Articolo metodologico

Derivazione di cristalli proteici con I3C utilizzando lo screening casuale della matrice microseed

DOI:

10.3791/61894

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16 gennaio 2021

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, The University of Adelaide, 2Institute of Photonics and Advanced Sensing (IPAS), School of Biological Sciences, The University of Adelaide

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo per generare cristalli proteici derivati con I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) utilizzando il microseeding per generare nuove condizioni di cristallizzazione negli schermi a matrice sparsa. I vassoi possono essere impostati utilizzando robot di erogazione di liquidi o a mano.

Abstract

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La spiegazione della struttura proteica mediante cristallografia a raggi X richiede sia cristalli diffrazione di alta qualità che soluzione computazionale del problema della fase di diffrazione. Le nuove strutture prive di un adeguato modello di omologia sono spesso derivati con atomi pesanti per fornire informazioni sperimentali sulla fase. Il protocollo presentato genera in modo efficiente cristalli proteici derivati combinando lo screening casuale della matrice di microseeding con la derivazione con una molecola atomica pesante I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico). Incorporando I3C nel reticolo cristallino, il problema della fase di diffrazione può essere risolto in modo efficiente usando la fase di dispersione anomala a singola lunghezza d'onda (SAD). La disposizione triangolare equilatero degli atomi di iodio in I3C consente una rapida convalida di una corretta sottostruttura anomala. Questo protocollo sarà utile ai biologi strutturali che risolvono strutture macromolecolari utilizzando tecniche basate sulla cristallografia con interesse per la fase sperimentale.

Introduzione

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Nel campo della biologia strutturale, la cristallografia a raggi X è considerata la tecnica gold standard per determinare le strutture a risoluzione atomica delle macromolecole. È stato ampiamente utilizzato per comprendere le basi molecolari delle malattie, guidare progetti razionali di progettazione di farmaci ed chiarire il meccanismo cataliticodegli enzimi 1,2. Sebbene i dati strutturali forniscano una ricchezza di conoscenze, il processo di espressione e purificazione delle proteine, cristallizzazione e determinazione della struttura può essere estremamente laborioso. Si riscontrano comunemente diverse strozzature che ostacolano lo svolgimento di questi progetti e questo deve essere affrontato per snellire in modo efficiente la pipeline di determinazione della struttura cristallina.

Dopo l'espressione ricombinante e la purificazione, devono essere identificate condizioni preliminari favorevoli alla cristallizzazione, che è spesso un aspetto arduo e dispendioso in termini di tempo della cristallografia a raggi X. Schermi a matrice sparsa commerciale che consolidano le condizioni note e pubblicate sono stati sviluppati per alleviare questo collo dibottiglia 3,4. Tuttavia, è comune generare pochi colpi da questi schermi iniziali nonostante l'uso di campioni proteici altamente puri e concentrati. Osservare gocce chiare indica che la proteina potrebbe non raggiungere i livelli di supersaturazione necessari per nucleare un cristallo. Per incoraggiare la nucleazione cristallina e la crescita, i semi prodotti da cristalli preesiste possono essere aggiunti alle condizioni e ciò consente un maggiore campionamento dello spazio di cristallizzazione. Ireton e Stoddard hanno introdotto per la prima volta il metodo di screening della matrice microseed5. Cristalli di scarsa qualità sono stati schiacciati per fare uno stock di semi e poi aggiunti sistematicamente a condizioni di cristallizzazione contenenti sali diversi per generare nuovi cristalli di qualità di diffrazione che altrimenti non si sarebbero formati. Questa tecnica è stata ulteriormente migliorata da D'Arcy et al. Ciò ha migliorato la qualità dei cristalli e aumentato il numero di colpi di cristallizzazione in media di un fattore 7.

Dopo che i cristalli sono stati prodotti con successo e si ottiene un modello di diffrazione a raggi X, si incontra un altro collo di bottiglia sotto forma di risoluzione del "problema di fase". Durante il processo di acquisizione dei dati, viene registrata l'intensità della diffrazione (proporzionale al quadrato dell'ampiezza) ma le informazioni di fase vengono perse, dando origine al problema di fase che interrompe la determinazione immediata dellastruttura 8. Se la proteina bersaglio condivide un'identità di sequenza elevata con una proteina con una struttura precedentemente determinata, la sostituzione molecolare può essere utilizzata perstimare le informazioni di fase 9,10,11,12. Sebbene questo metodo sia veloce ed economico, le strutture del modello potrebbero non essere disponibili o adatte. Il successo del metodo di sostituzione molecolare basato su modello di omologia diminuisce significativamente man mano che l'identità della sequenza scende al di sotto del 35%13. In assenza di un adeguato modello di omologia, è possibile testare metodi ab initio, come ARCIMBOLDO14, 15 e AMPLE16. Questi metodi usano modelli o frammenti computazicamente previsti come punti di partenza per la sostituzione molecolare. AMPLE, che utilizza modelli di esca previsti come punti di partenza, fatica a risolvere strutture di grandi (>100 residui) proteine e proteine contenenti prevalentemente β-sheets. ARCIMBOLDO, che tenta di inserire piccoli frammenti per estendersi in una struttura più grande, è limitato ai dati ad alta risoluzione (≤2 Å) e dalla capacità degli algoritmi di espandere i frammenti in una struttura completa.

