Articolo metodologico

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

DOI:

10.3791/62061

⸱

5 gennaio 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo per l'identificazione e la quantificazione delle principali classi di metaboliti idrosolubili nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Il metodo descritto è versatile, robusto e sensibile. Permette la separazione di isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili l'uno dall'altro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La metabolomica è una metodologia utilizzata per l'identificazione e la quantificazione di molti intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo all'interno di una cellula, tessuto, organo, fluido biologico o organismo. La metabolomica si concentra tradizionalmente sui metaboliti solubili in acqua. Il metaboloma solubile in acqua è il prodotto finale di una complessa rete cellulare che integra vari fattori genomici, epigenomici, trascrittomici, proteomici e ambientali. Quindi, l'analisi metabolomica valuta direttamente l'esito dell'azione per tutti questi fattori in una pletora di processi biologici all'interno di vari organismi. Uno di questi organismi è il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, un eucariota unicellulare con il genoma completamente sequenziato. Poiché S. cerevisiae è suscettibile di analisi molecolari complete, viene utilizzato come modello per sezionare i meccanismi alla base di molti processi biologici all'interno della cellula eucariotica. Un metodo analitico versatile per la valutazione quantitativa robusta, sensibile e accurata del metaboloma solubile in acqua fornirebbe la metodologia essenziale per sezionare questi meccanismi. Qui presentiamo un protocollo per le condizioni ottimizzate di tempra dell'attività metabolica e l'estrazione di metaboliti solubili in acqua dalle cellule di S. cerevisiae. Il protocollo descrive anche l'uso della cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) per l'analisi quantitativa dei metaboliti idrosolubili estratti. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata qui descritto è versatile e robusto. Consente l'identificazione e la quantificazione di oltre 370 metaboliti solubili in acqua con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche, tra cui diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti. Questi metaboliti includono varie molecole vettore di energia, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS di metabolomica non mirata è sensibile e consente l'identificazione e la quantificazione di alcuni metaboliti idrosolubili a concentrazioni fino a 0,05 pmol/μL. Il metodo è stato utilizzato con successo per valutare i metabolomi idrosolubili di cellule di lievito selvatiche e mutanti coltivate in condizioni diverse.

Introduzione

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I metaboliti idrosolubili sono intermedi a basso peso molecolare e prodotti del metabolismo che contribuiscono ai processi cellulari essenziali. Questi processi evolutivamente conservati includono la conversione dei nutrienti in energia utilizzabile, la sintesi di macromolecole, la crescita e la segnalazione cellulare, il controllo del ciclo cellulare, la regolazione dell'espressione genica, la risposta allo stress, la regolazione post-traduzionale del metabolismo, il mantenimento della funzionalità mitocondriale, il traffico cellulare vescicolare, l'autofagia, l'invecchiamento cellulare e la morte cellulare regolata1,2,3.

Molti di questi ruoli essenziali dei metaboliti idrosolubili sono stati scoperti da studi nel lievito in erba S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Questo eucariota unicellulare è un organismo modello utile per i meccanismi di dissezione attraverso i quali i metaboliti idrosolubili contribuiscono ai processi cellulari grazie alla sua suscettibilità ad analisi biochimiche, genetiche e biologiche molecolari avanzate23,24,25,26. Sebbene i metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata siano stati utilizzati per studiare i ruoli dei metaboliti idrosolubili nel lievito in erba3,18,22,27,questo tipo di analisi richiede il miglioramento della sua versatilità, robustezza, sensibilità e capacità di distinguere tra diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di questi metaboliti.

