Method Article

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

DOI:

10.3791/62023

⸱

May 16th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un metodo raffinato di compensazione dei tessuti è stato sviluppato e applicato al cuore adulto del topo. Questo metodo è stato progettato per cancellare il tessuto cardiaco denso e autofluorescente, pur mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettata attribuita a una strategia genetica reporter.

Abstract

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Le malattie cardiovascolari sono la causa più diffusa di mortalità in tutto il mondo ed è spesso contrassegnata da una fibrosi cardiaca aumentata che può portare a una maggiore rigidità ventricolare con funzione cardiaca alterata. Questo aumento della fibrosi ventricolare cardiaca è dovuto all'attivazione di fibroblasti residenti, anche se il modo in cui queste cellule operano all'interno del cuore tridimensionale (3D), al basale o dopo l'attivazione, non è ben compreso. Per esaminare come i fibroblasti contribuiscono alle malattie cardiache e alle loro dinamiche nel cuore 3D, è stato sviluppato un raffinato metodo di pulizia e imaging dei tessuti basato su CLARITY che mostra fibroblasti cardiaci etichettati fluorescentmente all'interno dell'intero cuore del topo. I fibroblasti residenti nei tessuti sono stati geneticamente etichettati utilizzando topi reporter florescenti Rosa26-loxP-eGFP incrociati con il fibroblasto cardiaco che esprime la linea di knock-in Tcf21-MerCreMer. Questa tecnica è stata utilizzata per osservare la dinamica di localizzazione dei fibroblasti in tutto il ventricolo sinistro adulto nei topi sani e nei modelli fibrotici di topo di malattie cardiache. È interessante notare che, in un modello di lesione, sono stati osservati modelli unici di fibroblasti cardiaci nel cuore del topo ferito che seguiva bande di fibre avvolte nella direzione della contrattile. Nei modelli di lesioni ischemiche si è verificata la morte dei fibroblasti, seguita dal ripopolamento dalla zona di confine infarto. Collettivamente, questa raffinata tecnica di chiar chiaritura del tessuto cardiaco e il sistema di imaging digitalizzato consentono la visualizzazione 3D dei fibroblasti cardiaci nel cuore senza i limiti del fallimento della penetrazione degli anticorpi o problemi precedenti che circondano la fluorescenza persa a causa della lavorazione dei tessuti.

Introduction

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Sebbene i cardiomiociti costificheranno la più grande frazione di volume nel cuore, i fibroblasti cardiaci sono più abbondanti e sono coinvolti criticamente nella regolazione delle caratteristiche strutturali e riparatrici di base di questo organo. I fibroblasti cardiaci sono altamente mobili, meccanicamente reattivi e fenotipicamente variano a seconda dell'entità della loro attivazione. I fibroblasti cardiaci sono necessari per mantenere i normali livelli di matrice extracellulare (ECM), e una produzione troppo piccola o troppo di ECM da parte di queste cellule puòportare alla malattia 1,2,3. Data la loro importanza nella malattia, i fibroblasti cardiaci sono diventati un argomento di indagine sempre più importante verso l'identificazione di nuove strategie di trattamento, specialmente nel tentativo di limitare l'eccessiva fibrosi4,5,6,7. Al momento della lesione, i fibroblasti si attivano e si differenziano in un tipo di cellula più sintetica noto come miofibroblasto, che può essere proliferativo e secernore abbondante ECM, oltre ad avere un'attività contrattile che aiuta a rimodellare i ventricoli.

Mentre i fibroblasti cardiaci sono stati ampiamente valutati per le loro proprietà nelle colture 2D6,8,9,10, molto meno si comprende le loro proprietà e dinamiche nel cuore vivente 3D, sia al basale che con la stimolazione della malattia. Qui, è stato descritto un metodo raffinato per liberare il cuore del topo adulto mantenendo la fluorescenza dei fibroblasti etichettati con un sistema di reporter genetico Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. All'interno del cuore, Tcf21 è un marcatore relativamente specifico di fibroblasti quiescenti4. Dopo che il tamoxifene è stato somministrato per attivare la proteina MerCreMer induttiva, essenzialmente tutti i fibroblasti quiescenti esprimeranno permanentemente proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP) dal locus Rosa26, che consente il loro tracciamento in vivo.