Se i metodi di sostituzione molecolare falliscono, devono essere utilizzati metodi diretti come la sostituzione isomorfa17,18 e lo scattering anomalo a una singola lunghezza d'onda (SAD19)o a lunghezze d'onda multiple (MAD20). Questo è spesso il caso di strutture veramente nuove, dove il cristallo deve essere formato o derivatizzato con un atomo pesante. Questo può essere ottenuto immergendo o co-cristallizzando con un composto atomico pesante, modificazione chimica (come incorporazione di 5-bromodoracile nell'RNA) o espressione proteica marcata (come incorporare aminoacidi selenomethionina o selenocisteina nella struttura primaria)21,22. Ciò complica ulteriormente il processo di cristallizzazione e richiede ulteriore screening e ottimizzazione.

Una nuova classe di composti fasci, tra cui I3C (acido 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) e B3C (acido 5-ammino-2,4,6-tribromoisoftalico), offrono vantaggi entusiasmanti rispetto ai composti gradualipreesistesi 23,24,25. Sia I3C che B3C presentano un'impalcatura ad anello aromatico con una disposizione alternata di scatter anomali necessari per i metodi di fase diretta e gruppi funzionali ammino o carbossilati che interagiscono specificamente con la proteina e forniscono una specificità del sito legante. La successiva disposizione triangolare equilatero dei gruppi di metalli pesanti consente una convalida semplificata della sottostruttura a fasi. Al momento della stesura, ci sono 26 strutture legate all'I3C nella Protein Data Bank (PDB), di cui 20 sono state risolte utilizzando la fase26della SAD.

Questo protocollo migliora l'efficacia della tubazione di determinazione della struttura combinando i metodi di derivazione dei metalli pesanti e lo screening rMMS per aumentare contemporaneamente il numero di colpi di cristallizzazione e semplificare il processo di derivazione del cristallo. Abbiamo dimostrato che questo metodo era estremamente efficace con lisozima di albume d'uovo di gallina e un dominio di una nuova proteina di lisina dal batteriofago P6827. Viene descritta la soluzione di struttura che utilizza la pipeline di determinazione della struttura auto-risciò altamente automatizzata, specificamente su misura per il composto di fasatura I3C. Esistono altre pipeline automatizzate che possono essere utilizzate come AutoSol28, ELVES29 e CRANK230. Pacchetti non completamente automatizzati come SHELXC/D/E possono essere utilizzatianche 31,32,33. Questo metodo è particolarmente utile per i ricercatori che stanno studiando proteine prive di modelli omologhi nel PDB, riducendo significativamente il numero di fasi di screening e ottimizzazione. Un prerequisito per questo metodo sono i cristalli proteici o un precipitato cristallino della proteina bersaglio, ottenuto da precedenti studi di cristallizzazione.

Protocollo

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1. Pianificazione sperimentale e considerazioni

  1. Utilizzare cristalli preesistenti della proteina di interesse, preferibilmente generati attraverso la cristallizzazione della diffusione del vapore. Per un protocollo generalizzato di cristallizzazione della diffusione del vapore, vedere Benvenuti e Mangani34. Altri metodi di cristallizzazione come la microbatch sotto olio e la diffusione dell'interfaccia libera richiederanno la raccolta dei cristalli prima della frantumazione per generare microseedi.
  2. Nella preparazione di uno stock di semi, utilizzare cristalli di altissima qualità che possono essere sacrificati. Il cristallo di altissima qualità può essere giudicato visivamente in base alla morfologia o il miglior cristallo diffrazione può essere selezionato, se tali dati sono disponibili. È molto probabile che cristalli di qualità ancora migliore si ottengono dopo l'ottimizzazione attraverso la semina. Nel caso in cui non siano disponibili cristalli, è possibile utilizzare precipitati cristallini come sferuliti e aghi.
  3. Identificare i cristalli di sale. I cristalli di sale possono crescere negli schermi di cristallizzazione e possono sembrare cristalli proteici. L'uso di cristalli di sale in rMMS non fornirà alcun beneficio e sprecherà campioni preziosi, quindi è importante eliminare i falsi positivi del sale.
    1. I cristalli di sale sono forti quando vengono schiacciati. I cristalli devono essere schiacciati per generare uno stock di semi, quindi questa strategia è particolarmente rilevante. Se si sente un suono di crepa udibile quando si frantumano i cristalli, è probabile che il cristallo sia sale.
    2. Se la proteina contiene triptofano e residui di tirosina, utilizzare la microscopia a fluorescenza ultravioletta per identificare i cristalli proteici che fluoresce in queste condizioni di illuminazione.
    3. Utilizzare il colorante Izit (blu metilene) per macchiare i cristalli proteici per differenziarli in cristalli di sale che rimangono relativamente incontaminati. Tuttavia, questa procedura è più distruttiva ed è consigliata solo se si dispone di cristalli da risparmiare dalle repliche della stessa goccia.
      NOTA: Sebbene i suddetti test possano dare risultati promettenti, i cristalli di sale possono ancora essere scambiati per cristalli proteici. In questo caso, gli esperimenti di diffrazione possono essere usati per discernere definitivamente tra una proteina e un cristallo di sale.

