Summary
Her presenterer vi en protokoll for å undersøke virkningene av hydraulisk oppsprekking på nærliggende bekker ved å analysere deres vann- og sedimentmikrobielle samfunn.
Abstract
Hydraulisk oppsprekking (HF), ofte kalt "fracking", bruker en blanding av høytrykksvann, sand og kjemikalier for å sprekke bergarter, frigjøre olje og gass. Denne prosessen revolusjonerte den amerikanske energiindustrien, da den gir tilgang til ressurser som tidligere var uoppnåelige og nå produserer to tredjedeler av den totale naturgassen i USA. Selv om fracking har hatt en positiv innvirkning på den amerikanske økonomien, har flere studier fremhevet de skadelige miljøeffektene. Av spesiell bekymring er effekten av fracking på headwater bekker, som er spesielt viktig på grunn av deres uforholdsmessig store innvirkning på helsen til hele vannskillet. Bakteriene i disse bekkene kan brukes som indikatorer på strømhelse, da bakteriene som er tilstede og deres overflod i en forstyrret strøm forventes å avvike fra de i en ellers sammenlignbar, men uforstyrret strøm. Derfor tar denne protokollen sikte på å bruke bakteriesamfunnet for å avgjøre om strømmer har blitt påvirket av fracking. Til dette formål må sediment- og vannprøver, fra bekker nær fracking (potensielt påvirket) og oppstrøms eller i et annet vannskille av fracking aktivitet (uhindret) samles inn. Disse prøvene blir deretter utsatt for nukleinsyreutvinning, bibliotekforberedelse og sekvensering for å undersøke mikrobiell samfunnssammensetning. Korrelasjonsanalyser og maskinlæringsmodeller kan deretter brukes til å identifisere hvilke funksjoner som er forklarende for variasjon i samfunnet, samt identifisering av prediktive biomarkører for frackings innvirkning. Disse metodene kan avdekke en rekke forskjeller i de mikrobielle samfunnene blant hovedvannsstrømmer, basert på nærhet til fracking, og tjene som grunnlag for fremtidige undersøkelser om miljøpåvirkningen av fracking-aktiviteter.
Introduction
Hydraulisk oppsprekking (HF), eller "fracking", er en metode for utvinning av naturgass, som har blitt stadig mer utbredt etter hvert som etterspørselen etter fossilt brensel fortsetter å øke. Denne teknikken består av å bruke kraftig boreutstyr for å injisere en blanding av vann, sand og kjemikalier i metanrike skiferavsetninger, vanligvis for å frigjøre fanget gasser1.
Fordi disse ukonvensjonelle høstingsteknikkene er relativt nye, er det viktig å undersøke effekten av slike praksiser på nærliggende vannveier. Fracking aktiviteter mandat rydding av store swaths av land for utstyr transport og brønn pad konstruksjon. Omtrent 1,2-1,7 hektar land må ryddes for hver brønnpute2, noe som potensielt kan påvirke avrenning og vannkvalitet på systemet3. Det er mangel på åpenhet rundt den eksakte kjemiske sammensetningen av fracking væske, inkludert hvilke biocider som brukes. I tillegg har fracking avløpsvann en tendens til å være svært saltvann2. Videre kan avløpsvannet inneholde metaller og naturlig forekommende radioaktive stoffer2. Derfor er muligheten for lekkasjer og søl av fracking væske på grunn av menneskelig feil eller utstyrsfeil bekymret.
Stream økosystemer er kjent for å være svært følsomme for endringer i omkringliggende landskap4 og er viktige for å opprettholde biologisk mangfold5 og riktig næringssykling6 innenfor hele vannskillet. Mikrober er de mest tallrike organismene i ferskvannsstrømmer, og er derfor avgjørende for næringssykling, biologisk nedbrytning og primærproduksjon. Mikrobiell samfunnssammensetning og funksjon tjener som gode verktøy for å få informasjon om økosystemet på grunn av deres følsomhet for perturbance, og nyere forskning har vist tydelige endringer i observerte bakterielle sammenstillinger basert på nærhet til fracking aktivitet7,8. For eksempel ble Beijerinckia, Burkholderiaog Methanobacterium identifisert som beriket i bekker nær fracking mens Pseudonocardia, Nitrospiraog Rhodobacter ble beriket i bekkene ikke i nærheten av fracking7.
Neste generasjons sekvensering av 16S ribosomal RNA (rRNA) genet er en rimelig metode for å bestemme bakteriell samfunnssammensetning som er raskere og billigere enn hele genomsekvensering nærmer seg9. En vanlig praksis innen molekylær økologi er å bruke den svært variable V4-regionen i 16S rRNA-genet for sekvenseringsoppløsning, ofte ned til slektsnivå med et bredt spekter av identifikasjon9, da det er ideelt for uforutsigbare miljøprøver. Denne teknikken har blitt implementert mye i publiserte studier og har blitt brukt til å identifisere virkningen av fracking operasjoner på vannmiljøer7,8. Det er imidlertid verdt å merke seg at bakterier har varierende kopitall av 16S rRNA-genet, noe som påvirker deres oppdagede overflod10. Det er noen få verktøy for å gjøre rede for dette, men deres effekt er tvilsom10. En annen praksis som raskt vokser i utbredelse og mangler denne svakheten er metatranskriptomisk sekvensering, der alle RNA er sekvensert, slik at forskere kan identifisere både aktive bakterier og deres genuttrykk.
I motsetning til metoder i tidligere publiserte studier7,8,11,12, dekker denne protokollen derfor også utvalgsinnsamling, bevaring, behandling og analyse for å undersøke mikrobiell fellesskapsfunksjon (metatranscriptomics). Trinnene som er beskrevet her, gjør det mulig for forskere å se hvilken innvirkning, om noen, fracking har hatt på genene og veiene uttrykt av mikrober i sine bekker, inkludert antimikrobielle resistensgener. Dessuten er detaljnivået som presenteres for prøveinnsamling forbedret. Selv om flere av trinnene og notatene kan virke åpenbare for erfarne forskere, kan de være uvurderlige for de som nettopp har startet forskningen.
Her beskriver vi metoder for prøveinnsamling og prosessering for å generere bakterielle genetiske data som et middel til å undersøke virkningen av fracking på nærliggende bekker basert på laboratorienes flere års erfaring. Disse dataene kan brukes i nedstrømsprogrammer for å identifisere forskjeller som tilsvarer fracking-status.
