Summary
この技術は、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒およびタンパク質体の観察と分析のための全種サイズの樹脂セクションの迅速かつ簡単な調製を可能にする。
Abstract
種子中の細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態、大きさ、量は、種子の重量と品質を決定します。彼らは種子の異なる領域間で有意に異なっています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態を明確に表示し、それらの形態パラメータを正確に定量的に分析するためには、全種サイズのセクションが必要です。全体の種子サイズのパラフィンセクションは、種子中の貯蔵材料の蓄積を調査することができますが、厚いセクションの低解像度のために細胞や貯蔵材料の形態パラメータを定量的に分析することは非常に困難です。薄い樹脂部は高解像度を有するが、日常的な樹脂切断法は、大きな容積および高デンプン含量の成熟した種子の全種サイズのセクションを調製するのに適していない。本研究では、全種サイズの樹脂部を作製するための簡単なドライ切片方法を紹介する。この技術は、高デンプン含有量を有する大きな種子であっても、LRホワイト樹脂に埋め込まれたクロスおよび縦方向の全種サイズのセクションを調製することができます。全種サイズのセクションは、蛍光増白剤28、ヨウ素、およびクーマシーブリリアントブルーR250で染色することができ、細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態をそれぞれ明確に示す。得られた画像を定量的に分析して、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを示すこともできます。
Introduction
植物の種子は、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料を含み、人々にエネルギーと栄養を提供します。セルと保管材料の形状、サイズ、および量によって、シードの重量と品質が決まります。種子の異なる領域の細胞および貯蔵材料は、特にデンプン分岐酵素IIb1、2、3の阻害を伴ういくつかの高アミロース穀物作物について、著しく異なる形態を有する。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を調べることは非常に重要である。
パラフィン切片は、種サイズのセクション全体を調製する良い方法であり、種子の組織構造と種子4、5、6の異なる領域における貯蔵材料の蓄積を示すことができる。しかし、パラフィンセクションは通常、低解像度で6〜8μmの厚さを有する。したがって、細胞や貯蔵材料の形態を明確に観察し、定量的に分析することは非常に困難です。樹脂のセクションは、通常、1〜2 μmの厚さと高分解能を有し、細胞および貯蔵材料7の形態を観察し、分析するのに非常に適している。しかし、日常的な樹脂切断法は、特に大量の澱粉含有量の高い種子に対して、シードサイズのセクション全体を準備するのが難しい。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を観察し、分析する方法はありません。LRホワイト樹脂はアクリル樹脂であり、低粘度と強い透過性を示し、種子の樹脂部分、特に大量および高デンプン含有量の穀物成熟したカーネルの準備に優れた用途につながります。また、LRホワイト樹脂に埋め込まれた試料は、多くの化学染料で容易に染色でき、光顕微鏡または蛍光顕微鏡7の下で細胞や貯蔵材料の形態を明瞭に示すことができる。前回の論文では、LRホワイト樹脂に埋め込まれた成熟したシリアルカーネルの全種サイズのセクションを調製するためのドライセパリング方法を報告しました。この方法はまた、開発、発芽および調理された穀物カーネル8の全種サイズのセクションを準備することができます。得られた全種サイズのセクションは、特に種子8,9の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態差を明確に観察し定量的に分析するための、微量形態の観察および分析において多くの用途を有する。
この技術は、組織の微細構造と細胞の形状と大きさ、デンプン顆粒、および異なる種子領域のタンパク質体を光学顕微鏡を用いて観察したい研究者に適しています。細胞、デンプン顆粒、タンパク質体を示すために特別に染色された全種サイズのセクションの画像を形態解析ソフトウェアで解析し、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の形態パラメータを定量的に測定することができます。技術的な適用性と全種サイズのセクションアプリケーションを実証するために、我々は、トウモロコシと油糧種子菜種の成熟した種子と、この研究で米の開発、発芽、調理されたカーネルを調査しました。プロトコルには 4 つのプロセスが含まれています。ここでは、大量の澱粉含有量が多いためにシードサイズのセクション全体を準備する際に最も困難な成熟したトウモロコシカーネルを、工程を段階的に示すサンプルとして使用します。