2. Preparazione del materiale al litio I3C

  1. Misurare 120 mg di I3C (acido microcentrifugo da 5-ammino-2,4,6-triiodoisoftalico) in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml.
  2. Sciogliere I3C in 200 μL di idrossido di litio da 2 M. La soluzione può essere riscaldata delicatamente utilizzando un blocco termico a 40-60 °C per favorire la dissoluzione. La soluzione di litio I3C risultante dovrebbe essere marrone e ha una concentrazione di 1 M.
    ATTENZIONE: L'idrossido di litio è corrosivo. Devono essere indossati occhiali di sicurezza, guanti e un camice da laboratorio.
  3. Misurare il pH della soluzione. Se necessario, aggiungere piccole quantità di acido cloridrico da 1 M o idrossido di litio da 2 M per regolare il pH tra 7 e 8. Aggiungere acqua milliQ per rendere il volume finale della soluzione a 400 μL. La concentrazione della soluzione stock I3C è di 0,5 M.
    NOTA: il passaggio 2.3 è facoltativo. Il pH della soluzione deve essere compreso tra pH 7-8 prima di qualsiasi regolazione del pH. Questo passaggio deve essere eseguito se la proteina di interesse è fortemente influenzata dal pH. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Litio I3C può essere tenuto al buio a 4 °C per almeno due settimane35.

3. Aggiunta di I3C allo stock proteico

  1. Metodo 1
    1. Aggiungere il litio di serie I3C a un'aliquota di 150 μL della proteina bersaglio. La concentrazione finale dovrebbe essere compresa tra 5-40 mM di litio I3C.
  2. Metodo 2 (metodo più delicato)
    1. Preparare un tampone di diluizione proteica che corrisponda al tampone della proteina bersaglio. A questo tampone di diluizione, aggiungere il litio A3C per dare una concentrazione di litio I3C tra 10-80 mM.
    2. Diluire la proteina 1:1 con tampone di diluizione proteica per dare una concentrazione finale di litio I3C tra 5-40 mM.
      NOTA: Alcune proteine precipiteranno quando entrano in contatto con alte concentrazioni di litio I3C nel metodo 1, mentre altre proteine possono tollerarlo. Il metodo 2 riduce la probabilità di precipitazioni. Tuttavia, questo metodo dimezza la concentrazione proteica. Per le proteine che non hanno un protocollo di cristallizzazione stabilito, una concentrazione proteica di 10 mg/mL è generalmente raccomandata per lo screening iniziale della cristallizzazione. Si raccomanda un rapporto molare iniziale di I3C con proteine di 8. La concentrazione proteica e il rapporto molare tra I3C e proteine possono essere ottimizzati dopo lo schermo iniziale.

4. Fare una scorta di semi

  1. Crea una sonda arrotondata per frantumare i cristalli.
    1. Con un bruciatore Bunsen sulla fiamma blu, scaldare una pipetta Pasteur verso il suo centro. Utilizzando una pinzetta, tirare l'estremità della pipetta Pasteur per disegnare in un diametro sottile inferiore a 0,3 mm.
    2. Una volta che la sezione centrale è abbastanza sottile, tenere quel segmento nella fiamma per separare la pipetta a questo punto e arrotondare l'estremità della pipetta per finire la sonda di vetro.
      NOTA: I frantoi a cristalli a sonda arrotondati sono venduti da fornitori di terze parti. Queste sono un'alternativa alla realizzazione di sonde arrotondate.
  2. Posizionare cinque tubi di microcentrifugo da 1,5 ml sul ghiaccio.
  3. Al microscopio a luce, esaminare il vassoio di cristallizzazione per una condizione adatta per generare microcristalli. Idealmente, vengono selezionati grandi cristalli morfologici di buona morfologia. Tuttavia, questa tecnica funziona anche con poveri cristalli morfologici, aghi, piastre, microcristalli e sferuliti.
  4. Aprire bene il vassoio di cristallizzazione. Per 96 vassoi di cristallizzazione ben sigillati con plastica, utilizzare un bisturi per tagliare la plastica che sigilla il pozzo. Per appendere vassoi di caduta sigillati con grasso, il coperchio può essere rimosso utilizzando una pinzetta e invertito su una superficie uniforme.
  5. Trasferire 70 μL di soluzione di serbatoio in un tubo di microcentrifugo e raffreddarlo sul ghiaccio. Agli altri tubi a microcentrifugo aggiungere 90 μL di soluzione di serbatoio e tornare al ghiaccio per raffreddare.
    NOTA: Se il serbatoio non ha abbastanza volume o non esiste (nel caso di microbatch sotto l'olio), creare un serbatoio di cristallizzazione mescolando i reagenti appropriati.
  6. Agitare il cristallo nella goccia usando la sonda di cristallo per schiacciarlo a fondo. Il cristallo deve essere completamente frantumato e può essere monitorato al microscopio.
  7. Rimuovere tutto il liquido dalla goccia e trasferirlo nel tubo di microcentrifugo con la soluzione del serbatoio. Mescolare e successivamente prendere 2 μL di miscela dal tubo di microcentrifugo e aggiungerlo di nuovo al pozzo. Risciacquare il pozzo con la soluzione e trasferirlo nel tubo di microcentrifugo. Ripetere ancora una volta questo passaggio di risciacquo. Da questo punto in su, mantenere freddo il tubo di microcentrifugo per evitare di fondere i microseedi nella miscela.
  8. Vortice il tubo alla massima velocità a 4 °C per 3 minuti, fermandosi regolarmente per raffreddare il tubo sul ghiaccio per evitare il surriscaldamento.
    NOTA: Alcuni protocolli di microseeding aggiungono una perla di semi di politetrafluoroetilene al tubo di microcentrifugo per aiutare la frantumazione cristallina7,36. Abbiamo utilizzato la tecnica senza l'uso di una perla di semi con successo, ma non vediamo problemi con l'utilizzo di una perla di semi per schiacciare i cristalli.
  9. Effettuare una diluizione seriale 1 su 10 del materiale di semi trasferendo in sequenza 10 μL tra le soluzioni del serbatoio refrigerato.
  10. Conservare le scorte di semi che non verranno utilizzate immediatamente a -80 °C.

