Un modello di linfedema della coda murina

Il linfedema è gonfiore delle estremità causato da disfunzione linfatica. L'arto interessato si allarga a causa dell'accumulo di liquidi, adiposi e fibrosi¹. Il linfedema colpisce 250 milioni di persone in tutto il mondo^2,3,4. Si stima che il 20-40% delle pazienti sottoposte a trattamento per tumori maligni solidi, come il cancro al seno, il melanoma, i tumori ginecologici/urologici, o i sarcomi, sviluppino linfedema 2,4,5. La morbilità da linfedema comprende infezioni ricorrenti, dolore e deformità⁶. Non esiste una cura per questa malattia progressiva e per tutta la vita. Le terapie attuali sono variaby efficace⁷ e comprendono compressione, terapia decongestionante completa da parte di fisioterapisti, procedure escissionali e operazioni microchirurgiche, tra cui il trasferimentodei linfonodi vascolarizzati e il bypass linfovenoso^{7,8,9,10,11,12,13,14.} Il trattamento ideale per il linfedema deve ancora essere scoperto.

Lo studio del meccanismo e della terapia del linfedema è stato limitato. C'è un esordio ritardato medio di un anno dopo la lesione linfatica^15,16 e la maggior parte degli individui che subiscono insulto iatrogeno con radiazioni e chirurgia non sviluppano linfedema^4,6,17. Sebbene siano stati descritti modelli animali di grandi dimensioni, tra cui cani, pecore e maiali^18,19,20,il modello di coda di topo è stato il più ampiamente applicato a causa della facilità, del costo e della riproducibilità. I modelli murini per lo studio del linfedema includono un modello di coda, ablazione linfatica mediata dalla diptheria-tossina e dissezione linfonodale ascellare o poplitea^{21,22,23,24,25,26.} La maggior parte dei modelli di coda utilizza un'escissione cutanea focale a tutto spessore con clipping del canale linfatico che viene eseguita vicino alla base della coda²², con conseguente gonfiore della coda e caratteristiche istologiche simili al linfedema umano^24,27,28,29. Tuttavia, il modello standard di coda murina si risolve tipicamente spontaneamente in appena 20 giorni ed è accompagnato da necrosi periodica della coda³⁰. Il modello di coda di topo del linfedema estende un linfedema sostenuto oltre le 15 settimane, dimostra una pervietà arteriosa e venosa confermata e consente la valutazione della disfunzione linfatica funzionale.

Un modello di coda murina di linfedema consente la valutazione di nuove terapie per il trattamento del linfedema. Strategie basate su geni sono state utilizzate nel modello murino mediato da vettori virali^31,32. Utilizziamo anche una nuova tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT) per la consegna del carico genetico alla coda di topo linfedematosa. TNT facilita la consegna diretta e transcutanea del gene utilizzando un chip con nanocanali in un campo elettrico focalizzato rapido^33,34,35,36. Il modello include l'utilizzo di TNT_2.0 per consentire la consegna genica focale di potenziali terapie basate su geni al sito di lesione linfatica della coda di topo³⁵.

Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca animale dell'istituzione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Gli animali sono stati ospitati sotto un ciclo luce-buio di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.