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Protocol
1. 樹脂埋め込み種子の調製(図1)
- トウモロコシ成熟したカーネルを10 mLの2.5%リン酸緩衝グルタルアルデヒド(0.1 M,pH7.2)で4°Cで48時間固定します。研究者は、研究目的と組織タイプに応じて、他の固定混合物、固定濃度、および固定条件を選択することができます。
- カーネルを取り出し、鋭利な両面ブレードを使用して2〜3mmの厚さに縦方向または経線状にスライスし、2.5%リン酸緩衝グルタルアルデヒド(0.1 M、pH 7.2)の10 mLに再び48時間固定します。
- 0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.2)の10 mLを毎回30分間洗浄します。
- エタノール水溶液(10mL)のグレードを30%から50%、70%、90%1回、30分間100%3回脱水します。
- エタノールで希釈したLRホワイト樹脂溶液の10mLのグレードを25%から50%、75%1回、4°Cで12時間12時間100%ずつサンプルに浸潤します。
- 埋め込む前に、サンプルの台座を準備します。2mL遠心分離機チューブに100%LRホワイト樹脂の0.25mLを加え、60°Cで48時間重合します。
- 純LRホワイト樹脂(0.5mL)と浸潤サンプルをペデスタ管付き遠心管に連続して加えます。解剖学的針でサンプルをまっすぐにし、オーブンで60°Cで48時間重合します。
2. 全種サイズのセクションを準備するためのドライセッティング (図1)
- 遠心管から組み込みカーネルを取り出し、鋭利な刃を使ってサンプルの周りに余分な樹脂を切り取ります。
- ウルトラミクロトーム(EM UC7)のサンプルホルダーに樹脂ブロックをクランプし、サンプル表面やサンプルの周囲の余分な樹脂をブレードで切り落とします。
- 完全な部分が形成されるまでガラスナイフでサンプルの表面を細かく研磨します。
- 切断する前に刃の端の上に約2mmの小さな銅フックを入れ、サンプルを2μmのセクションに切ります。フックの役割は、セクションの上向きのカーリングを避けることです。
- セクションが長くなったら、それをサポートするために、セクションの下にフックを置きます。
- 未処理のスライドに100μLの水を加え、ピンセットで完全な切れ目のない部分を水に慎重に移します。
- しわの部分を滑らかにするために、一晩で50°Cで平らなテーブルの上にサンプルを加熱し、乾燥させる。
- セクションが崩れたり涙を流したりする場合は、サンプルの各樹脂浸潤時間を12時間から24時間または48時間に延長します。
- セクションにナイフに平行な線がある場合は、サンプルブロックをしっかりとクランプします。セクションがナイフに垂直のいくつかの線を持っている場合は、新しいナイフを使用してください。
3. セクションの染色と観察
注:細胞、デンプン顆粒、タンパク質体の組織構造と形態を観察するために、研究の目的に応じて特定の汚れでセクションを染色します。ここでは、蛍光増輝体28、ヨウ素溶液、およびクマシーブリリアントブルーR250をそれぞれ用いて、細胞壁、デンプン顆粒、およびタンパク質体を染色する。
- 細胞の形態を観察するために、40mLの0.1%(w/v)蛍光増輝体28水溶液を40mLコンパクトガラス染色瓶に10分間45°Cで染色し、5分間流水でリンスします。CCDカメラを搭載した蛍光顕微鏡で、断面を観察・撮影します。
- デンプン顆粒の形態を観察するために、40 μLのヨウ素溶液(0.07%(w/v)I2 および0.14%(w/v)KIを25%(v/v)グリセロールで1分間染色し、ヨウ素溶液を含むサンプルをカバースリップで覆います。CCDカメラを搭載した光学顕微鏡でサンプルを見て撮影します。
- タンパク質体の形態を観察するために、 45°Cで10分間、70mLコンパクトガラス染色瓶に10%(v/v)酢酸の40 mLでセクションを浸し、1%(w/v)クマシーブリリアントブルーR250で25%(v/v)イソプロパノールと10%(v/v)酢酸15°Cで15%の酢酸を40mLに染色します。 汚れた部分を流水で5分間洗い、乾かします。CCDカメラを搭載した軽顕微鏡で、断面を観察・撮影します。
4. 形態パラメータの定量的分析
- Zhaoらの手順に従って、異なる種子領域の細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の面積、長/短軸、および丸みについて、撮影した画像を正確に解析し定量的に分析する。
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Representative Results
全種サイズの断面を得るための簡単なドライ断面法