5. Configurazione di uno schermo rMMS

  1. Impostazione di una piastra di vagliatura del pozzo 96 utilizzando un robot di erogazione del liquido. In assenza di un robot, può essere utilizzata anche una pipetta multicanale.
    1. Trasferire 75 μL da un blocco di pozzo profondo a un vassoio di cristallizzazione di 96 pozzi. Aggiungere 1 μL alla goccia di cristallizzazione e 74 μL al serbatoio.
    2. Trasferire 1 μL di proteine integrato con litio I3C, realizzato nel passaggio 2, alla goccia di cristallizzazione.
    3. Trasferire 0,1 μL di materiale di semi alla goccia di cristallizzazione.
    4. Sigillare la piastra con nastro di tenuta chiaro e incubare la piastra a temperatura costante per consentire la crescita del cristallo.
  2. Configurazione di una schermata di rilascio sporgenti
    1. Ungere i bordi dei pozzi di caduta appesi (i vassoi di cristallizzazione a goccia appesi possono essere trovati in formati 24 e 48 pozzi).
    2. Trasferire la soluzione di cristallizzazione da 500 μL nel serbatoio.
    3. Vicino al centro di uno scivolo di copertura in vetro, posizionare una goccia di 1 μL di proteine integrata con litio I3C, realizzato nel passaggio 2.
    4. Aggiungere 1 μL della soluzione di cristallizzazione alla goccia.
    5. Trasferire 0,1 μL di materiale di semi alla goccia di cristallizzazione.
    6. Invertire lo scivolo del coperchio e sigillare bene la cristallizzazione spingendo il coperchio scivolare nel grasso.
    7. Incubare la piastra a temperatura costante per consentire la crescita del cristallo.
      NOTA: Con scorte di semi nuove e non testate, si consiglia di utilizzare lo stock di semi più concentrato per massimizzare le possibilità di ottenere colpi di cristallizzazione. Le condizioni successive possono essere impostate con una ridotta concentrazione di semi per ottimizzare il numero di cristalli.
  3. Ispezionare regolarmente i vassoi di cristallo al microscopio per la crescita dei cristalli. Se i cristalli sono di qualità sufficiente, possono essere raccolti per la raccolta dei dati. I cristalli possono anche essere utilizzati per generare nuove scorte di semi e nuovi schermi rMMS per consentire l'ottimizzazione iterativa.

6. Raccolta dei dati

  1. Raccogliere cristalli usando criopopi, crioproteggere i cristalli e raffreddarli a freddo in azoto liquido. Per ulteriori informazioni sui cristalli di raffreddamento flash, fare riferimento a Teng37 e Garman e Mitchell38.
    1. Durante la fase di crioprotezione, se il cristallo viene passato attraverso una nuova soluzione acquosa, I3C può essere perso dal cristallo a causa del suo leeching nella soluzione crioprotezione. Utilizzare litio I3C nella soluzione di crioprotezione a una concentrazione che corrisponda alla condizione di cristallizzazione per mitigarlo.
    2. I cristalli coltivati utilizzando questo protocollo sono stati crioprotetti con successo utilizzando il crioprotettore a base di olio Parabar 10312 (Hampton Research).
      NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui mentre i cristalli sono conservati in azoto liquido.
      ATTENZIONE: L'azoto liquido può causare ustioni da freddo. L'azoto liquido può anche causare asfissia se usato in spazi chiusi.
  2. Montare il cristallo sul goniometro sorgente a raggi X e raccogliere dati di diffrazione utilizzando il protocollo specifico per la sorgente di raggi X.
  3. Questa tecnica si basa sul segnale anomalo degli atomi di iodio in I3C. Pertanto, selezionare l'energia dei raggi X per massimizzare questo segnale.
    1. Impostare le sorgenti di raggi X di sincrotrone con energie tonni il più basse possibile. Per molte travi di cristallografia macromolecolare, l'energia configurabile più bassa è da 8000 a 8500 eV.
    2. Le sorgenti di raggi X anodici rotanti non possono essere sintonizzate. Le sorgenti anodo comunemente usate con rame hanno il bordo Kα a 8046 eV, che fornisce un buon segnale anomalo per lo iodio (f" = 6,9 e). Le sorgenti anodo con cromo hanno un bordo Kα a 5415 eV, che fornisce un grande segnale anomalo per lo iodio (f" = 12,6 e).
  4. Il danno da radiazioni è un problema significativo durante la raccolta dei dati in quanto degrada il segnale anomalo39. Selezionare il tempo di esposizione e l'attenuazione del fascio per ottenere la migliore diffrazione riducendo al minimo la dose di radiazioni.
    NOTA: In un composto graduale simile con gli atomi di iodio sostituiti con atomi di bromo, è stato dimostrato che i danni da radiazioni causano la radiolisi del legame del bromo di carbonio e una riduzione dell'occupazione degli atomi di bromo24.
    1. Usa la raccolta di dati SAD con travi inverse come strategia di raccolta. I dati vengono raccolti in cunei, con cunei opposti raccolti uno dopo l'altro. Ciò consente di raccogliere le coppie di Friedel con una dose equivalente, con conseguente miglioramento della misurazione del segnale anomalo meno influenzato dai danni da radiazioni. Ad esempio, una strategia a otto cunei per raccogliere 360° comporterebbe la raccolta dei dati nell'ordine del cuneo 1 (0°-45°), cuneo 2 (180°-225°), cuneo 3 (46°-90°), cuneo 4 (225°). -270°), cuneo 5 (90°-135°), cuneo 6 (270°-315°), cuneo 7 (135°-180°) e cuneo 8 (315°-360°).
      NOTA: La rotazione continua è una strategia di raccolta alternativa a quella della raccolta dei dati delle travi inverse. Per un recente confronto delle strategie di raccolta, vedere Garcie-Bonte & Katona40.