1. Interruzione chirurgica dei linfatici della coda di topo

1. Utilizzare topi C57BL/6 di otto settimane di equa distribuzione di genere.
2. Posizionare un topo in anestesia generale in una camera di induzione con il 3-4% di isoflurano in ossigeno al 100% seguito da sedazione di mantenimento all'1-3% durante la procedura.
3. Somministrare 0,5 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (SR) per via sottocutanea per il controllo del dolore.
   NOTA: Ulteriori farmaci analgesici somministrati dopo l'operazione: Carprofene una volta ogni 24 ore per almeno 48 ore e Bupivacaina una volta dopo l'incisione o prima di chiudere l'incisione, applicato gocciolando sui bordi della pelle (dura fino a 4 – 6 ore).
4. Posizionare il topo dorsalmente e preparare la coda con il 70% di alcool isopropilico.
5. Misurare il diametro della coda prima della procedura con incrementi di 5 mm a partire da 20 mm dalla base della coda utilizzando una pinza. Queste misurazioni saranno utilizzate per calcolare il volume utilizzando l'equazione del cono troncato³⁷.
6. Segnare un'escissione circonferenziale di 3 mm sulla coda a 20 mm dalla base.
7. Eseguire una meticolosa escissione cutanea a tutto spessore di 3 mm con una lama chirurgica sterile (taglia 15), lasciando intatta tutta la vascolarizzazione sottostante sotto ingrandimento microscopico chirurgico. Incidere il segno circonferenziale superiore (20 mm dalla base della coda) prima attraverso il derma seguito da un'incisione circonferenziale a tutto spessore di 3 mm distlal alla prima incisione.
   1. Fare un'incisione verticale perpendicolare a tutto spessore per collegare le due incisioni. Utilizzare un pickup fine dentato per afferrare un bordo d'ingresso e utilizzare microscissori per sezionare attentamente in profondità all'interno del piano avascolare al derma e superficiale all'avventizia venosa.
8. Iniettare 0,1 mL di isosulfan blu (1%) per via sottocutanea prossimale alla punta della coda.
9. Identificare i due canali linfatici adiacenti alle vene laterali della coda al microscopio chirurgico. I linfatici appariranno blu a causa dell'iniezione di isosulfan. Transect i linfatici usando forbici microchirurgiche dritte. Usa le forbici per sezionare attentamente un piano tra la vena laterale e il linfatico. Quindi passare la punta di una lama a forbice tra il vaso linfatico e la vena laterale e chiudere le lame per transect il vaso linfatico.
10. Vestire la ferita della coda con una medicazione trasparente aderente sterile. Controllare quotidianamente le incisioni post-operatorie per assicurarsi che non siano infette o sanguinanti e fornire assistenza alle ferite per 2 settimane.
11. Ospitare gli animali da solo per prevenire ulteriori lesioni alla coda e per impedire agli animali di mordersi a vicenda, il che porterebbe a complicazioni chirurgiche.

2. Valutazione vascolare della coda con imaging laser a contrasto di macchie

1. Anestetizzare il mouse come nel passaggio 1.2.
2. Per utilizzare l'imaging laser speckle contrast per visualizzare la vascolarizzazione della coda, impostare la larghezza su 0,8 cm, l'altezza su 1,8 cm, la densità dei punti su alta, la frequenza dei fotogrammi su 44 immagini al secondo, il tempo a 30 secondi e la foto a colori su 1 ogni 10 secondi.
3. Valutare la perfusione venosa e arteriosa per la pervietà. Qualitativamente, la continuità del flusso dovrebbe essere visualizzata.

3. Valutazione linfatica funzionale con angiografia laser nel vicino infrarosso

1. Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2
2. Ricostituire il verde indocianina (ICG) (25 mg/10 ml) e somministrare 0,1 mL per via sottocutanea nella coda distale del topo vicino alla punta.
3. Attenua le luci della stanza. Posizionare l'angiografia laser nel vicino infrarosso in un'impostazione di buffering seguita dall'acquisizione dal vivo.

4. Consegna focale del carico di acido nucleico alla coda del topo utilizzando TNT

1. Anestetizzare l'animale come nel passaggio 1.2.
2. Esfoliare la coda di topo usando una crema esfoliante topica per la pelle.
3. Immergere la coda di topo in una soluzione di collagenasi (10 mg/mL) a 37 °C per 5 minuti.
4. Caricare il DNA nel serbatoio del chip TNT_2.0 ³⁵.
5. Posizionare il dispositivo con chip in silicone TNT_2.0 sul sito focale di consegna desiderato sulla coda con nanonutrienti a contatto con la coda.
6. Posizionare una sonda elettrica positiva nel serbatoio. Attaccare la sonda negativa a un ago da 30 G e inserire l'ago per via sottocutanea nella coda fino al luogo del parto.
7. Applicare la stimolazione elettrica a impulsi a onda quadra (impulsi 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA).