Esistono numerosi protocolli di compensazione dei tessuti consolidati, alcuni dei quali sono stati applicati al cuore11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, molti dei reagenti utilizzati in diversi protocolli di compensazione dei tessuti sono stati trovati per spegnere i segnali di fluorescenza endogena18. Inoltre, il cuore adulto è difficile da cancellare a causa delle abbondanti proteine contenenti gruppo di eme che generano autofluorescenza19. Pertanto, l'obiettivo di questo protocollo era quello di preservare la fluorescenza marcatore fibroblasto con l'inibizione simultanea dell'autofluorescenza dell'eme nel cuore adulto ferito per una visualizzazione 3D ottimale in vivo12,13,14,16,17,20.

Studi precedenti che tentavano di esaminare il fibroblasto cardiaco in vivo impiegavano anticorpi perfusi per etichettare queste cellule, sebbene tali studi fossero limitati dalla penetrazione degli anticorpi e dalla strutturavascolare cardiaca 14,16,17,20. Sebbene Salamon et al. Questo protocollo di compensazione dei tessuti affina una miscela di protocolli precedenti basati sul metodo CLARITY (sistema solvente rigido ibrido con acrilammide (PEG) e PEGASOS (sistema solvente associato al polietilene glicole (PEG). Questo raffinato protocollo ha permesso un esame più robusto dei fibroblasti cardiaci nel cuore del topo al basale e di come rispondono a diversi tipi di lesioni. Il protocollo è semplice e riproducibile e aiuterà a caratterizzare il comportamento dei fibroblasti cardiaci in vivo.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti che coinvolgono topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Cincinnati Children's Hospital Medical Center. L'istituto è anche certificato AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). I topi sono stati eutanasiati tramite lussazione cervicale e ai topi sottoposti a procedure chirurgiche di sopravvivenza è stato somministrato sollievo dal dolore (vedi sotto). Tutti i metodi utilizzati per la gestione del dolore e l'eutanasia si basano sulle raccomandazioni del panel sull'eutanasia dell'American Veterinary Medical Association. Tutti i topi erano alloggiati in unità di biancheria da letto in pannocchie di mais con acqua e cibo disponibili in ogni momento. I topi erano ospitati 4 in una gabbia con lo stesso sesso. Per l'intervento chirurgico o la pulizia del tessuto illeso, è stato utilizzato un numero uguale di topi maschi e femmine di 6-8 settimane.

NOTA: Le condizioni chirurgiche sterili sono state mantenute in tutti gli interventi chirurgici. Il chirurgo si è trasformato in scrub puliti e un abito sterile e poi ha indossato copriscarpe e una rete per capelli. Il chirurgo ha quindi lavato le mani con clorexidina e indossato guanti chirurgici sterili. Il chirurgo è stato assistito da un tecnico che ha sedato, rasato e lavato il sito di incisione 3 volte ciascuno, alternando tra il 2% di gluconato di cloroesidina e il 70% di isopropanolo. I topi sono stati poi portati dal chirurgo e l'intervento chirurgico è stato eseguito. Tra gli animali, gli strumenti sono stati sterilizzati in uno sterilizzatore di perline.

1. Cre ricombinazione

  1. Attraversare topi Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) con topi Tcf21-MerCreMer (Figura 1A)6,21.
  2. Quando la prole di questa croce raggiunge le 6 settimane di età, somministrare un'iniezione intraperitoneale di 75 mg / kg di tamoxifene sciolto in olio di mais. 22 Somministrare questo tamoxifene due volte, distante 48 ore(figura 1B).
  3. Dopo le iniezioni di tamoxifene, mettere i topi a dieta di cibo tamoxifene (~ 0,4 g / kg di citrato di tamoxifene) per una settimana. Dopo una settimana di tamoxifene chow, riportare i topi a una normale dieta chow autoclavata per una settimana prima di eseguire un intervento chirurgico (Figura 1B). Designare un numero appropriato di topi (3 per condizione chirurgica) da iminare. Sacrifica questi topi e procedi al processo di compensazione delineato di seguito dopo una settimana di normale dieta chow.
  4. Dopo il regime di tamoxifene e la ricombinazione, eseguire un intervento chirurgico.