Gli ultimi anni sono caratterizzati da progressi significativi nell'applicazione dei metodi LC-MS/MS di metabolomica non mirata alla profilazione di metaboliti idrosolubili in vivo. Tuttavia, molte sfide nell'utilizzo di questa metodologia rimangono2,28, 29,30,31,32,33,34,35,36. Queste sfide includono quanto segue. In primo luogo, le concentrazioni intracellulari di molti metaboliti solubili in acqua sono al di sotto di una soglia di sensibilità per i metodi attualmente utilizzati. In secondo luogo, l'efficienza della tempra dell'attività metabolica è troppo bassa e l'entità della perdita cellulare associata alla tempra dei metaboliti intracellulari è troppo alta per i metodi attuali; quindi, i metodi attualmente utilizzati sottostivalutano le concentrazioni intracellulari dei metaboliti idrosolubili. In terzo luogo, i metodi esistenti non possono differenziare gli isomeri strutturali (cioè molecole con la stessa formula chimica ma diversa connettività atomica) o stereoisomeri (cioè molecole con la stessa formula chimica e connettività atomica, ma con la diversa disposizione atomica nello spazio) di metaboliti specifici; ciò impedisce la corretta annotazione di alcuni metaboliti con i metodi attualmente utilizzati. In quarto luogo, i database online spettrali di massa esistenti di ioni genitori (MS1) e ioni secondari (MS2) sono incompleti; ciò influisce sulla corretta identificazione e quantificazione di metaboliti specifici utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS prodotti con l'aiuto dei metodi attuali. In quinto luogo, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di estrazione di metaboliti per recuperare tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua. Sesto, i metodi esistenti non possono utilizzare un singolo tipo di colonna LC per separare l'uno dall'altro tutte o la maggior parte delle classi di metaboliti solubili in acqua.

Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni per la tempra dell'attività metabolica all'interno delle cellule di S. cerevisiae, mantenendo la maggior parte dei metaboliti idrosolubili all'interno di queste cellule prima dell'estrazione ed estraendo la maggior parte delle classi di metaboliti idrosolubili dalle cellule di lievito. Abbiamo sviluppato un metodo versatile, robusto e sensibile per l'identificazione e la quantificazione basata su LC-MS/MS di oltre 370 metaboliti idrosolubili estratti dalle cellule di S. cerevisiae. Questo metodo di metabolomica non mirata consente di valutare le concentrazioni intracellulari di varie molecole vettore energetico, nucleotidi, amminoacidi, monosaccaridi, intermedi di glicolisi e intermedi del ciclo tricarbossilico. Il metodo LC-MS/MS sviluppato consente l'identificazione e la quantificazione di diversi isomeri strutturali e forme stereoisomeriche di metaboliti idrosolubili con diverse proprietà strutturali, fisiche e chimiche.

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Protocollo

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1. Fare e sterilizzare un mezzo per la coltivazione del lievito

  1. Fare 180 ml di un estratto di lievito completo con bactopeptone (YP) mezzo. Il mezzo YP completo contiene l'1% (p/v) di estratto di lievito e il 2% (p/v) di bactopeptone.
  2. Distribuire 180 mL del mezzo YP in modo equo in quattro palloni Erlenmeyer da 250 mL. Ognuno di questi palloni contiene 45 ml del mezzo YP.
  3. Sterilizzare i palloni con YP medium mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.

2. Ceppo di lievito selvatico

  1. Utilizzare il ceppo BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Lievito in crescita nel mezzo YP contenente il 2% di glucosio

  1. Sterilizzare una soluzione stock di glucosio al 20% (p/v) mediante autoclave a 15 psi/121 °C per 45 min.
  2. Aggiungere 5 mL di soluzione stock di glucosio autoclavata al 20% (p/v) a ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con 45 mL del mezzo YP sterilizzato. La concentrazione finale di glucosio nel mezzo YP è del 2% (p/v).
  3. Utilizzare un anello microbiologico per inoculare le cellule di lievito in ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP contenente il 2% di glucosio.
  4. Coltivare le cellule di lievito durante la notte a 30 °C in uno shaker rotazionale impostato a 200 giri/min.
  5. Prendi un'aliquota di coltura di lievito. Determinare il numero totale di cellule di lievito per mL di coltura. Conta le cellule usando un emocitometro.

4. Trasferimento cellulare e la cellula cresce nel mezzo YP con il 2% di glucosio

  1. Aggiungere 5 mL della soluzione stock di glucosio sterilizzata al 20% (p/v) a ciascuno dei restanti due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP autoclavato. La concentrazione finale di glucosio è del 2% (p/v).
  2. Trasferire un volume della coltura di lievito durante la notte in terreno YP con glucosio al 2% che contiene il numero totale di 5,0 x10 7 cellule in ciascuno dei due palloni Erlenmeyer con il mezzo YP contenente il 2% di glucosio. Utilizzare una pipetta sterile per il trasferimento cellulare.
  3. Far crescere le cellule di lievito per almeno 24 ore (o più, se l'esperimento lo richiede) a 30 °C in uno shaker rotazionale impostato a 200 giri/min.