Protocol
1. Innsamling av sedimentprøver for nukleinsyreutvinning
- Senk et sterilt 50 ml konisk rør ned i bekkevannet. Bruk hansker under prøveoppsamling for å unngå å introdusere uønsket menneskelig forurensning. Utfør dette trinnet enten fra kysten eller vendt oppstrøms hvis du er i vannet.
- Mens det koniske røret er nedsenket, fjern hetten og bruk den til å øse ca. 3 ml sediment fra en dybde på 1 til 3 cm inn i det koniske røret.
- Fjern det koniske røret fra vannet og dump ut alt vann, bortsett fra et tynt lag som dekker sedimentprøven (ca. 1 ml).
- Bruk en 1000 μL pipette og passende pipettespisser, tilsett 3 ml DNA/RNA konserveringsmiddel (se Materialfortegnelsestabell for konserveringsmiddelspesifikasjonene) i den innsamlede prøven. Oppbevar pipettespissene i en steril pipettespissboks, og fest dem kun umiddelbart før bruk og kastes etter bruk. Snu det kappede koniske røret 10 ganger for å sikre at konserveringsmiddelet og prøven blandes grundig.
MERK Trinn 1.4 er ikke nødvendig, men det anbefales sterkt hvis RNA skal ekstraheres fra sedimentene senere. - Plasser prøvene på is for resten av prøvesamlingen. Når du kommer tilbake fra innsamling, oppbevar i en fryser ved -20 °C hvis prøvene skal brukes til 16S-analyse (DNA) eller -70 °C, hvis de skal brukes til metatranskriptomikkanalyse (RNA).
2. Filteroppsamling for nukleinsyreutvinning
- Fjern hetten på en steril 1 L-flaske. Mens du vender oppstrøms eller fra land, fyll flasken med bekkevann til toppen og dump den deretter ut. Gjenta denne prosessen to ganger til for å kondisjonere flasken. Fyll hele flasken for fjerde gang og hette den.
MERK: Hvis du gjenbruker en 1 L-flaske, kan den steriliseres ved å skylle med 10% blekemiddel i 2 min, etterfulgt av skylling tre ganger med deionisert vann og deretter en gang med 70% etanol, og til slutt autoklavering med innstillinger: 30 min eksponeringstid ved 121,1 ° C og 15 min tørketid. Under autoklavering bør hetten på flasken være veldig løs for å unngå at flasken komprimeres i prosessen. - Når du er på et stabilt underlag, bruk en steril Luer-låsesprøyte og trekk opp et fullt volum. Koble deretter sprøyten til et sterilt og DNA/RNA-fritt polyetersulfonfilter med en porestørrelse på 0,22 μm og skyv hele volumet gjennom filteret ved å trykke stempelet helt ned. Gjenta denne prosessen til det totale volumet som samles inn i flasken (1 L) skyves gjennom filteret.
MERK: Volumet på sprøyten kan variere, hvis den totale mengden vann som skyves gjennom filteret spores. Men generelt er 60 ml foretrukket. Mens 1 L er ideelt, anekdotisk, vil et volum på minst 200 ml sannsynligvis fortsatt samle nok biomasse (forutsatt ~ 20.000 celler per ml) for utvinning av DNA og RNA. - Fjern overflødig vann fra filteret ved å trekke opp omtrent 20 ml luft i sprøyten og skyve det gjennom filteret.
MERK: Dette vil bidra til å forhindre tap av konserveringsmiddelet hvis trinn 2.4 utføres. - Bruk en P1000 mikropipette, tilsett 2 ml AV et DNA/RNA-konserveringsmiddel ved å tømme det ut gjennom filterets større åpning (der den var festet til sprøyten) mens du holdt filteret horisontalt. Spissen på pipetten skal være innenfor filterets tønne når pipetten trykkes ned for å sikre at konserveringsmiddelet kommer inn i filteret. Endre tipset etter hver bruk.
MERK: Som med sedimentsamlingen er dette trinnet ikke nødvendig, men det anbefales sterkt for økt nukleinsyreutbytte senere, spesielt for RNA. - Skrell av en firkant med parafinfilm og pakk den tett rundt hver åpning / ende av filteret for å forsegle. Legg det parafinfilmen innpakket filter i en steril prøvepose, og legg deretter hele posen på is under oppsamling.
MERK: Påse at siden som brukes til å vikle filteret er steril, det vil si ikke tidligere utsatt for miljøet. - Ved retur fra prøvetaking lagrer du filtre ved -20 °C i 16S eller -70 °C for metatranskripsjon.
3. Nukleinsyreutvinning og kvantifisering
- Rengjør arbeidsområdet med 10 % blekemiddel og 70 % etanol før du begynner prøveoverføringen.
- For sediment (fra trinn 1,5) bruk vanligvis ~ 0,25 g prøve. Flammesteriliser et metallverktøy ved å dyppe det i et beger på 70% etanol og brenne etanol av mellom prøver.
- For filtre (fra trinn 2.6) flytter du filterpapiret til et sterilt rør for ekstraksjon. Følg trinnene nedenfor for å gjøre dette.
- Lag en steril, DNA- og RNA-fri overflate ved å brette aluminiumsfolie slik at den indre delen av folden ikke utsettes for utemiljøet og autoklaverer det brettede stykket med innstillingene: 121,1 °C og 5 min tørketid.
- Steriliser et skrustikkegrep med 70% etanol og åpen flamme. Bruk deretter skrustikkegrepet til å åpne filterhuset på den sterile overflaten og fjern kjernen fra huset.
- Bruk en steril skalpell til å kutte filterpapiret bort fra kjernen ved å kutte øverst og nederst og deretter langs sømmen. Brett filterpapiret med sterile pinsett, og klipp deretter filteret i små biter ved hjelp av skalpellen.
- Plasser filterstykkene i et mikrosenterrør for ekstraksjon. Pass på at filterpapiret ikke kommer i kontakt med overflater som ikke er sterilisert eller som kan ha nukleinsyre til stede, da dette vil føre til uønsket forurensning av prøven.
- Utfør DNA-isolasjon som beskrevet tidligere13 eller ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kolonnebasert sett (se Materialfortegnelser). Trinnene for det oppførte kommersielle settet er kort beskrevet nedenfor.
- Lyse cellene i prøven ved å overføre den til et perlerør og utsette den for en celleforstyrrer med høy hastighet i minst 5 minutter. Sentrifuger og overfør supernatanten til et sterilt mikrosenterrør.
- Legg lysisbufferen til supernatanten (1:1-volum) og overfør til det medfølgende filteret (gult). Sentrifuger filteret.
