Un modello murino di ommaya xenotrapianto per studiare la terapia mirata diretta della malattia leptomeningea

La malattia leptomeningea (LMD) è una metastasi aggressiva in fase avanzata del SNC, in cui le cellule tumorali accedono al CSF e si infiltrano nella superficie del cervello e del midollo spinale¹. I tumori più comuni che causano LMD includono quelli del seno e del polmone e il melanoma². LMD provoca una serie di sintomi e segni neurologici come mal di testa, paralisi del nervo cranico, torcicollo e radicolopatie. La prognosi per i pazienti con LMD è generalmente molto sfavorevole (la sopravvivenza media è misurata in settimane) ed è universalmente fatale^3,4,5,6,7. Il trattamento con chirurgia, radiazioni e chemioterapia sistemica è palliativo. La terapia sistemica per LMD può fallire a causa di una penetrazione inadeguata del farmaco nel CSF attraverso una barriera BBB o Emato-CSF intatta attraverso il plesso coroideo^1.

Pertanto, la somministrazione di terapie antitumorali (ad esempio, farmaci e trattamenti a base di anticorpi, inclusi inibitori del checkpoint e terapie cellulari) direttamente nel CSF può superare questa limitazione⁸. L'accesso e il campionamento del liquido cerebrospinale dai pazienti è possibile attraverso un serbatoio Ommaya che viene impiantato sotto il cuoio capelluto. Questo dispositivo consente la somministrazione di agenti cancerogeni (ad esempio, metotrexato e trastuzumab) e il campionamento del CSF per studi diagnostici (ad esempio, la diagnosi citologica di LMD per monitorare le risposte al trattamento) senza eseguire un rubinetto spinale. Un serbatoio murino di Ommaya è stato progettato per imitare quelli usati clinicamente. Il serbatoio richiede l'assemblaggio di una porta di accesso e di parti distanziali e una modifica della tecnica di cannulazione del mouse, che consente al dispositivo di rimanere permanentemente intatto per tutta la durata dello studio del farmaco. Questo dispositivo è stato designato come "Murine Ommaya".

A differenza della tecnica della pompa per infusione osmotica, che richiede la preparazione di volumi liquidi in eccesso per preriempire lo spazio vuoto nel tubo e l'infusione continua su iniezioni frequenti⁹, il Murine Ommaya riduce al minimo lo spreco di soluzioni farmacologiche. Consente la somministrazione efficace di più dosi singole di trattamenti in qualsiasi momento in piccole quantità (3-7 μL) nel CSF utilizzando una siringa Hamilton, una porta di accesso in miniatura e un iniettore automatico. In tempo reale, l'efficacia dei farmaci di prova contro LMD può essere determinata dall'imaging. Utilizzando questo approccio, una varietà di chemioterapie, anticorpi e immunoterapie cellulari (come agenti singoli o combinati) possono essere testati contro LMD per tradurre i risultati in vivo in strategie di trattamento razionali per i pazienti. Per migliorare ulteriormente la capacità di imaging per un modello di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) di LMD, è stata intrapresa una collaborazione con un produttore per sviluppare una versione compatibile con la risonanza magnetica (MRI) di Murine Ommaya, che non richiede assemblaggio ed è pronta per l'uso. La capacità di risonanza magnetica è vantaggiosa, specialmente per i modelli PDX in cui la quantità di cellule tumorali circolanti (CTC) dal CSF è talvolta il fattore limitante, e spesso quando la preetichettatura delle CTC è impossibile.

