प्रोटीन अवक्रमण यौगिकों की उच्च-थ्रूपुट सेलुलर प्रोफाइलिंग
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Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines. J. Vis. Exp. (165), e61787, doi:10.3791/61787 (2020).

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