7. Soluzione di elaborazione e struttura dei dati

  1. Eseguire la riduzione dei dati sui dati di diffrazione utilizzando XDS41, con l'obiettivo di massimizzare il segnale anomalo. I parametri di input di riduzione dei dati sono specifici del set di dati e potrebbero richiedere tentativi ed errori. Ecco alcuni consigli per iniziare.
    1. Impostare LAW=FALSE DI FRIEDEL. Eseguire CORRECT due volte, impostando STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE e STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE. Una corsa può avere un segnale anomalo più alto dell'altra. Confronta i segnali anomali tra le corse usando le discipline "Anomal Corr" e "SigAno" nell'output. Ciò fornisce un indicatore della qualità dei dati.
    2. Eseguire SHELXC sul XDS_ASCII. HKL per un'indicazione più accurata del segnale anomalo. La disciplina "Ranom" darà un'indicazione del segnale anomalo alle diverse risoluzioni.
  2. Esegui POINTLESS42 e AIMLESS43 per ridimensionare i dati. In AIMLESS, impostate il parametro ANOMALOUS ON. Se viene utilizzata la GUI, selezionare l'opzione Separa coppie anomale per il rifiuto dell'outlier e l'unione delle statistiche. Potrebbe essere necessario testare diversi tagli di risoluzione per massimizzare il segnale anomalo.
  3. Risolvi la struttura proteica utilizzando la pipeline automatizzata di determinazione della struttura cristallina Auto-Rickshaw44. Auto-Risciò tenterà di risolvere il problema di fase e costruire automaticamente la struttura cristallina della proteina con il software di modellazione e perfezionamento delle proteine.
    1. Per le proteine senza un modello di omologia, eseguire il protocollo SAD di Auto-Risciò in modalità avanzata. Immettere i parametri richiesti.
      1. Selezionare PROTEIN come tipo di molecola.
      2. Immettere la lunghezza d'onda della raccolta dati in angstroms (Å).
      3. Selezionare "I" come elemento di sottostruttura per indicare che sono stati utilizzati atomi di iodio.
      4. Selezionare "i3c" come tipo di sottostruttura per indicare che I3C era la molecola di fase.
      5. Selezionare "sub_direct" come metodo di determinazione della sottostruttura. Questo metodo utilizza SHELXD32 per cercare la sottostruttura.
      6. Selezionare "3" come numero di sottostrutture previste per monomero.
      7. Immettere "1" come limite di risoluzione della ricerca di sottostrutture. Ciò consente all'auto-risciò di determinare automaticamente un taglio di risoluzione adatto.
      8. Immettere il numero di residui in un singolo monomero, il gruppo spaziale del set di dati e il numero di molecole nell'unità asimmetrica in base al coefficiente di Matthews.
      9. Selezionare il livello di diffusione appropriato dei dati a raggi X che si adatta alle esigenze. La selezione di "sviluppatori AutoRickshaw" consentirà agli sviluppatori di autorisciò di risolvere l'esecuzione in caso di problemi.
      10. Immettere i dati anomali come file mtz.
      11. Inserire la sequenza proteica come file seq, pir o txt. Un file seq può essere generato in un editor di testo (ad esempio Blocco note++9 su Windows o nano in Linux). Create un nuovo file, immettete la sequenza primaria della proteina come una lunga riga o separate da interruzioni di riga. Salvare il file con estensione seq.
      12. Immettere un indirizzo di posta elettronica istituzionale.
  4. I risultati vengono consegnati tramite un link web inviato all'indirizzo e-mail fornito.
    NOTA: AutoRickshaw è una pipeline automatizzata che richiama vari pacchetti software di cristallografia per risolvere una struttura cristallina a raggi X32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58. Se la corsa auto-risciò non riesce a risolvere la struttura, è possibile testare altre impostazioni auto-risciò. Il metodo di determinazione della struttura può essere modificato in "sub_phassade" per utilizzare Phaser59 anziché SHELXD32. Anche il numero di sottostrutture previste per monomero può essere aumentato o diminuito.
  5. Durante la fase sperimentale della struttura cristallina, Auto-Risciò tenterà di posizionare atomi pesanti nella cella unitaria, creando una sottostruttura. La disposizione triangolare equilatero degli atomi di iodio in I3C presenta un modo efficiente per convalidare la sottostruttura. Se il passaggio 6.3 non riesce, la convalida della sottostruttura potrebbe essere d'aiuto nella risoluzione dei problemi relativi alla soluzione della struttura.
    1. Scarica l'elenco dei siti di atomi pesanti dalla pagina dei risultati di Auto-Risciò. È un collegamento ipertestuale chiamato "siti atomici pesanti". Questo scarica un file di testo con i siti atomi pesanti.
    2. Modificare l'estensione del file da .txt a .pdb.
    3. Aprire il file PDB in Coot60. Attiva la simmetria per vedere altri atomi pesanti delle unità asimmetriche vicine.
    4. Misurare le distanze tra gli atomi pesanti, anche tra unità asimmetriche. I3C apparirà come un triangolo equilatero con una lunghezza laterale di 6 angstrom. La presenza di un triangolo con queste dimensioni indica che i posizionamenti di quegli atomi pesanti sono corretti.