2. Modelli chirurgici

  1. Ischemia/riperfusione (I/R)23,24
    1. Anestetizzare i topi con gas isoflurane all'1,5% nell'aria ambiente in una scatola ventilata; radersi il petto e il collo con tosaerba elettriche, quindi strofinare le aree rasate con un tampone imbevuto di gluconato di clorexidina al 2%.
    2. Utilizzare unguento lacrimale artificiale per prevenire la secchezza durante l'intervento chirurgico posizionando un unguento sugli occhi dei topi sedati.
    3. Eseguire un taglio a metà collo utilizzando forbici chirurgiche per consentire la visualizzazione della trachea. Intubato con un catetere da 20 G posizionando il tubo di intubazione nella trachea e visualizzando il catetere tracheale attraverso l'incisione del collo centrale. Posizionare i topi su un ventilatore mentre sono sedati con gas isoflurane (1,5%) nell'aria della stanza.
    4. Fai un'incisione sotto l'arto anteriore sinistro con forbici chirurgiche e taglia i muscoli intercostali tra le costole 3 e 4. Stendere le nervature aperte utilizzando un riavvolgitore.
    5. Posizionare una piccola spugna imbevuta di soluzione salina tra il polmone e il cuore per evitare danni al polmone.
    6. Utilizzando un ago fishhook (6,5 mm, 3/8 c), legare l'arteria coronarica sinistra con un nodo di slittamento rilasciabile utilizzando 8-0 prolene.
    7. Rimuovere la spugna con le forcep.
    8. Sutura i muscoli intercostali chiusi con seta intrecciata 4-0 e una sutura continua mentre esternalizzano anche la fine dell'8-0 nodo di slittamento prolene.
    9. Chiudere le incisioni cutanee utilizzando adesivo di tessuto topico con l'estremità del nodo di scorrimento occluding sporgente.
    10. Dopo un'ora di occlusione, tirare l'estremità esterna del nodo di slittamento per rilasciare internamente l'occlusione dell'arteria coronarica, alleviando l'ischemia e causando una riperfusione.
    11. Somministrare 0,02 mL di una buprenorfina a rilascio prolungato da 1 mg/mL mediante iniezione subdermica (rilascio di 72 ore) come antidolorifico e posizionare i topi in una camera di incubazione ossigenata a 37 °C, separata dagli altri animali. Monitorare i topi almeno ogni 15 minuti fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia e sono in grado di mantenere una posizione sternale o seduta. Riportare i topi al loro alloggio regolare.
    12. Valutare gli animali per il dolore e l'angoscia per 48 ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare quotidianamente il sito di incisione fino a quando non sono completamente guariti.
    13. Osserva i topi per l'idratazione, il nutrimento e il benessere generale dopo l'intervento chirurgico fino al sacrificio.
  2. Infarto miocardico (MI)25,26,27
    1. Eseguire i passaggi da 2.1.1 a 2.1.7.
    2. Usa una sutura continua per chiudere i muscoli intercostali usando seta intrecciata 4-0.
    3. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando adesivo per tessuti topici.
    4. Eseguire i passaggi da 2.1.11 a 2.1.13.
  3. Infusione di pompa micro-osmotica angiotensina II/fenilefrina