- Overfør filteret til et nytt sterilt mikrosenterrør. Tilsett forberedelsesbufferen (400 μL), sentrifuger og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett vaskebuffer (700 μL), sentrifuger og kast gjennomstrømningen. Tilsett deretter vaskebuffer (400 μL), sentrifuge og kast gjennomstrømningen igjen.
- Overfør filteret til et nytt sterilt mikrosenterrør. Elute med 50 μL DNase / RNase fritt vann og la sitte i 5 min ved romtemperatur før sentrifugering.
- I løpet av dette i kubasjonsperioden forbereder du III-HRC-filteret ved å plassere det i et oppsamlingsrør og legge hrc prep-løsningen (600 μL) til det, etterfulgt av et sentrifugeringstrinn på 3 min ved 8000 x g.
- Flytt det forberedte filteret til et sterilt mikrosenterrør. Overfør det eluterte DNA-et fra trinn 3.4.5 til dette filteret og sentrifuge ved 16.000 x g i 3 min. Gjennomstrømningen inneholder det ekstraherte DNA-et.
- Oppbevar DNA-ekstrakter for både sedimenter og filtre ved -20 °C.
MERK: DNA-ekstrakter kan lagres i rundt 8 år ved -20 °C forutsatt stabil temperatur, begrenset lyseksponering og ingen skadelige forurensninger14. - Utfør RNA-isolasjon i henhold til produsentens protokoll. Oppbevar RNA-ekstrakter ved -80 °C.
- Lyse cellene i prøven ved å overføre den til et perlerør og utsette den for en celleforstyrrer med høy hastighet i minst fem minutter. Sentrifuger og overfør supernatanten til et sterilt mikrosenterrør.
- Legg lysisbufferen til supernatanten (1:1-volum) og overfør til den medfølgende kolonnen (gul). Sentrifuger kolonnen.
- Tilsett et likt volum på 95-100% etanol i gjennomstrømningen og bland ved å pipettere opp og ned fem ganger.
- Plasser IICG-søylen (grønn) på et sterilt mikrosenterrør. Overfør den blandede løsningen til kolonnen og sentrifugen.
- Tilsett vaskebuffer (400 μL), sentrifuger og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 5 μL DNase I og 75 μL DNA-fordøyelsesbuffer i kolonnen og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
- Legg til prep buffer (400 μL), sentrifuge, og kast gjennom strømmen.
- Tilsett vaskebuffer (700 μL), sentrifuger og kast gjennomstrømningen. Tilsett deretter vaskebuffer (400 μL), sentrifuge og kast gjennomstrømningen igjen.
- Overfør kolonnen til et nytt sterilt mikrosenterrør. Elute med 50 μL DNase / RNase fritt vann og la sitte i 5 min før sentrifugering.
- I løpet av denne inkubasjonsperioden klargjør du III-HRC-filteret ved å plassere det i et oppsamlingsrør og legge hrc prep-løsningen (600 μL) til det, etterfulgt av et sentrifugeringstrinn på 3 min ved 8000 x g.
- Flytt det forberedte filteret til et sterilt mikrosenterrør. Overfør den eluted RNA fra trinn 3.6.9 til dette filteret og sentrifuge på 16,000 x g i 3 min. Gjennomstrømningen inneholder den ekstraherte RNA.
MERK: RNA-ekstrakter kan bare lagres i ett år før de begynner å forringes15. Både DNA- og RNA-ekstrakter forringes ved gjentatt frysetining. Noen protokoller tillater utvinning av både DNA og RNA fra samme prøve16,17.
- Kvantifisere de ekstraherte DNA- og RNA-prøvene ved hjelp av et fluorometer eller et spektrofotometer. Se tabell 1 for eksempel DNA-konsentrasjonsverdier for fluorometer. Hvis du vil se et eksempel på en kvantifiseringsprotokoll for spektrofotometer, se referanse18. Dna-konsentrasjonsverdier for sedimenter med settet som er oppført i Materialfortegnelse, varierer vanligvis fra 1 til 40 ng/μL, mens dna-konsentrasjonsverdiene for filtre har en tendens til å variere fra 0,5 til 10 ng/μL. Sediment RNA-konsentrasjonsverdier med settet som er oppført i Tabell over materialer, varierer vanligvis fra rundt 1 til 20 ng/μL, mens konsentrasjonen av filter RNA-verdier har en tendens til å være lavere, vanligvis fra 0,5 til 5 ng/μL.
4. 16S rRNA bibliotek opprettelse
- Rengjør arbeidsområdet med 10% blekemiddel og 70% etanol. Arbeidsområdet skal være et lukket rom som er i stand til å produsere laminære strømningsforhold (laminær strømningshette).
- Bruk DNA-ekstraktene (fra trinn 3.5) og forbered prøver for 16S rRNA-ampliconsekvensering med en standard PCR-protokoll, for eksempel den som er beskrevet på jordens mikrobioms nettsted som forsterker V4 hypervariabel region på 16S rRNA19 under laminære strømningsforhold.
- Forbered en 2% agarose gel som beskrevet tidligere og la den størkne17. Bland 7 μL PCR-produkt og 13 μL DNase fritt vann. Tilsett et gellastefargestoff til en endelig konsentrasjon på 1x. Når agarose er størknet, last disse PCR-produktene blandes på en 2% agarose gel.
MERK: Alternativt kan en forhåndsstøpt gel brukes i stedet, da disse gelene går raskere og kommer forhåndslagd. - Kjør gelen på 90 V i 60-90 min for å se etter båndstørrelsen på 386 som vellykket forsterkning for 16S rRNA V4-amplikoner, ved hjelp av Earth Microbiomes protokoll.
5. DNA 16S rRNA bibliotek rensing
- Pool 10 μL PCR-produkter for prøvene som ga lyse bånd og 13 μL for prøvene som ga svake bånd i et sterilt mikrosenterrør i riktig størrelse.
- Kontroller konsentrasjonen av det resulterende bassenget ved hjelp av et fluorometer eller spektrofotometer og lag en 2% agarose gel som før. Ideelt sett bør bassenget ha en konsentrasjon på minst 10 ng / μL, og de fleste prøver burde ha hatt en konsentrasjon på rundt 25 ng / μL.
- Konsentrasjon og volum tillatt, last rundt 150-200 ng i en brønn på 2% agarose gel.
- Kjør gelen i 60-90 min ved 90 volt.
- Rens det samlede biblioteket ved å kjøre en 2% agarose gel.
- Slukk 386 bp DNA-båndet fra gelen og rens det samlede biblioteket ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett som beskrevet tidligere20. Elute renset DNA med 30 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8,5). Utfør dette trinnet i et annet område enn DNA- eller RNA-ekstraksjon for å forhindre fremtidig forurensning, da kutting av gelen vil spre PCR-amlikoner på både eksperimentatoren og området rundt.