5. Produzione di reagenti, preparazione di materiale da laboratorio e installazione di attrezzature per la tempra cellulare

  1. Preparare quanto segue: 1) una soluzione di tempra (60% di metanolo di alta qualità (>99,9%) in tampone di bicarbonato di ammonio (ABC) da 155 mM, pH = 8,0); 2) una soluzione ABC ghiacciata (pH = 8,0); 3) un termometro digitale in grado di misurare fino a -20 °C; 4) Bottiglie centrifughe grandi da 500 ml; 5) una centrifuga ad alta velocità pre-raffreddata con rotore pre-raffreddato e bottiglie centrifughe pre-raffreddate da 500 mL per questo rotore, il tutto a -5 °C; 6) tubi di estrazione dei metaboliti (tubi centrifughi in vetro ad alta velocità da 15 ml con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene); e 7) ghiaccio secco.

6. Spegnimento cellulare

  1. Utilizzare un emocitometro per determinare il numero di cellule di lievito per ml di YP con coltura di glucosio al 2%.
  2. Trasferire un volume della coltura in terreno YP con glucosio al 2% che contiene il numero totale di 5,0 x 108 cellule in flaconi di centrifuga da 500 ml pre-raffreddati.
  3. Riempire rapidamente il flacone della centrifuga contenente le celle fino al volume di 200 ml con una soluzione di tempra conservata a -20 °C.
  4. Centrifugare le bottiglie in una centrifuga ad alta velocità a 11.325 x g per 3 minuti a -5 °C.
  5. Recuperare rapidamente e teneramente la bottiglia dalla centrifuga; svitare delicatamente il coperchio e rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
  6. Riaspensionare rapidamente il pellet cellulare in 10 mL di tampone ABC ghiacciato e trasferire la sospensione in un tubo di centrifuga di vetro ad alta velocità da 15 mL con un tappo rivestito in politetrafluoroetilene per l'estrazione del metabolita.
  7. Raccogliere le cellule per centrifugazione in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 3 minuti a 0 °C.
  8. Rimuovere rapidamente il surnatante e posizionare il tubo su ghiaccio secco per iniziare l'estrazione del metabolita o conservare il tubo a -80 °C fino all'estrazione.

7. Preparazione di reagenti, materiale da laboratorio e attrezzature per l'estrazione dei metaboliti

  1. Preparare quanto segue: 1) cloroformio di grado LC-MS; 2) metanolo di grado LC-MS; 3) Acqua nano-pura di grado LC; 4) Grado LC-MS (ACN); 5) perle di vetro (lavate con acido, 425-600 μm); 6) un vortice con un kit portatubi in schiuma con fermo; 7) Tubi centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in politetrafluoroetilene; 8) flaconcini di SM; 9) ghiaccio secco; e 10) tubi da 1,5 ml lavati una volta con etanolo, una volta con ACN e una volta con acqua nano-pura.
    NOTA: Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in polipropilene resistente ai solventi organici.

8. Estrazione del metabolita

  1. Ai metaboliti tenuti su ghiaccio secco o conservati a -80 °C dal punto 6.7, aggiungere quanto segue: 1) 2 mL di cloroformio conservato a -20 °C; 2) 1 mL di metanolo conservato a -20 °C; 3) 1 mL di acqua nanopura ghiacciata; e 4) 200 μL di 425-600 μm di perle di vetro lavate con acido.
  2. Coprire e chiudere la bocca di un tubo con un foglio di alluminio. Posizionare i tubi in un kit di supporto per tubi in schiuma con fermo e vorticizzarli per 30 minuti a velocità media (cioè a una velocità impostata su 6, con 12 che è la velocità massima di un vortice) a 4 ° C per facilitare l'estrazione del metabolita.
  3. Incubare il tubo per 15 minuti su ghiaccio (NON ghiaccio secco!) per favorire la precipitazione proteica e la separazione dell'acqua superiore dalla fase organica inferiore.
  4. Centrifugare il tubo in una centrifuga clinica a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Questa fase di centrifugazione consente di separare la fase acquosa superiore (che contiene metaboliti idrosolubili) dallo strato intermedio (che contiene detriti cellulari e proteine) e dalla fase organica inferiore (che contiene principalmente lipidi).
  5. Utilizzare una micropipetta per trasferire la fase acquosa superiore (400 μL) in un tubo da 1,5 mL lavato ed etichettato contenente 800 μL di ACN che è stato conservato a -20 °C.
    NOTA: Ci saranno precipitazioni di nuvole bianche dopo aver aggiunto la fase acquosa superiore all'ACN mantenuta a -20 °C.
  6. Centrifugare il tubo con il campione in una centrifuga da tavolo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: la precipitazione della nube bianca scomparirà dopo la centrifugazione.
  7. Trasferire 800 μL dalla parte superiore di un liquido nel tubo a un flaconcino MS etichettato. Conservare il campione a 0 °C fino a quando non viene analizzato da LC-MS/MS.