Risultati

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L'integrazione di I3C in rMMS può generare nuove condizioni che supportano la crescita dei cristalli derivati
L'efficacia dello screening simultaneo rMMS e della derivazione I3C è stata dimostrata in due proteine, il lisozima dell'albume di gallina (HEWL, ottenuto come polvere liofilizzata) e il dominio putativo Orf11 lysin N-terminale (Orf11 NTD) dal batteriofago P68. Ogni proteina è stata proiettata contro PEG/ION HT in quattro diverse condizioni, tra cui: non sementi, sementi, semi di I3C e sementi con I3C(Figura 1). Per entrambe le proteine, l'unica aggiunta di I3C non ha aumentato il numero di condizioni favorevoli alla cristallizzazione. Nel caso di Orf11 NTD, è stata identificata una sola condizione adeguata con e senza I3C(Figura 1B). Quando I3C è stato aggiunto agli schermi HEWL, il numero di colpi è stato ridotto da 31 a 26, evidenziando le complessità aggiunte della cristallizzazione quando si introducono composti fasci (Figura 1A). Coerentemente con altri studi, l'aggiunta di semi a schermi a matrice sparsa commerciali per generare uno schermo rMMS ha aumentato significativamente il numero di possibili condizioni di cristallizzazione per entrambe le proteine, con un aumento di 2,1 e 6 volte per HEWL e Orf11 NTD,rispettivamente 6,61 ( Figura1). Ancora più importante, l'aggiunta simultanea di I3C e seed ha aumentato il numero di hit rispetto a uno schermo non semiseed, dimostrando un aumento di 2,3 e 7 volte rispettivamente per HEWL e Orf11 NTD. Molti dei cristalli di rMMS in presenza di I3C mostrano un'eccellente morfologia cristallina (Figura 2).

La semina consente un attento controllo del numero di cristalli negli schermi I3C rMMS
Negli esperimenti di microseeding, il numero di semi introdotti in una prova di cristallizzazione può essere controllato mediante diluizione dello stock di semi e ciò consente un controllo preciso della nucleazione nellagoccia 7,36. Questo spesso permette ai cristalli più grandi di formarsi poiché c'è una ridotta competizione di molecole proteiche nei siti di nucleazione. Questo vantaggio si estende anche al metodo I3C-rMMS ed è stato dimostrato con successo sia in HEWL che in Orf11 NTD. La ricreazione di una condizione di cristallizzazione identificata dallo schermo I3C-rMMS con uno stock di semi diluito ha prodotto meno cristalli ma più grandi (Figura 3).

La fase SAD può essere utilizzata per risolvere le strutture da cristalli derivati dallo schermo RMMS I3C
I cristalli coltivati utilizzando lo stock di semi diluito mostrato nella figura 3 sono stati utilizzati per risolvere la struttura delle proteine utilizzando la fase SAD utilizzando i dati di diffrazione di un singolo cristallo (Figura 4). I dati sono stati raccolti sulla beamline Australian Synchrotron MX162. I dettagli dettagliati della soluzione di raccolta e struttura dei dati sono descritti altrove27.