- Kontroller konsentrasjonen av det rensede bassenget ved hjelp av et fluorometer eller spektrofotometer. Hvis rensing gikk bra, bør konsentrasjonen være minst halvparten av de unyttede bassengene. Vanligvis bør den endelige konsentrasjonen variere fra 5 til 20 ng / μL.
- Send de rensede bibliotekene for neste generasjons sekvensering. Sørg for at de holdes kalde under transport ved å inkludere tørris i containeren.
6. RNA bibliotek opprettelse og rensing
- Flere kommersielle sett kan brukes til å lage RNA-biblioteker. For den som brukes, følg produsentens protokoll som skrevet mens du arbeider i et sterilt laminært strømningsmiljø. En veldig oppsummert versjon av protokollen for kit i materialtabellen presenteres under21.
- Lag den første tråden cDNA syntese master mix (8 μL nukleasefritt vann og 2 μL first strand syntese enyzme mix) og legg den til prøven. Plasser prøven i termosykleren med betingelsene som er angitt i protokollen.
- Lag den andre tråden cDNA syntese master mix (8 μL av Second Strand Synthesis Reaction Buffer, 4 μL Second Strand Synthesis Enzyme Mix, og 48 μL nukleasefritt vann) på is og legg den til prøven. Plasser i en termosykler satt til 16 °C i én time.
- Rens reaksjonen ved å legge til de medfølgende perlene (144 μL) og utføre to 80% etanolvasker (200 μL).
- Elute med den medfølgende TE-bufferen (53 μL) og overfør 50 μL av supernatanten til et rent PCR-rør. Plasser PCR-røret på is.
- Lag end prep master mix (7 μL end prep reaksjon buffer og 3 μL end prep enzymblanding) på is og legg den til PCR-røret. Plasser PCR-røret i en termosykler med betingelsene som er angitt i protokollen.
- Bland de fortynnede adapterne (2,5 μL), Ligation Master Mix (30 μL) og Ligation Enhancer (1 μL) løsninger på is. Tilsett de blandede løsningene i prøven og legg dem i en termosykler i 15 minutter ved 20 °C.
- Rens reaksjonen ved å legge til de medfølgende perlene (87 μL) og utføre etanolvasker (200 μL) og elution som før, unntatt bare tilsett 17 μL TE.
- Tilsett indekser (10 μL) og Q5 Master Mix (25 μL) oppløsning og plasser i en termosykler med forholdene som er beskrevet i protokollen.
- Rens reaksjonen ved å legge til de medfølgende perlene (45 μL) og utføre et tillegg to etanolvasker (200 μL) og elute med 23 μL TE. Overfør 20 μL til et rent PCR-rør.
- Kontroller bibliotekene for påvisbare konsentrasjoner av RNA ved hjelp av en Bioanalyzer, fluorometer eller spektrofotometer.
- Samle de metatranskriptomiske bibliotekene i et omtrent likeverdig forhold.
- Rens biblioteket etter samme protokoll for 16S-bibliotekets rensing, unntatt særfragmenter mellom 250 og 400 bp. Mens 16S-biblioteket hadde et tydelig bånd som representerte den forsterkede regionen, er resultatet her et smør.
- Kontroller konsentrasjonen av det rensede biblioteket som før.
- Send det rensede biblioteket med tørris til et sekvenseringsanlegg.
MERK: Alternativt kan RNA-ekstrakter sendes til et universitet eller privat selskap for bibliotekforberedelse og sekvensering.
7. Mikrobiell samfunnsanalyse
- Når sekvenseringen er fullført, får du tilgang til eksempeldataene. Last den ned til en brukbar datamaskin.
MERK: Ideelt sett bør enheten ha minst 16 gigabyte RAM. Hvis du vil ha en drøfting av databehandlingskrav (for Qiime2), kan du se https://forum.qiime2.org/t/recommended-specifications-to-run-qiime2/9808. - Bruk programvare, for eksempel mothur, QIIME2 og R, til å analysere 16S rRNA-data. Se her https://docs.qiime2.org/2020.11/tutorials/moving-pictures/ for et eksempel QIIME2 16S analyseopplæring.
- For metatranscriptomics (RNA)-data, bruk HUMAnN2 og ATLAS for å finne ut hvilke gener og veier som finnes i prøvene.
MERK: Et eksempel metatranscriptomics rørledning som kulminerer i mangfold og tilfeldig skoganalyse presenteres i Supplemental Information-filen. Alle kommandoer kjøres via kommandolinjen, for eksempel Terminal for Mac-brukere.
Representative Results
Suksessen til DNA- og RNA-ekstraksjoner kan evalueres ved hjelp av en rekke utstyr og protokoller. Generelt anses enhver påviselig konsentrasjon av en av dem som tilstrekkelig til å konkludere med at utvinningen var vellykket. Ved å undersøke tabell 1 da, ville alle utvinninger, bortsett fra en, bli kalt vellykket. Svikt på dette trinnet skyldes ofte lav innledende biomasse, dårlig prøvebevaring eller menneskelig feil under utvinning. Når det gjelder filtre, kan utvinningen ha vært vellykket selv om konsentrasjonen er under deteksjon. Hvis disse ekstraktene ikke gir bånd for PCR (hvis du gjør 16S) eller en påviselig konsentrasjon etter bibliotekforberedelse (metatranscriptomics), så mislyktes de sannsynligvis virkelig.
Hvis 16S-protokollen følges, indikerer lyse bånd etter PCR-forsterkning, sett i brønn 4 og 6 i figur 1, suksess, mens mangel på bånd, sett i de andre brønnene i øverste rad, indikerer feil. Videre vil et lyst bånd i gelbanen som inneholder en negativ PCR-kontroll også indikere en feil, siden det ville være risikabelt å anta at forurensningen som påvirker de negative kontrollen(e) ikke påvirket prøvene.
For både 16S og metatranscriptomics kan suksessen til sekvensering evalueres ved å se på antall sekvenser oppnådd (Figur 2). 16S-prøver bør ha minst 1000 sekvenser, der minst 5000 er ideelle (figur 2A). På samme måte bør metatranscriptomics-prøver ha minst 500 000 sekvenser, der minst 2 000 000 er ideelle (figur 2B). Prøver med færre sekvenser enn disse minimumene bør ikke brukes til analyser, da de kanskje ikke nøyaktig representerer deres bakterielle samfunn. Imidlertid kan prøver som faller mellom minimum og ideal fortsatt brukes, selv om resultatene bør tolkes mer forsiktig hvis mange prøver faller i det området.