9. Preparazione di reagenti, materiale da laboratorio e attrezzature per LC

  1. Preparare quanto segue: 1) un vortice; 2) un sonicatore ad ultrasuoni; 3) Flaconcini di vetro MS; 4) un sistema LC dotato di pompa binaria, degasser e autocampionatore; 5) una colonna per cromatografia in fase zwitterionica (polimero da 5 μm, 150 x 2,1 mm) nominata nella Tabella dei Materiali; 6) un riscaldatore a colonna; e 7) fasi mobili, tra cui la fase A (5:95 ACN:acqua (v/v) con 20 mM di acetato di ammonio, pH = 8,0) e la fase B (100% ACN).

10. Separazione dei metaboliti estratti mediante LC

  1. Sottoporre il contenuto della fiala MS alla sonicazione ad ultrasuoni per 15 minuti.
  2. Vorticosamente il flaconcino MS 3x per 10 secondi a temperatura ambiente (RT).
  3. Inserire il flaconcino di MS nella piastra del pozzo.
  4. Durante il cromatografo, mantenere la colonna a 45 °C e una portata di 0,250 ml/min. Conservare il campione nella piastra del pozzo a 0 °C. Fare riferimento alla Tabella 1 per i gradienti LC che devono essere utilizzati durante la cromatografia.
    NOTA: Un cromatogramma ioico totale rappresentativo dei metaboliti solubili in acqua estratti dalle cellule del ceppo wild-type BY4742 è mostrato nella Figura 1. I metaboliti separati da LC sono stati identificati e quantificati mediante analisi spettrometrica di massa che è stata eseguita in modalità di ionizzazione positiva [ESI (+)], come descritto per la fase 11.

11. Analisi spettrometrica di massa di metaboliti separati da LC

  1. Utilizzare uno spettrometro di massa dotato di ionizzazione elettrospray riscaldata (HESI) per l'identificazione e la quantificazione di metaboliti solubili in acqua che sono stati separati da LC. Utilizzare l'analizzatore dello spettrometro di massa per gli ioni MS1 e il rivelatore dello spettrometro di massa per gli ioni MS2. Utilizzare le impostazioni fornite nelle tabelle 2 e 3 per l'acquisizione dipendente dai dati degli ioni MS1 e MS2, rispettivamente.
  2. Utilizzare un volume di campione di 10 μL per l'iniezione in entrambe le modalità ESI (+) ed ESI (-).

12. Identificazione e quantificazione di diversi metaboliti mediante l'elaborazione di dati grezzi da LC-MS/MS

  1. Utilizzare il software indicato nella Tabella dei materiali per eseguire l'identificazione e la quantificazione di diversi metaboliti solubili in acqua da file LC-MS/MS grezzi. Questo software utilizza MS1 per la quantificazione dei metaboliti e MS2 per l'identificazione dei metaboliti. Il software sfrutta la libreria di frammentazione spettrale di massa più ampiamente curata per annotare i metaboliti utilizzando i dati grezzi LC-MS/MS abbinando gli spettri MS. Questo software utilizza anche la massa esatta di MS1 e la corrispondenza del modello isotopico per annotare i metaboliti utilizzando database online. Per informazioni dettagliate, vedere la Figura 2.
  2. Utilizzare la libreria di database e spettri, che è liberamente disponibile online (https://www.mzcloud.org), per cercare spettri MS2 dei dati grezzi.