LR-白色樹脂に埋め込まれた種全体サイズの部分を調製するための簡単なドライ切片方法を確立します(図1)。この方法は、2 μmの厚さの横断および縦方向の全種サイズのセクションを調製することができる(図2-5、補足図1-4)。例えば、油糧種子の成熟種子は、縦および縦方向に横断することができる(図2)。穀物作物の場合、成熟したカーネルはデンプン顆粒でいっぱいで、種全体の大きさのセクションを準備することは非常に困難です。本技術を用いて、大きなボリュームを持つ成熟したトウモロコシの横断的および縦方向の全種サイズのセクションも準備することができた(図4、補足図1)。また、開発中のカーネル(補足図2)、発芽したカーネル(補足図3)、及び炊飯のカーネル(補足図4)を、この方法を用いて調べることができる。
シードサイズのセクション全体のアプリケーション
種子の組織構造の観察
全体の種子サイズのセクションは、種子の組織構造を観察するために使用することができます。例えば、油糧種子菜種の胚は、ラジクル、低コチル、プルル、および2つのコチルドンで構成されています。内側と外側のコチルドンは半分に曲げ、胚とラジクルを包み、胚を球状にする(図2A、C)。サフラニンで染色された縦方向および横方向の全胚サイズのセクションは、明らかにラジクル、低コチル、内側コチルド、および外側のコチルドンを示した(図2B、D)。油糧種子菜種の縦方向全胚サイズのセクションは、横断的なセクションよりも困難に調製される。したがって、胚の横断部分は、参照5,10における胚の微小形態を調べるのに広く用いられている。
種子の異なる領域における細胞の形態と解析
全体のシードサイズのセクションは、種子の異なる領域内の細胞の形態を観察し、分析するために使用することができます。例えば、油糧種子菜種の全胚大の横断部分を蛍光増輝体28で染色し、細胞壁を特異的に染色した(図3A)。胚の任意の領域における細胞の微小形態は、高倍率で明確に表示することができた(図3B,C)。ラジクルは表皮、皮質、血管組織から成る。ラジクルの最外層に位置する表皮細胞は、矩形で放射状に配置された。皮質のパレンチマ細胞は、形状が丸く、大きな大きさであった。皮質細胞間にいくつかの異なる空間が観察された。皮質細胞を内側から外側へ層状に配置した(図3B)。コチルドンの表皮細胞は正方形で、体積が小さかった。内側および外側のコチルドンの外面と内面の間で表皮細胞の形状と大きさに有意な差はなかった。いくつかの血管シリンダーは、内側および外側のコチルドンの中腹組織の真ん中に散らばっていた。中端菌のパレンチマ細胞は、コチルドンの表皮細胞および血管シリンダー細胞よりも有意に大きかった。中分フィル・パレンチマ細胞は、内コチルドンの内側領域および内側コチルドンの外側領域における典型的なパリセーディング配置を示した(図3C)。パレンチマ細胞は、胚の異なる領域で有意に異なる形態を有していた。それらの形態の違いを明らかにするために、ラジクル皮質組織の領域1、2、3、4、および5が、内側のコチルドオンの内側領域、内側のコチルドオンの外側領域、外部コチルドオンの内側領域、および外側のコチルドンの外側領域にそれぞれ選ばれた(図3B、C)。上記5領域におけるパレンチマ細胞の形態学的パラメータを、形態解析ソフトウェアを用いて定量的に解析した(補足表1)。面積、長軸長、短軸長、およびパレンチマ細胞の丸みは、胚の異なる領域でいくつかの違いを示した。
胚乳の細胞はデンプンと貯蔵タンパク質でいっぱいでした。全種サイズの樹脂セクションを使用して、異なる領域の子宮内の細胞を観察し、分析することが容易である。例えば、トウモロコシの全領域の細胞の形態は、クロスバーセル全体の種子サイズのセクションが蛍光増輝体28で染色された後にはっきりと見ることができる。同じカーネル中の末梢、中、および中央の個精子は、細胞の形状と大きさが大きく異なった(補足図1)。異なる領域の子宮内の細胞の形態パラメータを定量的に分析するために、領域の画像を形態解析ソフトウェアを用いて分析した。細胞の形態パラメータは 補足表2に示されています。領域1の子宮内精子細胞は4つの領域の中で最も小さい領域を有し、領域2の細胞は領域3の細胞よりも大きかったが、領域4の細胞よりも小さかった。
種子の異なる領域におけるデンプン顆粒の形態と分析
ほとんどの植物資源、特に穀物作物の成熟種子には、高いデンプン含有量が含まれています。顆粒の形態と澱粉の大きさは、デンプンの特性に重要な影響を及ぼし、種子の品質に役割を果たしています。種子の樹脂部分は、種の異なる領域でデンプン顆粒の形態を示すためにヨウ素溶液で染色することができます。例えば、トウモロコシの横断的および縦方向の全種サイズのセクションが正常に準備された。ヨウ素で染色されたセクションは、デンプンの形態を示した(図4)。異なる領域の胚芽の異なる領域におけるデンプン顆粒の形態を示すために、4つの領域と9つの領域がそれぞれ、横方向および縦方向の全種サイズのセクションで選ばれた(図4)。異なる領域のデンプン顆粒は、子宮内精子細胞において著しく異なる形態、大きさおよび量を示した。横断面の場合、領域1は球状デンプン顆粒を有し、領域2は多角形顆粒を有し、かつ、両方の領域3及び4のデンプン顆粒は球状であった。縦断の場合、領域1、4、5、および8の多角形を有するデンプン顆粒は、領域3、7、および9における球形を有するものよりも大きく、幾分かの化合物デンプン顆粒が2および6の領域で観察された。
また、横断面の4つの領域におけるデンプン顆粒の形態学的パラメータの定量的分析を 補足表3に示した。領域1のデンプン顆粒は最も小さいサイズで、領域2の粒は最も大きかったが、領域3の粒は領域4よりも大きかった。