Suksessen med påfølgende nedstrømsanalyse kan bestemmes ganske enkelt på grunnlag av om de forventede utdatafilene ble oppnådd eller ikke. I alle fall bør programmer, for eksempel QIIME2 og R (figur 3), tillate evaluering av potensielle betydelige forskjeller mellom bakteriesamfunnene basert på fracking. Dataene for figur 3 ble innhentet ved å samle inn sedimentprøver fra tjueen forskjellige steder ved tretten forskjellige bekker for 16S og metatranscriptomics analyse. Av disse tjueen stedene var tolv av dem nedstrøms fracking aktivitet og klassifisert som HF +, og ni av dem var enten oppstrøms for fracking aktivitet eller i et vannskille der fracking ikke skjedde; disse bekkene ble klassifisert som HF-. Foruten tilstedeværelsen av fracking aktivitet, var bekkene ellers sammenlignbare.
Disse forskjellene kan ha form av konsistente komposisjonsskift basert på fracking-status. Hvis det var tilfelle, ville HF + og HF- prøver forventes å klynge seg fra hverandre i en PCoA-tomt, som det er tilfelle i figur 3A og figur 3B. For å bekrefte at de tilsynelatende skiftene ikke bare er en artefakt av ordinasjonsmetoden, er det nødvendig med ytterligere statistisk analyse. For eksempel er en PERMANOVA22-test på avstandsmatrisen som figur 3A og figur 3B er basert på avslørt signifikant klynger basert på fracking-status, noe som betyr at separasjonen som observeres i plottet er i samsvar med forskjeller mellom prøvenes bakteriesamfunn, i stedet for en artefakt av ordinasjon. Et betydelig PERMANOVA- eller ANOSIM-resultat er en sterk indikasjon på konsistente forskjeller mellom HF+ og HF-prøver, noe som indikerer at HF+-prøvene ble påvirket av fracking, mens en høy p-verdi indikerer at prøvene ikke ble påvirket. Metatranscriptomiske data kan også visualiseres og evalueres ved hjelp av de samme metodene.
Undersøkelse av differensialfunksjoner (mikrober eller funksjoner) kan avsløre bevis på at prøver også har blitt påvirket. En metode for å bestemme differensialfunksjoner er å lage en tilfeldig skogmodell. Den tilfeldige skogmodellen kan brukes til å se hvor godt prøvens fracking-status kan klassifiseres riktig. Hvis modellen presterer bedre enn forventet ved en tilfeldighet, vil det være ytterligere bevis på forskjeller avhengig av fracking-status. Videre ville de viktigste prediktorene avsløre hvilke funksjoner som var viktigst for riktig differensiering av prøver (Figur 3C). Disse funksjonene ville også ha hatt konsekvent forskjellige verdier basert på fracking-status. Når disse differensialfunksjonene er bestemt, kan litteraturen gjennomgås for å se om de tidligere har vært forbundet med fracking. Det kan imidlertid være utfordrende å finne studier som bestemte differensialfunksjoner, da de fleste bare har brukt 16S rRNA komposisjonsdata. Derfor, for å evaluere implikasjonene av differensialfunksjoner, ville en mulig metode være å se om de tidligere har vært forbundet med potensiell motstand mot biocider som vanligvis brukes i fracking væske eller om de kunne bidra til å tolerere svært saltvannsforhold. Videre kan det å undersøke den funksjonelle profilen til en interesseskatt avsløre bevis på frackings innvirkning (Figur 3D). For eksempel, hvis en takson identifiseres som differensial av den tilfeldige skogmodellen, kan dens antimikrobielle motstandsprofil i HF + -prøver sammenlignes med profilen i HF-prøver, og hvis de varierer sterkt, kan det tyde på at fracking væske som inneholder biocider kom inn i strømmen.
| Eksempel-ID | Konsentrasjon (ng/μL) |
| 1 | 1.5 |
| 2 | 1.55 |
| 3 | 0.745 |
| 4 | 0.805 |
| 5 | 7.82 |
| 6 | 0.053 |
| 7 | 0.248 |
| 8 | 0.945 |
| 9 | 1.82 |
| 10 | 0.804 |
| 11 | 0.551 |
| 12 | 1.69 |
| 13 | 4.08 |
| 14 | Below_Detection |
| 15 | 7.87 |
| 16 | 0.346 |
| 17 | 2.64 |
| 18 | 1.15 |
| 19 | 0.951 |
Tabell 1: Eksempel på DNA-konsentrasjoner basert på fluorometer 1x DS DNA høysensitiv analyse. Ekstraksjoner for alle disse prøvene, unntatt 14, vil bli ansett som vellykket på grunn av å ha påvisbare mengder DNA.