Questo documento descrive un protocollo dettagliato che inizia con l'iniezione di CTC per rendere i topi con LMD . Il Murine Ommaya viene quindi impiantato chirurgicamente e vengono eseguite più fasi di trattamento farmacologico tramite murine Ommaya. Come prova di concetto per la dimostrazione, è stato eseguito un confronto in vivo side-by-side, in cui è stato consegnato l'anticorpo murino del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (Her2) chiamato clone 7.16.4 (l'equivalente umano di trastuzumab)¹⁰. L'anticorpo prende di mira le cellule del cancro al seno Her2⁺ tramite Murine Ommaya (terapia diretta o intratecale) o mediante iniezione intraperitoneale (terapia sistemica). I risultati hanno mostrato che i topi con LMD che hanno ricevuto l'immunoterapia intratecale diretta hanno vissuto significativamente più a lungo di quelli trattati con la stessa terapia per via sistemica. Le metastasi del SNC nei topi trattati tramite Murine Ommaya sono state quasi completamente regredite dalla terza dose della terza settimana di trattamento, con conseguente miglioramento della sopravvivenza globale.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della University of South Florida (IS00005974).

1. Iniezione di CTC in CSF per generare un modello LMD murino

1. Preparazione dei CTC
   1. Calcolare il numero di CTC necessari per l'iniezione e preparare una sospensione unicellulare a 1,0 ×^{10 4} cellule / μL in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Posizionare la sospensione cellulare su ghiaccio o a 4 °C durante tutta la procedura.
      NOTA: quando si utilizzano linee cellulari che richiedono tripsinizzazione, assicurarsi di lavare le cellule due volte con PBS sterile per rimuovere la tripsina. Eseguire il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Se viene utilizzata una coorte di grandi dimensioni (>50 topi), riconteggi le cellule e convalida la vitalità cellulare tra le iniezioni per garantire che venga somministrato un numero coerente di cellule per topo.
2. Procedura prechirurgica
   1. Inietti il topo per via sottocutanea con 1 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Bup-SR).
      NOTA: Non iniettare l'area dell'incisione proposta; scegliere un sito di iniezione ben lontano dalla scapola.
   2. Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non mostra segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia.
   3. Preparare il mouse per l'intervento chirurgico in un luogo lontano dall'area operatoria. Tagliare il sito chirurgico (cioè la superficie dorsale del cranio) con un'area di confine sufficiente per evitare che la pelliccia contamini il sito di incisione; quindi, saturare il sito con antisettico della pelle germicida, lavorando dal centro del sito alla periferia, quindi lasciare asciugare. Applicare un drappo sterile o un telo di plastica sterile con supporto adesivo per proteggere il sito chirurgico dalla contaminazione.
      NOTA: gli strumenti devono essere autoclavati in anticipo e le punte risterizzate tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore per perle di vetro.
   4. Radere la pelliccia dell'intera superficie ventrale della testa e preparare la pelle usando la tecnica sterile.
   5. Situare il naso con un cono nasale a forma di L modificato dell'apparato stereotassico, assicurando che le narici rimangano chiare e aperte. Usando del nastro adesivo sulle superfici ventrali di entrambe le penne, tirare delicatamente la pelle in avanti per fissarla al cono del naso e piegare il collo con un angolo di circa 90 ° una volta fissato. Somministrare l'1,5% di isoflurano per mantenere l'anestesia.