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Figura 1 - rMMS è stato utilizzato per generare nuove condizioni per la crescita del cristallo in presenza di I3C per due proteine di prova. 96 schermi di cristallizzazione a diffusione del vapore sono stati eseguiti utilizzando schermi a matrice sparsa commerciali. (A) Il lisozima dell'albume di gallina è stato testato con lo schermo Index HT. I vassoi sono stati seminati con cristalli HEWL coltivati in 0,2 M di tartrato di ammonio dibasico pH 7.0, 20% (w/v) polietilene glicole 3350. (B) Orf11 NTD del batteriofago P68 è stato testato con lo schermo PEG/ION. I vassoi NTD Orf11 sono stati seminati da cristalli della condizione G12 dallo schermo non semiseed, mostrato in blu. Le condizioni che supportano la crescita del cristallo sono mostrate in rosso. La semina rMMS in presenza e assenza di I3C ha dato entrambi un numero significativamente maggiore di colpi di cristallo rispetto ai vassoi non sementi. Figura adattata da Truong etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 - Immagini rappresentative dei cristalli coltivati a partire dalle prove di diffusione del vapore mostrate nella figura 1, lettera a) e b). Figura adattata da Truong etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3 - La diluizione dello stock di semi è un modo efficace per ridurre la nucleazione in una condizione di cristallizzazione trovata utilizzando il metodo I3C-rMMS, per controllare il numero di cristalli che si formano. La riduzione della nucleazione all'interno di una goccia spesso fa crescere i cristalli a dimensioni maggiori. Figura adattata da Truong etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) e HEWL (PDB ID 6PBB) sono stati cristallizzati utilizzando il metodo I3C-rMMS e risolti utilizzando la fase SAD auto-risciò. (A) Strutture a nastro dell'HEWL e dell'Orf11 NTD risolte mediante fase sperimentale. (B) Molecola I3C legata a HEWL e Orf11 NTD. (C) Gli atomi anomali di iodio in I3C sono disposti in un triangolo equilatero di 6 Å. Quindi la presenza di questo triangolo nella sottostruttura di fase indica che c'è una molecola I3C in quella posizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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La determinazione della struttura di una nuova proteina in assenza di un modello di omologia adatto per la sostituzione molecolare richiede una fase sperimentale. Questi metodi richiedono l'incorporazione di atomi pesanti nel cristallo proteico, il che aggiunge un livello di complessità alla pipeline di determinazione della struttura e può introdurre numerosi ostacoli che devono essere affrontati. Gli atomi pesanti possono essere incorporati direttamente nella proteina attraverso l'espressione marcata usando selenometinina e selenocisteina. Poiché questo metodo è costoso, laborioso e può comportare minori rese proteiche, le proteine etichettate sono spesso espresse dopo che le condizioni di cristallizzazione sono state trovate e ottimizzate con proteine non etichettate. In alternativa, i cristalli possono essere derivati immergendosi in una soluzione contenente atomipesanti 22,63,64. Questo metodo utilizza spesso cristalli di alta qualità e viene quindi eseguito dopo che è già stato sviluppato un robusto metodo di cristallizzazione. Ottenere con successo un cristallo derivatizzato utilizzando questo metodo richiede un'ulteriore ottimizzazione delle procedure di ammollo e lo screening di diversi composti di fase, aggiungendo quindi più tempo a un processo già laborioso.

La co-cristallizzazione della proteina con l'atomo pesante può essere eseguita in fase di screening, semplificando così in modo efficiente il processo e riducendo le fasi di manipolazione del cristallo che possono causare danni. Tuttavia, esiste ancora lo scenario potenziale di ottenere pochi colpi iniziali di cristallizzazione e il problema di scegliere un composto atomico pesante compatibile. Molti composti di fase attualmente disponibili sono incompatibili con precipitanti, tamponi e additivi comunemente presenti in condizioni di cristallizzazione. Possono essere insolubili in tamponi solfati e fosfati, chelati a citrato e acetato, reagiscono sfavorevolmente con tamponi HEPES e Tris o vengono sequestrati da DTT e β-mercaptoetanolo21. Poiché il composto graduale I3C non soffre di queste incompatibilità, è un solido composto graduale che potrebbe essere suscettibile a molte condizioni diverse.

In questo studio viene presentato un metodo semplificato per produrre cristalli derivati pronti per la fase SAD attraverso la co-cristallizzazione simultanea del composto di fase I3C e rMMS. La combinazione di entrambe le tecniche aumenta il numero di colpi di cristallizzazione, con molte delle condizioni che hanno migliorato la morfologia e le caratteristiche di diffrazione. Sia nei casi di test ORF11 NTD che HEWL, sono state identificate nuove condizioni nella schermata I3C-rMMS che erano assenti quando I3C non era presente. Potenzialmente, I3C può legarsi favorevolmente alla proteina, facilitando la formazione e la stabilizzazione dei contatti cristallini27. A sua volta, questo può indurre cristallizzazione ed eventualmente migliorare le caratteristiche di diffrazione. Oltre ad essere un composto compatibile con schermi a matrice sparsa, I3C è anche un composto di fasatura attraente a causa delle sue proprietà intrinseche. I gruppi funzionali che si alternano allo iodio sull'impalcatura ad anello aromatico consentono un legame specifico con le proteine. Ciò porta a una maggiore occupazione e potenzialmente riduce il segnale di fondo23. Inoltre, la disposizione degli scatterer anomali in un triangolo equilatero è evidente nella sottostruttura e può essere utilizzata per convalidare rapidamente il legame di I3C(figure 4B e 4C). Infine, può produrre un segnale anomalo con radiazione di sincrotrone tonnibile, nonché sorgenti di raggi X anodici rotanti di cromo e rame. Pertanto, può essere applicato a molti flussi di lavoro diversi. Poiché L'I3C è ampiamente disponibile ed economico da acquistare, questo approccio è a portata di mano per la maggior parte dei laboratori di biologia strutturale.