Figur 1: Eksempel på e-gel med PCR-produkter. Gelen ble forfarget og visualisert under UV-lys, noe som fikk ethvert DNA som var tilstede på den til å gløde. PCR jobbet for prøvene i brønn 4 og 6 i første rad, da de begge hadde ett enkelt lysbånd av forventet størrelse (basert på stigen). PCR for prøvene i de andre seks brønnene mislyktes, da de ikke produserte noen bånd. Den positive kontrollen (første brønn, andre rad) hadde et lyst bånd, noe som indikerer at PCR ble utført riktig, og de negative kontrollene (brønn 6 og 7, andre rad) hadde ingen bånd, noe som indikerer at prøver ikke var forurenset. Hvis et negativt hadde et bånd så lyst som prøvene, ville PCR ha blitt ansett som en feil siden det ville være risikabelt å anta at prøvene hadde amlikoner som ikke bare var et resultat av forurensning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempel på sekvensantall. (A) 16S eksempelsekvensantall. Nesten alle disse 16S-prøvene hadde over 1000 sekvenser. De svært få som hadde mindre enn 1000 sekvenser, bør utelukkes fra nedstrømsanalyser, da de ikke hadde tilstrekkelige sekvenser til å representere bakteriesamfunnene sine nøyaktig. Flere sekvenser hadde mellom 1000 og 5000 sekvenser; selv om de ikke er ideelle, vil de fortsatt være brukbare siden de overskrider det minste minimum, og de fleste prøver overstiger det ideelle minimumet på 5000 også. (B) Metatranscriptomics eksempel teller. Alle prøver oversteg både minimum (500 000) og ideelt minimum (2 000 000) antall sekvenser. Derfor var sekvensering vellykket for dem alle, og de kunne alle brukes i nedstrømsanalyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksempelanalyse. (A) PCoA-plott basert på koordinater beregnet med en vektet Unifrac-avstandsmatrise opprettet og visualisert gjennom QIIME2. (B) PCoA-plott basert på koordinater beregnet med den vektede Unifrac-avstandsmatrisen eksportert fra QIIME2. Koordinatene ble visualisert ved hjelp av Phyloseq- og ggplot2-pakkene i R. Metadata-vektorer ble montert på plottet ved hjelp av Vegan-pakken. Hvert punkt representerer et utvalgs bakteriesamfunn, med nærmere punkter som indikerer mer lignende samfunnssammensetninger. Klynger basert på fracking-status for disse 16S sedimentprøvene ble observert (PERMANOVA, p = 0,001). Videre avslører vektorene at HF+ prøvene hadde en tendens til å ha høyere nivåer av Barium, Bromide, Nickel og Zinc, som korresponderte med forskjellig bakteriell samfunnssammensetning sammenlignet med HF-prøvene. (C) Plott av beste prediktorer for en tilfeldig skogsmodell som testet hvor bakterielle overfloder kunne brukes til å forutsi fracking status blant prøvene. Den tilfeldige skogmodellen ble opprettet gjennom R ved hjelp av randomForest-pakken. De 20 beste prediktorene vises i tillegg til den resulterende nedgangen i urenhet (mål på antall HF+ og HF-prøver gruppert sammen) i form av Gjennomsnittlig reduksjon i Gini Index når de brukes til å skille prøver. (D) Sektordiagram som viser den antimikrobielle motstandsprofilen til Burkholderiales-profilen basert på metatranscriptomiske data. Sekvenser ble først kommentert med Kraken2 for å avgjøre hvilken taxa de tilhørte. BLAST ble deretter brukt med de kommenterte sekvensene og MEGARes 2.0-databasen for å avgjøre hvilke antimikrobielle resistensgener (i form av "MEG_#") som ble aktivt uttrykt. Antimikrobielle resistensgener uttrykt av medlemmer av Burkholderiales ble deretter hentet ut for å se hvilke som var mest utbredt blant de taxa. Selv om det er dyrere og tidkrevende, tillater metatranscriptomikk funksjonelle analyser, for eksempel dette som ikke kan gjøres med 16S-data. Spesielt ble Kraken2 brukt til denne eksempelanalysen, i stedet for HUMAnN2. Kraken2 er raskere enn HUMAnN2; Det gir imidlertid bare komposisjonsinformasjon, i stedet for sammensetning, bidrag og funksjoner (gener) og veier som HUMAnN2 gjør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil: Et eksempel på metatranscriptomics-rørledning. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Metodene beskrevet i denne artikkelen er utviklet og raffinert i løpet av flere studier publisert av vår gruppe mellom 2014 og 20187,8,10 og har blitt brukt med hell i et samarbeidsprosjekt for å undersøke virkningene av fracking på vannsamfunn i et treårig prosjekt som snart vil sende inn en artikkel for publisering. Disse metodene vil fortsatt bli benyttet i løpet av resten av prosjektet. I tillegg beskriver annen aktuell litteratur som undersøker virkningen av fracking på bekker og økosystemer lignende metoder for utvalgsinnsamling, behandling og analyse7,8,10,11. Imidlertid brukte ingen av disse papirene metatranskriptomisk analyse, noe som gjorde denne artikkelen den første til å beskrive hvordan disse analysene kan brukes til å belyse frackings innvirkning på nærliggende bekker. Videre er metodene som presenteres her for prøveinnsamling mer detaljerte, og det samme er trinnene som er tatt for å unngå forurensning.
Et av de viktigste trinnene i protokollen vår er første prøveinnsamling og bevaring. Feltprøvetaking og -innsamling har visse utfordringer, da det kan være vanskelig å opprettholde et aseptisk eller sterilt miljø under innsamling. I løpet av dette trinnet er det viktig å unngå forurensende prøver. For å gjøre dette, bør hansker brukes, og bare sterile beholdere og verktøy bør få lov til å komme i kontakt med prøver. Prøver bør også umiddelbart plasseres på is etter innsamling for å redusere nukleinsyreforringelse. Å legge til et kommersielt nukleinsyre konserveringsmiddel ved innsamling kan også øke nukleinsyreutbyttet og tillate at prøver lagres i lengre perioder etter innsamling. Når nukleinsyreutvinning utføres, er det viktig å bruke riktig mengde prøve, for mye kan tette spinnfiltre som brukes til utvinning (for de protokollene som bruker dem), men for lite kan resultere i lave utbytter. Pass på at du følger instruksjonene for det settet som brukes.
I likhet med feltinnsamling er det også viktig å unngå eller minimere forurensning under nukleinsyreutvinning og prøvepreparering, spesielt når du arbeider med lave nukleinsyreutbytteprøver, for eksempel suboptimale sedimentprøver (prøver som inneholder en stor mengde grus eller bergarter) eller vannprøver. Derfor, som med prøveoppsamling, bør hansker brukes under alle disse trinnene for å redusere forurensning. I tillegg bør alle arbeidsflater som brukes under laboratorieprosedyrer steriliseres på forhånd ved å tørke av med en 10% blekemiddelløsning, etterfulgt av en 70% etanoloppløsning. For pipetteringstrinn (3-6) bør filterspisser brukes til å unngå forurensning på grunn av selve pipetten, med spisser som endres hver gang de berører en ikke-steril overflate. Alle verktøy som brukes til laboratoriearbeid, inkludert pipetter, bør tørkes av før og etter med blekemiddel- og etanolløsningene. For å evaluere forurensning bør ekstraksjonsemner og negativer (steril væske) inkluderes under hvert sett med nukleinsyreekstraksjoner og PCR-reaksjoner. Hvis kvantifisering etter ekstraksjon avslører en påviselig mengde DNA/RNA i negativene, kan ekstraksjoner gjentas hvis det er tilstrekkelig prøve igjen. Hvis negative prøver for PCR viser forsterkning, bør feilsøking utføres for å bestemme kilden, og deretter bør prøvene kjøres på nytt. For å ta hensyn til lave nivåer av forurensning, anbefales det at ekstraksjonsemner og PCR-negativer sekvenseres slik at forurensningene kan identifiseres og fjernes, om nødvendig, under beregningsanalyse. På den annen side kan PCR-forsterkning også mislykkes på grunn av en rekke årsaker. For miljøprøver er hemming av PCR-reaksjonen ofte skyldige, noe som kan skyldes en rekke stoffer som forstyrrer Taq polymerase23. Hvis det mistenkes hemming, kan PCR-vann (se Materialfortegnelse) brukes til å fortynne DNA-ekstraktene.