種子の異なる領域におけるタンパク質体の微形と分析
高貯蔵タンパク質を有する全種サイズのセクションは、種子の異なる領域におけるタンパク質体の形態を非反対および分析するために使用することができる。例えば、油糧種子菜種の胚の横切り部を、クマシーブリリアントブルーR250で染色し、保存タンパク質を青色に染色した(図5)。胚中の貯蔵タンパク質の空間分布は、低倍率で明確に観察することができた(図5A)。貯蔵タンパク質はタンパク質体中に存在する。高倍率では、タンパク質体は黒顆粒と透明な構造の一部を持つ不均一なマトリックスを示した(図5B)。種子中のタンパク質体には、均質なタンパク質マトリックスから成り、含み込みがなく、第2タイプは球状結晶を含み、第3タイプは球状結晶と疑似結晶11を含む。タンパク質体内の球状結晶は、染色されていないフィテートおよび他の無機塩で構成されています。これらの球状結晶は、光が顕微鏡下でそれらを通過することができないために黒です。また、球状結晶は、固定剤や埋め込み剤によって浸透し難く、脆弱である。断面を作るとき、球状結晶が飛び出すことがあり、その結果、タンパク質体11の内部に透明な空洞が生じる。油糧種子菜種胚のタンパク質体には、その微形に従って球状結晶が含まれていた(図5B)。胚中のタンパク質体の空間分布を調べるため、全胚サイズの断面の5つの領域が、ラジクル皮質組織、内側のコチルドオンの内側領域、内側のコチルドオンの外側領域、外縁部の内側領域、および外側コチルドオンの外側領域を表すために選ばれた(図5A、C-G)。胚のすべての領域のタンパク質体は、球状、楕円体、不規則な形状であった(図5C-G)。
上記5領域において表皮に近い第1および第2の層状のパレンチマ細胞におけるタンパク質体の定量分析は、補足表4に提示されている。タンパク質体の面積は、選択された5つの領域の間でわずかに異なっていた。タンパク質体の丸みは、外側コチルドンの外側領域では他の4つの領域よりも有意に低く、外側コチルドンのタンパク質体が球に近いことを示す。細胞内のタンパク質体の数および面積指数は、コチルドン・パレンチマ細胞よりもラジクル・パレンチマ細胞において有意に高かった(補足表4)。
図1:乾燥切除法を用いた全種樹脂半薄部の作製この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:油糧種子の成熟種子における胚の組織構造は、フアシュン5.(A)胚の形態。(B)縦方向全胚サイズのセクションの組織構造。(C)横全胚サイズの断面の形態(D)全胚大の断面の組織構造セクションはサフラニンで染色されました。H, 低コチル;IC、内側のコチルドン;OC、外側のコチルドン。R、ラジクル。スケールバー= 1 mm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:油糧種子の胚における細胞の形態学的形態は、フアシュン5.(A)トランスバーサル全胚サイズのセクションは、蛍光増輝体28で染色した。(B)領域Bの増幅(A)において、ラジクルの細胞形態および組織構造を示す。(C)領域Cの増幅(A)において、内および外のコチルドンの細胞形態および組織構造を示す。スケールバー =(A)の場合は500 μm、(B,C)の場合は100 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:トウモロコシ品種鄭58の成熟核におけるデンプン顆粒の形態横(A)と縦方向(B)全種子サイズのセクションをヨウ素溶液で染色し、それらの領域増幅は、異なる領域の胚芽の形質を示す。スケールバー = 全種サイズのセクションでは 1 mm、地域増幅用は 20 μm です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:油糧種子の胚におけるタンパク質体の形態は、フアシュン5.(A)クーマッシーブリリアントブルーR250で染色された横通り全胚サイズのセクション。(B)タンパク質体の増幅、その微細構造を示す。(C-G)領域C-Gの増幅(A)において、タンパク質体の形態をラジクル(C)、内側コチルドン(D)の内側領域、内側コチルドンの内側領域(E)、外側コチルドオンの内側領域(F)、内コチルドンの外側領域(G)で示す。スケールバー = 500 μm の場合(A)、5μm の場合(B)と 50 μm の場合(C-G)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足 図1:トウモロコシ品種鄭58の成熟核における細胞の形態 また、全種大断面を蛍光増輝剤28で染色し、その領域増幅(1-4)は、異なる領域の胚乳細胞の形態を示す。スケールバー= 1 mm の全シードサイズのセクション、地域増幅用 100 μm。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足 図2:米品種9311の核開発の形態 開花後の異なる日(DAF)における横断全種大のセクションは、サフラニンOおよびヨウ素溶液で対数化された。