    1. Preparare Preparare una soluzione di lavoro di 10 μg/μL di angiotensina II e 500 μg/μL di soluzione di lavoro di fenilefrina in condizioni sterili (cioè, in una cappa di flusso laminare) aggiungendo 1 mg di angiotensina II a 100 μL di salina tamponata di fosfato sterile (PBS) e 250 mg di fenilefrina cloridrato in 500 μL di PBS.
    2. Calcolare la diluizione di ogni soluzione di lavoro e il volume finale per erogare alla pompa micro-osmotica in base al peso del mouse.
      NOTA: Ad esempio, un topo da 20 g richiede 20 g x 14 giorni x 1,5 μg/giorno = 420 μg di angiotensina, o 42 μL di soluzione di lavoro, nonché 20 g x 14 giorni x 50 μg/giorno = 14000 μg di cloridrato di fenilefrina o 28 μL di soluzione di lavoro.
    3. Per il peso di ciascun topo, diluire il materiale di lavoro del farmaco in PBS sterile e riempire le pompe micro-osmotiche (0,25 μL/h, 14 giorni, circa 100 μL) utilizzando un ago da 27 G e una siringa da 1 ml.
      NOTA: Questo genererà una portata di 1,5 μg-g-1-giorno-1 di angiotensina II e 50 μg-g-1-giorno-1 di cloridrato di fenilefrina una volta posto nei topi.
    4. Anestetizzare i topi con l'1,5% di inalazione di isoflurane (a effetto) in una camera ventilata contenente aria ambiente.
    5. Posizionare i topi anestetizzati su una tavola chirurgica sterile in posizione opina e mantenere l'anestesia con inalazione di gas isoflurane (1,5%) attraverso un cono del naso.
    6. Usa un unguento lacrimale artificiale sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'intervento chirurgico.
    7. Radere la pelliccia sopra l'area di impianto con tosaerba elettriche e sterilizzare l'area da tagliare usando etanolo e un tampone sterile. Fare una piccola incisione (circa 1 cm) con forbici chirurgiche nello strato epidermico della pelle del topo sul lato laterale destro della schiena, sotto la scapola. Utilizzare i lati opachi di un paio di forbici chirurgiche per allungare delicatamente la pelle all'interno e intorno all'area dell'impianto per inserire la minipompa.
    8. Posizionare la pompa micro-osmotica all'interno dell'incisione e manovrarla fisicamente a sinistra della linea mediana dorsale del mouse massaggiando manualmente la pompa sotto la pelle.
    9. Chiudere l'incisione tramite sutura continua utilizzando seta 4-0 con un ago a punta di cono.
    10. Dopo l'impianto della pompa, somministrare buprenorfina a lento rilascio a una dose di 0,1 mg /kg di peso corporeo tramite iniezione subdermica per l'analgesia (rilascio lento di 72 ore). Posizionare i topi in una camera di incubazione ossigenata a 37 °C, separati dagli altri animali. Monitorare i topi almeno ogni 15 minuti fino a quando non si riprendono dall'anestesia e possono mantenere una posizione sternale o seduta.
    11. Al momento del recupero dall'anestesia nella camera riscaldante a 37 °C, riposizionare i topi nelle loro unità abitative standard.
    12. Monitorare i topi per il dolore e l'angoscia per 48 ore dopo l'intervento chirurgico e monitorare quotidianamente il sito di incisione fino a quando non è completamente guarito.
    13. Osserva i topi per l'idratazione, il nutrimento e il benessere generale dopo l'intervento chirurgico fino al sacrificio.