Denne protokollen har noen få bemerkelsesverdige begrensninger og potensielle vanskeligheter. Prøvetaking kan være utfordrende for både vann- og sedimentprøver. For å få nok biomasse, må ideelt 1 L av bekkevann skyves gjennom et filter. Porene i filteret må være små for å fange mikrober, men kan også fange opp sediment. Hvis mye sediment er i vannet på grunn av nylig nedbør, kan filteret tette, noe som gjør det vanskelig å skyve hele volumet gjennom filteret. For sedimentinnsamling kan det være utfordrende å estimere dybden av sediment under innsamling. Videre er det viktig å sikre at sedimentet som samles inn hovedsakelig er jord, da småstein og bergarter vil føre til lavere nukleinsyreutbytte og kanskje ikke være en nøyaktig representasjon av det mikrobielle samfunnet. Til slutt er det også viktig at prøver holdes på is etter innsamling, spesielt hvis et konserveringsmiddel ikke brukes.
Selv om denne protokollen dekker både metatranscriptomics og 16S labprotokoller, bør det understrekes at disse to metodene er svært forskjellige i både prosessen og i typen data de gir. 16S rRNA-genet er en ofte målrettet region, høyt bevart i bakterier og arkaea, og nyttig for å karakterisere bakteriesamfunnet i en prøve. Selv om det er en målrettet og spesifikk tilnærming, er oppløsning på artsnivå ofte uoppnåelig, og karakterisering av nylig divergerte arter eller stammer er vanskelig. Derimot er metatranscriptomics en bredere tilnærming som fanger opp alle aktive gener og mikrober som er tilstede i en prøve. Mens 16S bare gir data for identifisering, kan metatranscriptomics gi funksjonelle data som uttrykte gener og metabolske veier. Begge er verdifulle, og når de kombineres, kan de avsløre hvilke bakterier som er til stede og hvilke gener de uttrykker.
Denne artikkelen beskriver metoder for feltinnsamling og prøvebehandling for både 16S rRNA og metatranskriptomiske analyser i sammenheng med studier av fracking. I tillegg beskriver den innsamlingsmetoder for DNA / RNA av høy kvalitet fra lave biomasseprøver og for langsiktig lagring. Metodene som er beskrevet her er kulminasjonen av våre erfaringer med prøveinnsamling og prosessering i vår innsats for å lære hvordan fracking påvirker nærliggende bekker gjennom å undersøke strukturen og funksjonen til deres mikrobielle samfunn. Mikrober reagerer raskt på forstyrrelser, og følgelig kan hvilke mikrober som er til stede og genene de uttrykker gi informasjon om effekten av fracking på økosystemer. Samlet sett kan disse metodene være uvurderlige i vår forståelse av hvordan fracking påvirker disse viktige økosystemene.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringskildene for prosjektene som førte til utviklingen av disse metodene, med disse kildene: Howard Hughes Medical Institute (http://www.hhmi.org) gjennom Precollege and Undergraduate Science Education Program, samt av National Science Foundation (http://www.nsf.gov) gjennom NSF-priser DBI-1248096 og CBET-1805549.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 Proof Ethanol | Thermo Fisher Scientific | A4094 | 400 mL need to be added to Buffer PE (see Qiagen QIAQuck Gel Extraction kit protocol) and 96 mL needs to be added to the DNA/RNA Wash Buffer (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol). Additional ethanol is needed for the ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep and NEBNext® Ultra™ II RNA Library Prep with Sample Purification Beads kits. |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | BP1356-100 | 100 g per bottle. 0.6 g of agarose would be needed to make one 2% 30 mL gel. |
| Disinfecting Bleach | Walmart (Clorox) | No catalog number | Use a 10% bleach solution for cleaning the work area before and after lab procedures |
| DNA gel loading dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Each user-made (i.e. non-e-gel) should include loading dye with all of the samples in the ratio of 1 µL dye to 5 µL sample |
| DNA ladder | MilliporeSigma | D3937-1VL | A ladder should be run on every gel/e-gel |
| DNA/RNA Shield (2x) | Zymo Research | R1200-125 | 3 mL per sediment sample (50 mL conical) and 2 mL per water sample (filter) |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302-10 | Used for staining user-made e-gels |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-06 | 0.5 µL per PCR reaction |
| Isopropanol | MilliporeSigma | 563935-1L | Generally less than 2 mL per library. Volume needed varies by mass of excised gel fragment (see Qiagen QIAQuick Gel Extraction kit protocol). |
| PCR-grade water | MilliporeSigma | 3315932001 | 13 µL per PCR reaction (assuming 1 µL of sample DNA template is used) |
| Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) | Thermo Fisher Scientific | 13000012 | 10 µL per PCR reaction |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | 51-01-19-07 | 0.5 µL per PCR reaction |
| TBE Buffer (Tris-borate-EDTA) | Thermo Fisher Scientific | B52 | 1 L of 10x TBE buffer (30 mL of 1x TBE buffer would be needed to make one 30 mL gel) |
| 1 L bottle | Thermo Fisher Scientific | 02-893-4E | One needed per stream (the same bottle can be used for multiple streams if it is sterilized between uses) |
| 1.5 mL Microcentrifuge tubes | MilliporeSigma | BR780400-450EA | 5 microcentrifuge tubes are needed per DNA extraction and an additional 3 are needed to purify RNA (see ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit protocol) |
| 2% Agarose e-gel | Thermo Fisher Scientific | G401002 | Each gel can run 10 samples (so 9 with a PCR negative and 8 if the extraction negative is run on the same gel) |
| 50 mL Conicals | CellTreat | 229421 | 1 50 mL conical needed per sediment samples |
| 500 mL Beaker | MilliporeSigma | Z740580 | Only 1 needed (for flame sterilization) |
| Aluminum foil | Walmart (Reynolds KITCHEN) | No number | Aluminum foil can be folded and autoclaved. The part not exposed to the environment can then be used as a sterile, DNA and RNA free surface for processing filters (one folded piece per filter to avoid cross-contamination) |
| Autoclave | Gettinge | LSS 130 | Only one needed |
| Centrifuge | MilliporeSigma | EP5404000138-1EA | Only 1 needed |
| Cooler | ULINE | S-22567 | Just about any cooler can be used. This one is listed due to being made of foam, making it lighter and thus easier to take along for field sampling. |
| Disruptor Genie | Bio-Rad | 3591456 | Only one needed |
| Electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1664000EDU | Only 1 needed |
| Electrophoresis power supply | Bio-Rad | 1645050 | Only 1 needed |