スケールバー= 0.5 mm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図3:米品種テケーの発芽核の形態 インビビション後8日目の縦方向全種子サイズのセクションは、周期的な酸シフとトルイジンブルーOで対抗され、その地域増幅は種子の異なる領域における子宮内精子の形態変化を示す。スケールバー= 20 μm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足 図4: 米品種テチンの調理されたカーネルの形態 横の全種サイズのセクションをヨウ素溶液で染色し、その外側、中、および内側の領域増幅は、0、10、20、および30分間の調理プロセス中に種子中のデンプン顆粒の形態変化を示す。スケールバー= 20 μm.このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表 1: 油糧種子菜種胚の異なる領域内の細胞の形態学的パラメータは、 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
aデータは標準偏差±意味(n = 3)で、同じ列の値が異なる文字が大きく異なります(p < 0.05)。
bこれらの領域を図 3B,Cに示します。
cLAL:長軸の長さ;SAL:短軸の長さ;丸さ: (周囲2)/(4×π×面積)。
補足表 2: トウモロコシの内精子の異なる領域内の細胞の形態学的パラメータは、 このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
aデータは標準偏差±平均値(n = 3)です。同じ列の値が異なる文字で、大きく異なります(p < 0.05)。
bこれらの領域は、 補助図 1のトウモロコシカーネルの横のセクションに示されています。
cLAL:長軸の長さ;SAL:短軸の長さ;丸さ: (周囲2)/(4×π×面積)。
補足表 3:トウモロコシの内精子の異なる領域でデンプン顆粒のモルフォロジーパラメータは、このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
aデータは標準偏差±平均値(n = 3)です。同じ列の値が異なる文字で、大きく異なります(p < 0.05)。
bこれらの領域は、 図 4Aの maize カーネルの横のセクションに示されています。
cLAL:長軸の長さ;SAL:短軸の長さ;丸さ: (周囲2)/(4×π×面積)。
補足表 4: 油糧種子菜種胚の異なる領域におけるタンパク質体の形態学的パラメータは、 このテーブルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
aデータは標準偏差±意味(n = 3)で、同じ列の値が異なる文字が大きく異なります(p < 0.05)。
bこれらの領域を 図 5に示します。
c丸さ: (周囲2)/(4×π×面積);面積指数は、細胞に対するタンパク質体の面積比である。
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Discussion
種子は、食品、飼料、工業原料のための最も重要な再生可能資源であり、デンプンやタンパク質などの貯蔵材料が豊富です。細胞の形態と量、および貯蔵材料の内容と構成は、種子7、12の重量と品質に影響を与えます。ステテロロジーと画像解析技術は、組織領域内の細胞のサイズと量を測定することができますが、多くの研究室に欠けています。パラフィンと樹脂のセクションは、2次元(2D)画像を与え、細胞の真のサイズと量を分析する方法はありません。しかし、細胞は任意の平面でランダムに切断され、組織領域の少なくとも3つの異なるセクションから多くの細胞(100以上)の平均サイズは、細胞の2D形態パラメータ(長さ、幅、面積)を反映することができ、細胞領域を平均する領域領域の比率は、細胞の量を反映することができます。したがって、種子の異なる領域における細胞および貯蔵材料の形態を、その場で見て分析することは非常に重要である。パラフィンセクションは、特に大型種子7のために、全体の種子サイズのセクションを準備するのに最も適しています。しかし、細胞は種子の開発に伴う貯蔵材料でいっぱいであり、後期開発種子および成熟種子から良好な全種子サイズのセクションを得ることは非常に困難です。また、パラフィン部は、形態をはっきりと示すには厚すぎて、種子7の組織構造の調査にのみ適している。
樹脂部は薄く、細胞、澱粉顆粒、タンパク質体の形態を明らかに7に発揮できる。しかしながら、ルーチン樹脂は、全種サイズのセクションには適さない。ここで紹介する技術は、軽い顕微鏡を用いて、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態を見るための樹脂に埋め込まれた成熟種子の横断および縦方向の全種サイズのセクションを準備するための迅速でシンプルで鋭いアプローチを表しています(図2-5、補足図1)。さらに、この技術はまた、種子の異なる領域における細胞、デンプン、およびタンパク質体の形態変化をその場で調査するために、開発、発芽、および調理された種子のセクションを準備することができます。