La tecnica per il modello di coda di topo per il linfedema sostenuto è mostrata nella Figura 1. La figura mostra l'anatomia rilevante del modello di coda di topo. La Figura 2 mostra il gonfiore progressivo e il linfedema persistente prolungato nella coda del topo dopo l'induzione del linfedema. Il volume della coda del topo, come calcolato dall'equazione del tronco di cono, raggiunge il picco alla settimana 4 e si stabilizzano alla settimana 6 seguito da un graduale miglioramento che viene sostenuto fino alla settimana 15. Il volume della coda può essere utilizzato come variabile di esito per valutare l'effetto degli interventi terapeutici per il linfedema nel modello. Nella Figura 3si può osservare una macchie laser ad alta risoluzione per la valutazione della pervietà della vascolarizzazione della coda. Ciò aggiunge rigore al modello per garantire che il welling sia secondario alla disfunzione linfatica piuttosto che alla lesione venosa. L'effetto degli interventi può quindi potenzialmente tradursi in trattamento del linfedema con maggiore sicurezza. La Figura 4 mostra una valutazione linfatica funzionale eseguita tramite linfangiografia laser a infrarossi vicini. Questa variabile di esito aggiuntiva consente un effetto linfatico funzionale degli interventi. La Figura 5 mostra la consegna focale del carico genetico per via transcutanea nel sito chirurgico utilizzando la tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT2.0). TNT2.0 facilita la consegna del punto di cura di potenziali terapie candidate basate su geni in questo modello di linfedema.

Figura 1: Modello di coda murina per linfedema prolungato. (A) Un'escissione cutanea a tutto spessore larga 3 mm viene eseguita su una coda murina a 20 mm dalla base sotto il micrscopio chirurgico. Si fa attenzione a preservare la vascolarizzazione. (B) Schema della sezione trasversale della coda del topo. DV=vena dorsale, LV=vene laterali, A=arteria caudale ventrale, CV=vertebra caudale, T=tendine e muscolo, frecce gialle mostra i linfatici. (C) Dopo la somministrazione di isosulfan blu nella punta della coda per localizzare i linfatici, i linfatici (freccia gialla) mostrano un colore blu. I linfatici vengono interrotti preservando le vene laterali adiacenti (freccia bianca). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Gonfiore progressivo del modello di linfedema della coda di topo. (A) Dopo l'escissione cutanea a tutto spessore e la transezione linfatica, la coda del topo presenta un gonfiore progressivo che si sostiene per 15 settimane. La staffa denota 20 mm dalla base della coda all'inizio dell'escissione cutanea chirurgica a tutto spessore. (B-C) Quantificazione della variazione del volume della coda in 15 settimane rappresentata come (B) grafici a barre, ogni punto che rappresenta un animale, n = 15, o come (C) grafico a linee. Dati rappresentati come ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging laser a contrasto di macchie ad alta risoluzione per confermare la perfusione della coda di topo nel modello di coda di topo linfedema. La speckle laser viene utilizzata per valutare la vascolarizzazione della coda di topo postoperatoriamente per convalidare il gonfiore dell'eziologia linfatica e ridurre al minimo la necrosi della coda. (A) Una coda di topo con vene laterali ferite (freccia nera) rilevata da macchie laser. (B) Vena laterale della coda intatta (freccia nera) post-linfedema intervento chirurgico rilevato da macchie laser. (n=5) risoluzione 0,02 mm; La barra codificata a colori indica la perfusione (blu: bassa, rossa: alta) misurata in unità relative arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Valutazione della funzione linfatica mediante linfangiorafia laser nel vicino infrarosso nel modello di coda di topo. L'indocianina verde (ICG) iniettata nella punta della coda del topo si localizza ai linfatici. Preoperatoriamente, i linfatici sono intatti lungo la coda del topo. Postoperatoriamente, non vi è alcun transito ICG oltre il sito chirurgico, confermando che il gonfiore è causato da disfunzione linfatica. La freccia gialla indica la base della coda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Consegna focale del carico genetico utilizzando la tecnologia di nanotrasfezione tissutale (TNT). (A) Illustrazione della consegna di TNT. (B) I plasmidi vengono caricati nel serbatoio TNT2.0. Le sonde elettriche positive e negative sono collegate e viene erogata una breve stimolazione elettrica a impulsi a onda quadra (impulsi 10 x 10 ms, 250 V, 10 mA), facilitando la trasfezione focale, non virale, transcutanea. (C) Efficienza della consegna del carico genetico utilizzando TNT2.0 come osservato attraverso la somministrazione di DNA etichettato con fluoresceina amidite (FAM) alla coda murina. Le code di topo sono state sezionate due giorni dopo il trattamento con TNT e valutate attraverso la microscopia a fluorescenza. Le linee tratteggiate bianche indicano l'epitelio della pelle della coda murina. Le frecce bianche indicano il DNA etichettato FAM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse concorrenti.