      NOTA: Il corretto posizionamento comporterà la presentazione dell'area dell'incisione in modo da consentire la facile identificazione della cresta caudale dell'osso occipitale.
   6. Posizionare il corpo per garantire che la colonna vertebrale sia mantenuta a livello con la cisterna magna e, mentre si applica una leggera trazione alla coda, posizionare del nastro adesivo alla base della coda per fissarlo.
3. Iniezione chirurgica di cisterna magna
   1. Con il collo in piena estensione, e iniziando proprio tra le penne, eseguire le punte chirurgiche a forbice verso il basso con una leggera pressione attraverso l'osso occipitale.
      NOTA: Mentre si è in questa posizione della linea mediana, una piccola depressione è evidente quando le punte delle forbici si ispirano nell'area concava sopra la cisterna magna.
   2. Fai una piccola incisione della linea mediana di 3-5 mm appena sopra la concavità palpata. Aspirare 5 μL di sospensione cellulare a 1,0 ×^{10 4} celle/μL (totale 5,0 ×^{10 4} cellule) in una siringa Hamilton da 30 G.
   3. Utilizzare pinca a punta smussata con punte da 1-2 mm per premere delicatamente sulla cisterna magna. Introdurre le punte in posizione chiusa e aprirle mentre si applica una pressione verso il basso sulla dura.
   4. Ripetere la dissezione smussata descritta nel passaggio precedente fino a quando la membrana durale è facilmente identificabile e i vasi sanguigni associati sono visibili nell'area esposta.
      NOTA: La finestra di iniezione risultante assicura che i vasi sanguigni non siano danneggiati durante l'inserimento dell'ago.
   5. Tenendo la pinna aperta per ritrarre la muscolatura circostante, introdurre un ago non carotaggio da 30 G sotto la dura per visualizzare la smussatura. Assicurarsi che l'ago sia introdotto solo appena oltre la smussatura stessa. Distribuire lentamente uno stantuffo a siringa e consegnare le celle appena sotto la dura.
   6. Posizionare correttamente la smussatura per osservare l'iniezione sotto la dura. Somministrare con attenzione la tecnica e utilizzare l'ago non carotaggio da 30 G per evitare danni alla membrana e garantire perdite minime. Se si nota una perdita, applicare una leggera pressione con un applicatore con punta di cotone.
   7. Chiudere la pelle applicando una clip per ferite o una micro-goccia di adesivo per la pelle. Una volta eseguita con successo l'iniezione, consentire ai topi di riprendersi dall'anestesia su una coperta calda, osservandoli continuamente fino a quando non possono mantenere la posizione sternale e dimostrare un movimento pronostico.
   8. Monitorare i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico per la prima settimana. Se un topo sembra essere in difficoltà o dolore, trattarlo con 10 mg / kg di iniezione sottocutanea di carprofene una volta ogni 12-24 ore per un massimo di 5 giorni in base alla consultazione veterinaria e alla direttiva. Consentire ai topi di recuperarli e monitorarli per almeno 48-72 ore prima di procedere al passaggio successivo.
      NOTA: Bup-SR, somministrato preventivamente, durerà fino a 72 ore, quindi normalmente non sono necessari analgesici aggiuntivi. Tuttavia, agli animali verrà fornito un analgesico aggiuntivo se necessario (se letargico, non mangiando, arruffato). Se un sito chirurgico sviluppa segni di infezione postoperatoria (cioè arrossamento, gonfiore, tenerezza, allodinia, iperalgesia, iperpatia o suppurazione), o se il topo sta proteggendo l'area interessata, eutanasia il topo. Se le cellule tumorali vengono iniettate con successo nel CSF, LMD e la progressione tumorale si svilupperanno nel SNC entro 1 o 2 settimane (a seconda dei tipi di CTC o della linea cellulare utilizzata) (Figura 1).