13. Analisi dell'integrità della membrana mediante colorazione allo ioduro di propidio (PI) e microscopia a fluorescenza

  1. Dopo la tempra cellulare eseguita come descritto per la fase 6, lavare accuratamente le cellule temprate con 15 mL di tampone ABC per rimuovere la soluzione di tempra. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 5 minuti a 0 °C.
  2. Risuscise il pellet cellulare in 1 mL di tampone ABC e aggiungere 0,5 mL della soluzione PI (0,5 mg/mL).
  3. Vortice di una provetta con il campione 3x per 10 s e incubarlo per 10 minuti al buio e sul ghiaccio.
  4. Centrifugare il tubo con il campione in una centrifuga da tavolo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere il surnatante e risusediare il pellet in 1 mL di tampone ABC.
  6. Centrifugare il tubo a 13.400 x g per 10 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetete questo passaggio altre 2 volte per rimuovere il PI associato alla superficie della cella.
  7. Risuspenare il pellet in 300 μL di tampone ABC. Posizionare 10 μL della sospensione sulla superficie di un vetrino per microscopio.
  8. Cattura le immagini al microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC) e fluorescenza con un microscopio a fluorescenza. Utilizzare un filtro impostato alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 593 nm e 636 nm (rispettivamente).
  9. Utilizzare un software per contare il numero totale di celle (in modalità DIC) e il numero di celle colorate fluorescentemente. Inoltre, utilizzare questo software per determinare l'intensità della colorazione per le singole cellule.

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Risultati

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Per migliorare una valutazione quantitativa dei metaboliti solubili in acqua all'interno di una cellula di lievito, abbiamo ottimizzato le condizioni di tempra cellulare per il rilevamento dei metaboliti. La tempra cellulare per questo scopo comporta un rapido arresto di tutte le reazioni enzimatiche all'interno di una cellula31,33,37,38. Tale arresto dell'attiv...

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Discussione

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Per utilizzare con successo il protocollo qui descritto, seguire le misure preventive descritte di seguito. Il cloroformio e il metanolo estraggono varie sostanze dalla plastica da laboratorio. Pertanto, maneggiarli con cautela. Evitare l'uso di materie plastiche in fasi che comportano il contatto con uno di questi due solventi organici. Utilizzare pipette in vetro borosilicato per questi passaggi. Sollevare queste pipette con cloroformio e metanolo prima dell'uso. Utilizzare solo punte e tubi in micropipette in poliprop...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati agli attuali ed ex membri del laboratorio Titorenko per le discussioni. Riconosciamo il Centro per le applicazioni biologiche della spettrometria di massa, il Centro per la genomica strutturale e funzionale e il Centro per la microscopia e l'imaging cellulare (tutti presso la Concordia University) per i servizi eccezionali. Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) del Canada (RGPIN 2014-04482 e CRDPJ 515900 - 17). K.M. è stato sostenuto dalla Concordia University Armand C. Archambault Fellowship e dal Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sostanze chimiche
AcetonitrileFisher ScientificA9554
Acetato di ammonioFisher ScientificA11450
Bicarbonato di ammonioSigma9830
BactopeptoneFisher ScientificBP1420-2
CloroformioFisher ScientificC297-4
GlucosioFisher ScientificD16-10
L-istidinaSigmaH8125
L-leucinaSigmaL8912
L-lisinaSigmaL5501
MetanoloFisher ScientificA4564
MetanoloFisher ScientificA4564
Ioduro di propidioThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Estratto di lievitoFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml flaconi per centrifugaBeckman355664
Agilent serie 1100 LC systemAgilent TechnologiesG1312A
Beckman Coulter CentrifugaBeckman6254249
Beckman Coulter Centrifuga RotoreBeckmanJA-10
Centra CL2 ThermoScientific004260F
Termometro digitaleOmegaHH509
Kit porta provette in schiuma con fermoThermo Scientific02-215-388
Colonna in fase zwitterionica SeQuant ZIC-pHILIC (5µ m polimero 150 x 2,1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Sonicatore ad ultrasuoniFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2,1 x 150 mm, 5 &; mAgilent Technologies883725-901
Materiali da laboratorio
2-mL Fiale per campioni in vetro con tappi rivestiti in teflonFisher Scientific60180A-SV9-1P
Perle di vetro (lavate con acido, 425-600 &; m)Sigma-AldrichG8772
HemacytometerFisher Scientific267110
Provette da centrifuga in vetro ad alta velocità da 15 mL con tappi rivestiti in teflonPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Ceppo di lievito
Lievito ceppo BY4742DharmaconYSC1049

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973(2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020(2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046(2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588(2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148(2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308(2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301(2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122(2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3(2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251(2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

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