3. Cancellare i cuori dei topi adulti utilizzando un protocollo CLARITY attivo modificato

  1. Preparare un'area chirurgica pulita sterilizzando la superficie chirurgica e tutti gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo. Preparare una soluzione di PBS freddo 1x e 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (100 mL ciascuno). Indossare guanti, camice da laboratorio, maschera per il viso e protezione degli occhi.
  2. Preparare il tampone di eparina diluire 10 unità di eparina in soluzione di cloruro di sodio dello 0,9%. Iniettare ogni topo per via intraperitoneale con 60 μL di eparina-NaCl utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 27 G.
  3. Cinque minuti dopo l'iniezione di soluzione di eparina-NaCl, anestetizzare i topi usando l'1,5% di inalazione di isoflurane (a effetto) in una camera ventilata contenente aria ambiente.
  4. Eutanasia i topi per lussazione cervicale, in cui la parte posteriore della testa è tenuta con l'estremità piatta e chiusa delle forcep, mentre la colonna vertebrale viene lussata tirando la coda.
  5. Pulire la superficie ventrale del mouse con il 70% di etanolo su un batuffolo di cotone. Fai un'incisione trasversale di 3 cm circa 3 cm sotto il processo xifoide usando forbici chirurgiche.
  6. Separare la pelle dal tessuto della parete addominale sottostante deglogando l'addome fino al processo xifoide (tenere la pelle più vicina alla coda e tirare la pelle più vicina alla testa verso la gabbia toracica). Fai un'incisione trasversale di 2 cm nel tessuto della parete addominale sottocutanea 3 cm sotto il processo xifoide usando forbici chirurgiche. Fai un taglio verticale da questa incisione trasversale, su per la linea mediana e attraverso la gabbia toracica. Pin la gabbia toracica indietro, esponendo il cuore.
  7. Utilizzare un ago da 27 G e una siringa da 10 ml per iniettare PBS freddo nella vena cava superiore e nell'aorta (qualsiasi manipolazione posizionale del cuore deve essere eseguita con attenzione con pinzette smussate per evitare foratura) per liberare il sangue dal cuore.
    NOTA: Una perfusione sufficiente può essere notata dalla contrazione della coda e dallo scolorimento dei polmoni.
  8. Utilizzare un ago da 27 G e una siringa da 10 ml per iniettare freddo 4% di PFA nella vena cava e nell'aorta superiori per iniziare il processo di fissazione.
  9. Asporta i cuori. L'atri, il ventricolo destro e il setto e il ventricolo sinistro devono essere separati usando un bisturi a lama dritta. Mettere questo tessuto in un tubo di centrifuga da 15 ml riempito con PFA freddo al 4% e posizionare su un nutator a 4 °C durante la notte.
  10. Lavare il cuore 3 volte per 1 h ciascuno con PBS freddo 1x per rimuovere la PFA in eccesso.
  11. Preparare l'idrogel (chiamato A4P0 per la composizione relativa di acrilammide/poliacrilammide) mescolando le seguenti sostanze chimiche in un tubo di centrifuga da 15 ml: 10% di acrilammide 40%, 10% 1x PBS, 80% acqua distillata.
  12. Aggiungere la soluzione allo 0,25% del fotoiniziolatore (2,2-Azobis[2-(2-imidazolina-2il)propano)diidrocloruro) alla soluzione di idrogel poco prima di immergere il cuore nell'idrogel.
  13. Posizionare il cuore in un tubo conico contenente l'idrogel. Avvolgere il tubo conico in un foglio e incubare durante la notte a 4 °C senza disturbi fisici.
  14. Dopo circa 14 ore a 4 °C, spostare il tubo conico contenente il cuore in un bagno di perline a 37 °C.
  15. Dopo 2,5 ore nel bagno di perline, rimuovere il cuore dall'idrogel con attenzione con le forcep.
  16. Lavare i cuori 3 volte per 1 h ciascuno in un tubo conico da 15 ml contenente 1x PBS a 37 °C su un nutator.
  17. Posizionare i cuori nel cestello della macchina per elettroforesi attiva utilizzando le forcep e posizionare il coperchio sul cestello. Assicurarsi che il coperchio sia saldamente in posizione.
  18. Riempire il serbatoio attivo della camera di elettroforesi con soluzione di compensazione elettroforetica versando la soluzione nella camera.
  19. Una volta che la camera è piena di soluzione di compensazione elettroforetica, il cestello contenente il cuore può essere sommerso. Posizionare il tappo sulla macchina per elettroforesi in modo sicuro.
  20. Eseguire la macchina per elettroforesi a 1,5 A, 37 °C per 1,5 ore.
  21. Dopo 1,5 ore di elettroforesi, controllare visivamente i cuori per assicurarsi che non rimanga tessuto opaco. Se le regioni del tessuto sono ancora opache, immergere di nuovo il cuore in soluzione di elettroforesi nella camera elettroforetica e continuare l'elettroforesi per 0,5 ore alla volta.
    NOTA: L'elettroforesi deve essere interrotta ai primi segni di danno tissutale (come lo sfilacciamento dei tessuti).
  22. Lavare i cuori in un tubo conico da 15 ml contenente 1 PBS per 1 h, 3 volte ciascuno, a 37 °C su un nutator.
  23. Immergere i cuori in un tubo conico da 15 ml contenente N,N,N′,N′-Tetrakis(2-idrossipropil)etilendiammina- un agente decolorante che riduce l'autofluorescenza dell'eme.
    NOTA: Questa soluzione deve essere cambiata ogni 24 ore fino a quando i cuori non sono completamente chiari (circa 2 giorni).
  24. Lavare i cuori in un tubo conico da 15 ml con 1x PBS 3 volte per 1 h ciascuno per rimuovere l'agente decolorante in eccesso.
  25. Preparare la soluzione rims (Refractive Index Matching Solution) combinando 30 mL di tampone fosfato da 0,02 M, 40 g di 5-(N-2, 3-diidrossipropilacetamido)-2, 4, 6-tri-iodo-N, N'-bis (2, 3 diidrossipropil) isoftalamomide con agitazione (deve essere completamente sciolto — questo può richiedere fino a un'ora), 5 mg di azide di sodio, 50 μL di Tween20 e 1 g di 1,4-diazabiciclo[2.2.2]ottano, e regolare il pH a 7,5.
  26. Equilibrare i cuori in RIMS per 48 ore prima dell'imaging.