2. Assemblaggio e impianto murino Ommaya

1. Preparazione della stazione
   1. Disinfettare la superficie della stazione. Posizionare una copertura blu sulla superficie e tenere pronti tutti gli strumenti e le forniture sterilizzate indicati nella Figura 2.
2. Procedura prechirurgica
   1. Applicare analgesia (Bup-SR) e mantenere la tecnica sterile come descritto al paragrafo 1.2.
3. Impianto chirurgico di Murine Ommaya
   1. Assemblare il dispositivo di iniezione Murine Ommaya utilizzando una porta di iniezione miniatura da 25 G (0,51 mm di diametro esterno) e un disco distanziatore da 1 mm. Utilizzare un adesivo sterile cianoacrilato per garantire la penetrazione di circa 2,5 mm della cannula metallica nell'emisfero cerebrale destro (Figura 3A-C).
      NOTA: Un prototipo di Mouse Ommaya compatibile con la risonanza magnetica è stato sviluppato in questo laboratorio, che ha già entrambe le parti (porta di iniezione in miniatura e distanziatore) stampate in 3D insieme come una singola unità(Figura 3D). La versione a singola unità è stata testata mediante risonanza magnetica e può far risparmiare tempo eliminando la fase di assemblaggio.
   2. Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano fino a quando non ci sono segni del riflesso di raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare lo stato di anestesia.
   3. Radere l'intera superficie ventrale della testa di pelliccia e preparare la pelle secondo la tecnica sterile, come precedentemente descritto al punto 1.2.3. Posizionare il topo nell'apparato stereotassico con un cono nasale per continuare la somministrazione di isoflurano durante la procedura; diminuire l'isoflurano all'1,5%. Stringere delicatamente le barre auricolari per fissare la testa e applicare lubrificante per gli occhi per coprire gli occhi del mouse.
   4. Fare una piccola incisione cutanea (3 mm), seguita da una dissezione smussata dei tessuti sottocutanei sottostanti per esporre il cranio. Asciugare il cranio usando bastoncini applicatori con punta di cotone imbevuti di perossido di idrogeno.
   5. Praticare un foro di bava nel cranio posteriore di 0,5 mm e laterale di 1,1 mm del bregma - il punto anatomico sul cranio in cui la sutura coronale è intersecata perpendicolarmente dalla sutura sagittale (Figura 3A) - così come un foro di sbavatura di 0,9 mm per esporre la dura madre. Spostare il microdrill da parte e segnare delicatamente l'osso immediatamente circostante il foro della bava prima di inserire una porta di iniezione (profondità di circa 2,5 mm), fissata al cranio utilizzando un adesivo sterile cianoacrilato. Sutura di stato attorno al punto di iniezione utilizzando 4-0 suture di nylon senza assorbimento in un modello di punto interrotto o sutura di corda della borsa¹¹.
   6. Casa topi post-chirurgici in gabbie individuali per il recupero chirurgico.
      NOTA: È possibile che l'Ommaya murino possa staccarsi quando più topi recuperati dall'intervento chirurgico sono alloggiati nella stessa gabbia, probabilmente a causa di costanti interazioni di manomissione. Si raccomanda che i topi impiantati da Murine Ommaya siano alloggiati individualmente (o non più di 2 topi per gabbia) nel corso dello studio sull'efficacia del farmaco.

3. Trattamento Murine Ommaya

1. Dosaggio di topi con Murine Ommaya
   1. Anestetizzare il mouse con il 2-3% di isoflurano, fino a quando non ci sono segni di riflesso raddrizzamento. Inoltre, controllare il riflesso del pizzico della coda e / o della zampa per confermare il mantenimento dell'anestesia.
   2. Accedere a Murine Ommaya utilizzando un adattatore per iniezione della porta e una siringa Hamilton. Utilizzando la pinna, tenere la parte superiore della porta di iniezione in miniatura e inserire delicatamente l'adattatore dell'iniettore della porta completamente nel setto della porta.
      NOTA: l'iniettore della porta perfora il setto della porta in modo da ridurre al minimo lo spazio morto e consentire l'iniezione controllata tramite una pompa a siringa motorizzata (Figura 4A). I trattamenti mirati/nuovi vengono iniettati ad una portata di 1 μL/min durante l'anestesia. Il trattamento deve essere somministrato a intervalli specificati (giornaliero / settimanale) per una durata prestabilita (settimane / mesi), a discrezione del ricercatore.
      Un volume compreso tra 3 e 7 μL è ottimale, poiché un volume < 3 μL è inaffidabile e un volume > 7 μL può causare troppa pressione. La dimensione della siringa Hamilton può variare da 10 a 100 μL, a seconda del numero di topi in ciascun braccio di trattamento. Il precaricamento del volume appropriato nella siringa Hamilton impedirà la sostituzione ripetuta della siringa, riducendo così al minimo gli errori. È meglio dedicare 1 siringa Hamilton per braccio di trattamento.
   3. Una volta effettuata l'iniezione, staccare Murine Ommaya dall'adattatore per iniezione della porta usando una pinza e riportare il topo nella gabbia per riprendersi dall'anestesia, come descritto sopra nel passaggio 1.3.7.
2. Eutanasia
   1. Eutanasia dei topi per inalazione di anidride carbonica (CO₂₎da una fonte di serbatoio compresso. Esporre i topi a concentrazioni crescenti di CO₂ (cioè, deve essere utilizzato un tasso di spostamento dal 10% al 30% del volume / min della camera) per evitare o ridurre al minimo il disagio o l'angoscia. Monitorare i topi fino alla garanzia di cessazione dei movimenti cardiovascolari e respiratori.