Quando si utilizza il metodo I3C-rMMS, è necessario affrontare diverse considerazioni sperimentali. Questo metodo non può essere applicato se non è possibile ottenere materiale cristallino iniziale della proteina. Nei casi difficili, il materiale cristallino proveniente da una proteina omologa può anche essere utilizzato per generare lo stock di semi. Questo approccio di cross seeding a rMMS ha mostrato alcuni risultati promettenti7. L'ottimizzazione del numero di cristalli attraverso la diluizione dello stock di semi è un passo cruciale, che non dovrebbe essere trascurato, per massimizzare la possibilità di produrre cristalli di grandi dimensioni di alta qualità e acquisire dati di diffrazione adeguati. Se nell'unità asimmetrica sono identificati pochi siti I3C, le condizioni favorevoli alla cristallizzazione dovrebbero essere ulteriormente ottimizzate con una maggiore concentrazione di I3C. Ciò può aumentare l'occupazione di I3C per massimizzare il segnale anomalo e aiutare la derivazione del cristallo.

Ci possono essere casi in cui questa tecnica potrebbe non essere il metodo ottimale per derivare cristalli proteici. Con l'aumentare delle dimensioni di una proteina o di un complesso proteico, il numero limitato di siti I3C sulla superficie proteica potrebbe non fornire una potenza di fase sufficiente per risolvere la struttura. In questi scenari in cui si sospetta che le dimensioni delle proteine ostacolino la fase, l'etichettatura selenometinina della proteina può essere un approccio più praticabile alla graduale eliminazione della proteina. Se la proteina ha un numero adeguato di residui di metoionina nella proteina (raccomandata con almeno una metinina per 100residui 65)e si può ottenere un'incorporazione di selenomethionina ad alta efficienza in una proteina (come nei sistemi di espressionebatterica 66), nei cristalli saranno presenti più atomi di selenio ad alta occupazione per fasi della struttura.

Inoltre, alcune proteine potrebbero intrinsecamente non essere adatte per la derivazione con I3C. I siti di legame I3C sulle proteine dipendono dalla struttura proteica. Possono esistere proteine che naturalmente hanno poche patch esposte compatibili con il legame I3C. Pertanto, non è imprevedibile che ci possano essere difficoltà nel co-cristallizzare alcune proteine bersaglio con I3C.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata intrapresa sulla linea di fascio MX1 presso l'Australian Synchrotron, parte dell'ANSTO. Gli autori vorrebbero ringraziare i membri dei laboratori Shearwin e Bruning per le discussioni su questo lavoro. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Dr. Santosh Panjikar e la Dott.ssa Linda Whyatt-Shearwin che hanno contribuito al lavoro originale che ha aperto la strada a questo protocollo.

Sono riconosciuti i seguenti finanziamenti: Australian Research Council (grant Nos. DP150103009 e DP160101450 a Keith E. Shearwin); Università di Adelaide (Australian Government Research Training Program borsa di studio a Jia Quyen Truong e Stephanie Nguyen).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringhe Luer Lock usa e getta da 10 mLAdelab ScientificT3SS10LATUsato per la distribuzione di grasso sottovuoto per appendere i vassoi a cristallo a caduta
Piastra di coltura tissutale a 24 pozziSigma AldrichCLS3527Usato per appendere vassoi a cristalli a caduta
Nastro sigillante cristallino largo 3 polliciRicerca HamptonHR4-506Per schermi di cristallizzazione a 96 pozzi montati da robot
5-amino-2,4,6-triiodoisoftalicoAlfa AesarB22178Comunemente chiamato I3C nell'articolo
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 OriginaleRicerca HamptonHR3-297Per schermi di cristallizzazione a 96 pozzi montati da robot
Copertine & nbsp;Thermo Fisher Scientific18X18-2Coperture per appendere pozzi di vassoio a cristallo a caduta
Grasso sottovuoto Dow CorningRicerca HamptonHR3-510Utilizzato per sigillare pozzi di vassoio a cristallo a goccia sospesi
Pipette Eppendorf 0.1 & mu; L-2.5 & mu; LEppendorf3120000011
Gilson Pipette 2 e mu; L-20 & mu; LGruppo John Morris1153247
Gilson Pipette 20 e mu; L-200 & mu; LGruppo John Morris1152006
Pipette pasteur di vetroAdelab ScientificHIR92601.01
Lisozima di albume d'uovo di gallinaSigma-AldrichL6876Circa il 95% di purità
Schermo IndexHTRicerca HamptonHR2-134
Illuminatore per microscopioMeiji TechnoFT192/230Sorgente luminosa per illuminare esperimenti cristallografici
Schermo PEG/ION HTRicerca HamptonHR2-139
Dispenser liquido PhoenixArt Robbins Instruments602-0001-10
Bisturi con lama n. 15Adelab ScientificLV-SMSCPO15
Kit per perline di semiRicerca HamptonHR2-320Il kit contiene una sonda di vetro per frantumare cristalli. Una perla per semi in PTFE, progettata per frantumare cristalli, fa anch'essa parte del kit ma non è utilizzata in questo protocollo.
Microscopio stereo  Meiji TechnoEMZ-5TRMicroscopio per visualizzare esperimenti cristallografici
PinzetteSigma-AldrichT5415
Miscelatore a vorticeAdelab ScientificRAVM1

Riferimenti

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