この手法が提供するもう 1 つの明確な利点は、シード サイズのセクション全体の適用です。フェノミクスとメタボロミクスの新しい時代には、種子の異なる領域で細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを定量的に測定することが重要です。この新しい技術は、形態解析ソフトウェアと組み合わせて、種子の異なる領域における細胞、デンプン顆粒、およびタンパク質体の形態パラメータを定量的に分析することを可能にする(補足表1-4)。
本乾式切除法では、全種サイズの樹脂部を正常に準備できますが、いくつかの制限と欠点があります。パラフィンセクションの場合、パラフィンはセクションから簡単に除去することができます。樹脂セクションでは、樹脂を除去できないため、樹脂に埋め込まれた植物試料につながります。したがって、パラフィン部と比較して、本種全体サイズの樹脂部は、体系化学や免疫体化学を行うには適さない。また、ルーチン樹脂切削法は、少量のサンプルブロックにより、サンプルを0.5~2μmの滑らかな切片に切り取ることができます。しかし、現在の乾燥断面法は、特に大きな容積および高いデンプン含有量を有する成熟した種子のために、2μm未満の厚さの滑らかなセクションを準備することは困難である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
中国国立自然科学財団(32071927)、揚州大学の人材プロジェクト、江蘇高等教育機関の優先アカデミックプログラム開発によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A501931 | |
| Compact glass staining jar (5-Place) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | E678013 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100472 | |
| Coverslip | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518211 | |
| Double-sided blade | Gillette Shanghai Co., Ltd. | 74-S | |
| Ethanol absolute | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500737 | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX60 | |
| Fluorescent brightener 28 | Sigma-Aldrich | 910090 | |
| Glass strips | Leica | 840031 | |
| Glutaraldehyde 50% solution in water | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600875 | |
| Glycerol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A600232 | |
| Iodine | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A500538 | |
| Isopropanol | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A507048 | |
| Light microscope | Olympus | BX53 | |
| LR White resin | Agar Scientific | AGR1281A | |
| Oven | Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd. | 9023A | |
| Potassium iodide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A100512 | |
| Slide | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F518101 | |
| Tweezers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | F519022 | |
| Sodium phosphate dibasic dodecahydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A607793 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A502805 | |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 |
References
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