Nei topi, il volume totale di CSF è di circa 35-40 μL ed è prodotto ad una velocità di circa 350 nL/min; gira 12-13 volte al giorno12. Allo scopo di visualizzare il percorso dell'iniezione, il 2% di Evans Blue è stato iniettato tramite il modello Murine Ommaya, a seguito del quale sono stati lasciati passare 15 minuti e 30 minuti prima di raccogliere il cervello per l'analisi. Il colorante si è infiltrato con successo nei ventricoli e nel cervello in 15 minuti. Entro 30 minuti, il colorante è diventato visibile sul midollo spinale (Figura 4).

Come prova di concetto, i topi BALB / c sono stati iniettati con una linea cellulare di cancro al seno Her2+ TUBO con etichetta luciferasi per via intracisternale e sono stati impiantati gli Ommay murini. Circa 1 settimana dopo l'iniezione di cellule tumorali, i topi hanno iniziato a sviluppare LMD. Questi topi sono stati trattati una volta alla settimana per un massimo di 4 settimane con l'immunoterapia con anticorpi Her2, sia attraverso la terapia sistemica tramite iniezione intraperitoneale o intratecale tramite Murine Ommaya (Figura 5A).

Sebbene i topi non trattati siano morti entro il giorno 19, tutti i topi che hanno ricevuto la terapia intratecale attraverso l'Ommaya murina sono sopravvissuti(P = 0,004). Entro la settimana 4, è stata osservata una completa regressione dei tumori. Rispetto ai topi trattati con terapia sistemica, che hanno avuto un moderato successo nel trattamento della LMD, i topi che hanno ricevuto la terapia intratecale hanno avuto una sopravvivenza globale molto più lunga (Figura 5B).

