Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.
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Articolo metodologico
Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem
In questo articolo
Sommario
Abstract
La metabolomica è una metodologia utilizzata per l'identificazione e la quantificazione di molti intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo all'interno di una cellula, tessuto, organo, fluido biologico o organismo. La metabolomica si concentra tradizionalmente sui metaboliti solubili in acqua. Il metaboloma solubile in acqua è il prodotto finale di una complessa rete cellulare che integra vari fattori genomici, epigenomici, trascrittomici, proteomici e ambientali. Quindi, l'analisi metabolomica valuta direttamente l'esito dell'azione per tutti questi fattori in una pletora di processi biologici all'interno di vari organismi. Uno di questi organismi è il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, un eucariota unicellulare con il genoma completamente sequenziato. Poiché S. cerevisiae è suscettibile di analisi molecolari complete, viene utilizzato come modello per sezionare i meccanismi alla base di molti processi biologici all'interno della cellula eucariotica. Un metodo analitico versatile per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata del metaboloma solubile in acqua fornirebbe la metodologia essenziale per sezionare questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per le condizioni ottimizzate di tempra dell'attività metabolica e l'estrazione di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di S. cerevisiae. Il protocollo descrive anche l'uso della cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei metaboliti idrosolubili estratti. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata qui descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche, tra cui diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. Il metodo è stato utilizzato con successo per valutare i metabolomi idrosolubili di cellule di lievito selvatiche e mutanti coltivate in condizioni diverse.
Introduzione
I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell'espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l'autofagia, l'invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata1,
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Protocollo
1. Fare e sterilizzare un mezzo per la coltivazione del lievito
- Fare 180 ml di un estratto di lievito completo con bactopeptone (YP) mezzo. Il mezzo YP completo contiene l'1% (p/v) di estratto di lievito e il 2% (p/v) di bactopeptone.
- Distribuire 180 mL del mezzo YP in modo equo in quattro palloni Erlenmeyer da 250 mL. Ognuno di questi palloni contiene 45 ml del mezzo YP.
- Sterilizzare i palloni con YP medium mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.
2. Ceppo di lievito selvatico
- Utilizzare il ceppo BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Lievit....
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Risultati
Per migliorare una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito, abbiamo ottimizzato le condizioni di tempra cellulare per il rilevamento dei metaboliti. La tempra cellulare per questo scopo comporta un rapido arresto di tutte le reazioni enzimatiche all'interno di una cellula31,33,37,38. Tale arresto dell'attiv.......
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Discussione
Per utilizzare con successo il protocollo qui descritto, seguire le misure preventive descritte di seguito. Il cloroformio e il metanolo estraggono varie sostanze dalla plastica da laboratorio. Pertanto, maneggiarli con cautela. Evitare l'uso di materie plastiche in fasi che comportano il contatto con uno di questi due solventi organici. Utilizzare pipette in vetro borosilicato per questi passaggi. Sollevare queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell'uso. Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in poliprop.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa, il Centro per la genomica strutturale e funzionale e il Centro per la microscopia e l'imaging cellulare (tutti presso la Concordia University) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. è stato sostenuto dalla Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e dal Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche | |||
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Acetato di ammonio | Fisher Scientific | A11450 | |
| Bicarbonato di ammonio | Sigma | 9830 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cloroformio | Fisher Scientific | C297-4 | |
| Glucosio | Fisher Scientific | D16-10 | |
| L-istidina | Sigma | H8125 | |
| L-leucina | Sigma | L8912 | |
| L-lisina | Sigma | L5501 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A4564 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A4564 | |
| Ioduro di propidio | Thermo Scientific | R37108 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Hardware equipment | |||
| 500 ml flaconi per centrifuga | Beckman | 355664 | |
| Agilent serie 1100 LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Beckman Coulter Centrifuga | Beckman | 6254249 | |
| Beckman Coulter Centrifuga Rotore | Beckman | JA-10 | |
| Centra CL2 Thermo | Scientific | 004260F | |
| Termometro digitale | Omega | HH509 | |
| Kit porta provette in schiuma con fermo | Thermo Scientific | 02-215-388 | |
| Colonna in fase zwitterionica SeQuant ZIC-pHILIC (5µ m polimero 150 x 2,1 mm) | Sigma Milipore | 150460 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Sonicatore ad ultrasuoni | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2,1 x 150 mm, 5 &; m | Agilent Technologies | 883725-901 | |
| Materiali da laboratorio | |||
| 2-mL Fiale per campioni in vetro con tappi rivestiti in teflon | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| Perle di vetro (lavate con acido, 425-600 &; m) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Provette da centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in teflon | PYREX | 05-550 | |
| Software | |||
| Compound Discoverer 3.1 | Fisher Scientific | V3.1 | |
| Ceppo di lievito | |||
| Lievito ceppo BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
Riferimenti
- Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
- Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Ce....
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Ristampe e permessi