4. Imaging di cuori chiari utilizzando un microscopio confocale singolo fotone verticale

NOTA: L'apparecchio di imaging è costituito dalla metà inferiore di una piastra di Petri in vetro da 10 cm, da un serbatoio inferiore stampato in 3D, da un coverslip rotondo in vetro e da un serbatoio superiore stampato in 3D(Figura 1C-E). I materiali stampati in 3D sono stati realizzati internamente dal Cincinnati Children's Hospital Clinical Engineering Department.

  1. Utilizzare il grasso sottovuoto per sigillare il serbatoio inferiore stampato in 3D in una piastra di Petri in vetro mettendo un sottile strato di grasso sottovuoto sul fondo del pezzo stampato in 3D(Figura 1C).
    NOTA: Il serbatoio deve avere la stessa altezza del campione che viene immaginato (cioè, il campione non deve essere compresso dal coperchio di vetro posto sopra di esso e anche il campione non dovrebbe essere in grado di galleggiare e muoversi all'interno del serbatoio).
  2. Riempire il serbatoio con RIMS e rimuovere tutte le bolle con una punta di pipetta. Posizionare il cuore nel RIMS con cura con la parete ventricolare sinistra rivolta verso l'alto, assicurando che non siano introdotte bolle nella soluzione.
  3. Aderire a una coverlip di vetro alla superficie inferiore del pezzo del serbatoio superiore stampato in 3D (Figura supplementare 1A) utilizzando grasso sottovuoto (ancora una volta posizionando un sottile strato di grasso sottovuoto sul pezzo stampato in 3D e posizionandolo sullo scivolo di copertura)(Figura 1D).
  4. Posizionare il coperchio in vetro e il serbatoio superiore, lato coverslip verso il basso, sul serbatoio inferiore (Figura supplementare 1B), senza l'introduzione di bolle. L'adesione tra il RIMS e lo slittamento del coperchio fornirà una tenuta tra i pezzi del serbatoio superiore e inferiore(Figura 1E).
  5. Riempire il serbatoio superiore con glicerolo per l'uso con un obiettivo di immersione in glicerolo 10x.
  6. Usa un singolo microscopio fotone dotato di una testa di scansione confocale multifoton per immagini i cuori chiari.
  7. Abbassare lo stadio del microscopio singolo fotone e posizionare la piastra di Petri contenente il campione al centro dello stadio. Sollevare lo stadio e abbassare l'obiettivo di immersione del glicerolo 10x nel glicerolo nel serbatoio superiore dell'apparato campione. Assicurarsi che il campione sia a fuoco osservando il bordo del campione utilizzando gli oculari.
  8. Passare dalla vista oculare alla visualizzazione della fotocamera sul computer facendo clic sul pulsante live.
    1. Impostare i parametri X e Y individuando prima la parte più ampia del campione di tessuto, che dovrebbe essere nella parte inferiore della piastra di Petri.
    2. Fare clic su Acquisizione ND e multipunto personalizzato. Creare più punti trovando prima il centro del campione di tessuto utilizzando il joystick per spazzare da sinistra a destra e dall'alto verso il basso.
    3. Quindi, in base alle dimensioni del tessuto, determinare la dimensione di piastrellatura necessaria (in genere 6 x 5 per un cuore di topo di 6-8 settimane). Eseguire l'imaging di prova acquisendo solo i parametri X e Y (deselezionare z nella scheda Acquisizione ND) per verificare se l'intera lunghezza e larghezza del tessuto sono state catturate.
  9. Per impostare i parametri z, aprire la navigazione XYZe fare clic sulle icone su e giù fino a trovare la parte superiore e inferiore dell'esempio.
    1. Aprite il pannello di correzione dell'intensità Z e regolate la fluorescenza nella parte superiore, centrale e inferiore del tessuto per correggere la densità dei tessuti aumentando o diminuendo la potenza del laser in ogni punto z. Impostate questi clic sulla freccia impostata a destra del pannello Correzione intensità Z.
    2. Impostate la dimensione del passo Z nel pannello Acquisizione ND su 5 μm.
  10. Dopo aver delineato i parametri X, Y e Z del cuore e impostare la correzione dell'intensità Z, utilizzare il microscopio verticale automatico con un obiettivo di immersione del glicerolo 10x con uno scanner risonante e tubi fotomoltiplicatori di fosfuro di arseniuro di gallio (PMT GaAsP) per immaginire i cuori chiari. Assicurarsi che le schede XY e Z siano selezionate in Acquisizione ND epremere Esegui correzione Z.
  11. Cucire, unmix e denoizzare le immagini risultanti aprendo l'immagine multipunto nel software di elaborazione e facendo clic sul pulsante di punto. In immaginefare clic su unmixing cieco, 2 canalie quindi trovare. e Sotto immagine, fare clic denoise.ai,quindi fare clic sul canale fluorescente preferito (ad esempio, GFP).
    NOTA: Questo processo si traduce in un'immagine 3D di fibroblasti positivi alla GFP nell'intero ventricolo sinistro.
  12. Utilizzare un software di analisi secondaria per identificare ulteriormente modelli e tendenze nella dispersione dei fibroblasti cardiaci. Utilizzare la funzione Spots eseguendo il programma di creazione guidata spot.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I fibroblasti cardiaci sono essenziali per la funzione basale del cuore e per la risposta a lesioni cardiache. Precedenti tentativi di comprendere la disposizione e la morfologia di queste cellule sono stati condotti in gran parte in ambienti 2D. Tuttavia, è stata pubblicata una raffinataschiaritura deitessuti cardiaci ( Figura 2 ) e una tecnica di imaging 3D, che consente una visualizzazione avanzata e più dettagliata dei fibroblasti cardiaci. Con questa tecnica di imaging, i fibroblasti so...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo presenta un metodo raffinato per la pulizia dei tessuti che consente la visualizzazione di fibroblasti cardiaci in vivo, sia al basale che a seguito di lesioni, per caratterizzare e comprendere meglio i fibroblasti nel cuore del topo. Questo protocollo avanzato affronta le limitazioni nei protocolli di compensazione dei tessuti esistenti che hanno tentato di identificare tipi di cellule specifiche nel cuore adulto o neonatale12,13,