| Freezer (-20 C) | K2 SCIENTIFIC | K204SDF | One needed to store DNA extracts |
| Freezer (-80 C) | K2 SCIENTIFIC | K205ULT | One needed to store RNA extracts |
| Gloves | Thermo Fisher Scientific | 19-020-352 | The catalog number is for Medium gloves. |
| Heat block | MilliporeSigma | Z741333-1EA | Only one needed |
| Lab burner | Sterlitech | 177200-00 | Only one needed |
| Laminar Flow Hood | AirClean Systems | AC624LFUV | Only 1 needed |
| Library purification kit | Qiagen | 28704 | One kit has enough for 50 reactions |
| Magnet Plate | Alpaqua | A001219 | Only one needed |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004061 | Only one needed |
| Micropipette (1000 µL volume) | Pipette.com | L-1000 | Only 1 needed |
| Micropipette (2 µL volume) | Pipette.com | L-2 | Only 1 needed |
| Micropipette (20 µL volume) | Pipette.com | L-20 | Only 1 needed |
| Micropipette (200 µL volume) | Pipette.com | L-200R | Only 1 needed |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep with Sample Purification Beads | New England BioLabs Inc. | E7775S | One kit has enough reagents for 24 samples. |
| Parafilm | MilliporeSigma | P7793-1EA | 2 1" x 1" squares are needed per filter |
| PCR Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | One tube needed per reaction |
| Pipette tips (for 1000 µL volume) | Pipette.com | LF-1000 | Pack of 576 tips |
| Pipette tips (for 20 µL volume) | Pipette.com | LF-20 | Pack of 960 tips |
| Pipette tips (for 200 µL volume) | Pipette.com | LF-250 | Pack of 960 tips |
| PowerWulf ZXR1+ computer cluster | PSSC Labs | No number | This is just an example of a supercomputer powerful enough to perform metatranscriptomics analysis in a timely manner. Only one needed. |
| Qubit fluorometer starter kit | Thermo Fisher Scientific | Q33239 | Comes with a Qubit 4 fluorometer, enough reagent for 100 DNA assays, and 500 Qubit tubes |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific | 14-357Q | Only one needed |
| Sterile blades | AD Surgical | A600-P10-0 | One needed per filter |
| Sterivex-GP Pressure Filter Unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | 1 filter needed per water sample |
| Thermocycler | Bio-Rad | 1861096 | Only one needed |
| Vise-grip | Irwin | 2078500 | Only one needed (for cracking open the filters) |
| Vortex-Genie 2 | MilliporeSigma | Z258415-1EA | Only 1 needed |
| WHIRL-PAK bags | ULINE | S-22729 | 1 needed per filter |
| ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2002 | One kit has enough reagents for 50 samples. |
References
- The process of unconventional natural gas production. US EPA. , Available from: https://www.epa.gov/uog/process-unconventional-natural-gas-production (2013).
- Brittingham, M. C., Maloney, K. O., Farag, A. M., Harper, D. D., Bowen, Z. H. Ecological risks of shale oil and gas development to wildlife, aquatic resources, and their habitats. Environmental Science & Technology. 48 (19), 11034-11047 (2014).
- McBroom, M., Thomas, T., Zhang, Y. Soil erosion and surface water quality impacts of natural gas development in East Texas, USA. Water. 4 (4), 944-958 (2012).
- Maloney, K. O., Weller, D. E. Anthropogenic disturbance, and streams: land use and land-use change affect stream ecosystems via multiple pathways. Freshwater Biology. 56 (3), 611-626 (2011).
- Meyer, J. L., et al. The contribution of headwater streams to biodiversity in river networks1. JAWRA Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 86-103 (2007).
- Alexander, R. B., Boyer, E. W., Smith, R. A., Schwarz, G. E., Moore, R. B. The role of headwater streams in downstream water quality. Journal of the American Water Resources Association. 43 (1), 41-59 (2007).
- Ulrich, N., et al. Response of aquatic bacterial communities to hydraulic fracturing in Northwestern Pennsylvania: A five-year study. Scientific Reports. 8 (1), 5683 (2018).
- Chen See, J. R., et al. Bacterial biomarkers of Marcellus shale activity in Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 9, 1697 (2018).
- Rausch, P., et al. Comparative analysis of amplicon and metagenomic sequencing methods reveals key features in the evolution of animal metaorganisms. Microbiome. 7 (1), 133 (2019).
- Louca, S., Doebeli, M., Parfrey, L. W. Correcting for 16S rRNA gene copy numbers in microbiome surveys remains an unsolved problem. Microbiome. 6 (1), 41 (2018).
- Trexler, R., et al. Assessing impacts of unconventional natural gas extraction on microbial communities in headwater stream ecosystems in Northwestern Pennsylvania. Frontiers in Microbiology. 5, 522 (2014).
- Mumford, A. C., et al. Shale gas development has limited effects on stream biology and geochemistry in a gradient-based, multiparameter study in Pennsylvania. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (7), 3670-3677 (2020).
- JoVE Core Biology DNA Isolation. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/cn/science-education/10814/dna-isolation (2020).
- Oxford Gene Technology DNA Storage and Quality. OGT. , Available from: https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality (2011).
- ThermoFisher SCIENTIFIC Technical Bulletin #159: Working with RNA. Thermoscientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/general-articles/working-with-rna.html (2020).
- QIAGEN AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/dna-rna-purification/multianalyte-and-virus/allprep-dnarna-mini-kit/#orderinginformation (2020).
- ZymoBIOMICS DNA/RNA Miniprep Kit. Zymo Research. , Available from: https://www.zymoresearch.com/products/zymobiomics-dna-rna-miniprep-kit (2020).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- 16S Illumina amplicon protocol: Earth microbiome project. Earth microbiome project. , Available from: https://earthmicrobiome.org/protocols-and-standards/16s/ (2018).
- Gel Purification: Binding, washing and eluting a sample | Protocol. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/v/5063/gel-purification (2020).
- New England Biolabs protocol for the use with NEBNext Poly(A) mRNA magnetic isolation module (E7490) and NEBNext Ultra II RNA library prep kit for Illumina (E7770, E7775). New England Biolabs. , Available from: https://www.neb.com/protocols/2017/03/04/protocol-for-use-with-purified-mrna-or-rrna-depleted-rna-and-nebnext-ultra-ii-rna-library-prep-ki (2020).
- Anderson, M. J. Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA). Wiley StatsRef: Statistics Reference Online. , 1-15 (2017).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).