Figura 1: Iniezione di cellule tumorali circolanti nella cisterna magna in un modello di xenotrapianto murino per studiare la malattia leptomeningea e le metastasi del sistema nervoso centrale. (A) Un'illustrazione che mostra la posizione della cisterna magna e del sito di accesso al CSF, in cui le CTC vengono iniettate usando una siringa di Hamilton. (B)Un'immagine IVIS rappresentativa di topi che avevano sviluppato malattia leptomeningea e metastasi del sistema nervoso centrale (cervello e lungo il midollo spinale) dopo 2 settimane di iniezione con cellule tumorali circolanti. Le cellule sono state etichettate con un gene reporter luciferasi. Gli animali di controllo iniettati con soluzione salina non hanno sviluppato tumori (n = 3) e l'esperimento è stato eseguito in triplice copia. Abbreviazioni: CTC = cellule tumorali circolanti; IVIS = sistema di imaging in vivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Un esempio di configurazione di una workstation per l'esecuzione dell'impianto murino Ommaya nei topi. (1) Macchina per anestesia a gas/vaporizzatore. (2) Drappo di carta blu sterile che copre un supporto stereotassico. (3) Dispositivo stereotassico (supporto / palco, barre auricolari, cono del naso). (4) Microdrill. (5) Lente d'ingrandimento con luce. (6) Bastoncini di applicatore con tappo di cotone sterile con contenitore sterile per risciacquo salino. (7) Perossido di idrogeno. (8) Sterilizzatore per peri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: L'impianto del dispositivo Murine Ommaya. (A) Un'illustrazione con una freccia che indica la posizione del bregma sul cranio e la distanza approssimativa alla quale viene praticato un foro di bava nel cranio (0,5 mm posteriore/1,1 mm laterale) dal bregma usando un microdrill. (B) Un Ommaya murino viene assemblato combinando una cannula metallica e un distanziatore da 1 mm come base per l'attacco della colla al cranio. (C) Immagini rappresentative di topi a cui è stata impiantata Murine Ommayas; questi topi sono monitorati per garantire che siano luminosi, vigili e reattivi prima di ricevere qualsiasi iniezione. (D) Un esempio del prototipo di Murine Ommaya compatibile con la risonanza magnetica magnetica e immagini rappresentative di risonanza magnetica cerebrale di impianti Murine Ommaya. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Iniezione intraventricolare (sistema nervoso centrale) con Murine Ommaya. (A) Immagine di un'iniezione, accesso al ventricolo e al sistema nervoso centrale tramite l'Ommaya murino. I topi rimangono in anestesia durante l'iniezione. Nell'esempio, l'Ommaya murino è collegato alla porta in miniatura collegata a una siringa Hamilton preriempita. Le iniezioni vengono eseguite utilizzando un set di iniezione automatica a una velocità di infusione di 1 μL/min e un volume di 5-7 μL. Viene mostrata un'immagine di un cervello di topo iniettato con Evans Blue. Il cerchio mostra dove era attaccato il Murine Ommaya. Nessuna perdita del colorante è stata osservata all'esterno del cervello. Una sezione trasversale del cervello mostra che i ventricoli laterali sono stati riempiti con il colorante; il colorante non è penetrato nel parenchima cerebrale. (B) Immagini di cervelli di topo dopo 15 e 30 minuti dall'iniezione del colorante Evans Blue. Il colorante si è infiltrato nel cervello (15 min) e ha iniziato a circolare sul midollo spinale (30 min). Su 5 topi, 4 hanno ricevuto colorante per la visualizzazione e 1 è servito come controllo. L'esperimento è stato ripetuto in triplice copia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: L'immunoterapia mirata diretta con Murine Ommaya aumenta la sopravvivenza globale dei topi con malattia leptomeningea associata al cancro al seno. ( A )Itopi BALB/c sono stati iniettati con cellule TUBO 2-positive del recettore del fattore di crescita epidermico umano 2-positive, una linea cellulare murina del cancro al seno. Tre giorni dopo le iniezioni di cisterna magna, murine ommayas sono stati impiantati. I topi hanno iniziato a sviluppare la malattia leptomeningea (LMD) 1 settimana dopo l'iniezione. I topi LMD sono stati trattati con un anticorpo del recettore del fattore di crescita epidermico umano per via sistemica tramite iniezione intraperitoneale o per via intratecale (Murine Ommaya) come approccio mirato diretto. Le iniezioni sono state somministrate una volta alla settimana per un massimo di 4 settimane. Rispetto ai topi non trattati, i topi sottoposti a immunoterapia sono sopravvissuti molto più a lungo. I topi Murine Ommaya hanno avuto una completa regressione della malattia entro la quarta settimana e questi topi sono stati infine guariti dalla malattia. (B) Questi topi avevano anche una sopravvivenza mediana significativamente migliore (test di Mantel-Cox; P = 0,004; n = 5 topi per braccio di trattamento) e una migliore sopravvivenza globale rispetto ai topi LMD trattati sistematicamente. Abbreviazioni: LMD = malattia leptomeningea; IP = intraperitoneale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Peter Forsyth fa parte di comitati consultivi per Abvie Inc., Bayer, Bristol Meyers Squib, BTG, Inovio, Novocure, Tocagen e Ziopharm, al di fuori del lavoro presentato. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.