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno informazioni relative al contenuto di questo manoscritto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori vorrebbero riconoscere il CCHMC Confocal Imaging Core per la loro assistenza e guida nello sviluppo di questo modello, nonché Matt Batie di Clinical Engineering per la progettazione di tutte le parti stampate in 3D. Demetria Fischesser è stata sostenuta da una borsa di formazione del National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204) e Jeffery D. Molkentin è stata sostenuta dall'Howard Hughes Medical Institute.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-0 seta intrecciataEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40% soluzione di acrilammideBio-Rad1610140
Angiotensin IISigmaA9525-50G
unguento lacrimale artificialeCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabiciclo[2.2. 2]ottano)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture adesivo topico per tessutiPrecision Instruments503763
EparinaSigmaH0777
Imaris Start Software di analisiOxford InstrumentsN/A Pompe
microosmoticheAlzetModello 1002
Nikon Software di analisi degli elementiNikonN/A
Nikon A1R HDNikonN/A
Normale chow autoclavatoLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-diidrossipropilacetammido)-2, 4, 6-tri-iodo-N,
N'-bis (2, 3 diidrossipropil) isoftalamide		CosmoBioAXS-1002424
ParaformaldeideMicroscopia elettronica Scienze15710
Fenilefrina cloridratoSigmaP6126-10G
fotoiniziatoreWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Codice 012429
Azide di sodioSigma AldrichS2002-5G
Soluzione di cloruro di sodioHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoxifeneSigma AldrichT5648
Tamoxifene ciboEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Idrossipropil)etilendiammina, agente decoloranteMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity camera di pulizia per elettroforesiLogos BiosystemsC30001
Soluzione per pulizia elettroforetica X-ClarityLogos BiosystemsC13001
Cestello per elettroforesi X-ClarityLogos BiosystemsC12001
X-Clarity Portasalviette per elettroforesiLogos BiosystemsC12002
World microscopio verticale

References

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