Summary
この提示方法は、従来の顕微鏡で70nmの分解能を導く拡大顕微鏡による蛍光標識された細胞タンパク質の可視化を可能にする。
Abstract
糸球体内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトから構成される糸球体フィルターの破壊は、アルブミン尿をもたらす。ポドサイトの足のプロセスは、ポドシンなどの細胞骨格アダプタータンパク質に結合するアクチンバンドルを含む。これらのアダプタータンパク質は、ポドシンなどの、ネフリンなどの糸球体スリットダイヤフラムの骨格をアクチン細胞骨格に連結する。これらのタンパク質および他のポドサイクタンパク質の局在化と機能を研究することは、健康と疾患における糸球体フィルターの役割を理解するために不可欠です。提示された議定書はユーザーが従来の顕微鏡の超解像のイメージ投射と細胞のアクチン、ポドシンおよびネフリンを視覚化することを可能にする。まず、細胞は、従来の免疫蛍光技術で染色される。サンプル内のすべてのタンパク質は、その後、膨らむヒドロゲルに共有結合して固定されます。プロテアーゼKによる消化を通じて、構造タンパク質は切断され、最後のステップでゲルの等熱帯腫脹を可能にする。水中のサンプルの透析はサンプルの4-4.5倍の拡大をもたらし、サンプルは従来の蛍光顕微鏡を介して画像化することができ、70nmの潜在的な解像度をレンダリングする。
Introduction
アルブミン尿症は、心血管リスクの代理パラメータであり、糸球体フィルター1の破壊による結果である。糸球体フィルターは、フェネスト処理された内皮、糸球体の地下膜およびポドサイトによって形成されたスリットダイヤフラムから構成される。ポドサイトの一次および二次足のプロセスは、グロメルラム2の毛細血管壁の周りを包む。足のプロセスの繊細な構造は、複数のスリットダイヤフラムタンパク質および他のアダプタタンパク質のアンカーとしても機能する皮質アクチン束によって維持される2。スリットダイアフラムの骨格タンパク質はネフリンと呼ばれ、反対するポドサイトのネフリン分子と同種的に相互作用する。多様なアダプタータンパク質を介して、ネフリンは、アクチン細胞骨格2、3にリンクされています。ネフリンコード遺伝子NPHS1の変異は、フィンランド型4型のネフローゼ症候群に至る。
ネフリンの相互作用タンパク質の1つは、ストマチンファミリー3のヘアピン様タンパク質であるポドシンである。ポドシンは、脂質ラフトにネフリンを募集し、アクチン細胞骨格5にリンクします。ポドシンは、NPHS2遺伝子によってコードされる。NPHS2の突然変異はステロイド耐性ネフローゼ症候群6につながる。
アクチンアダプタータンパク質を可視化し、共局化するために、免疫蛍光技術が用いられ得る。残念ながら、光の回折障壁は、従来の蛍光顕微鏡の分解能を200〜350nm7に制限する。新規顕微鏡法は、例えば、刺激放出枯渇(STED)8、光活性化局在化顕微鏡(PALM)9、確率的光学再構成顕微鏡(STORMまたはdSTORM)、または個々の分子リターン(GSDIM)9、10、11の後に、約10nmまでの分解能を可能にする。しかし、これらの超分解能技術は、非常に高価な顕微鏡、十分な訓練を受けた人員を必要とし、したがって、多くの研究室では利用できません。
拡張顕微鏡(ExM)は、従来の顕微鏡で超解像度イメージングを可能にする新しい簡単な技術であり、大規模な研究コミュニティ12に潜在的に利用可能である。タンパク質保持拡大顕微鏡(proExM)において、目的とするサンプル(細胞または組織)が固定され、フルオロフォア13で染色される。サンプル中のタンパク質は、その後、小分子((Acryloyl)アミノ酸、コハクニミジルエステル、AcX)によって可膨らむヒドロゲル13に共有結合される。タンパク質および蛍光体は、タンパク質K(ProK)による酵素消化を通じて、膨張後のゲル内での相対的な位置を維持する13。ゲルの腫脹後、サンプルは4.5倍(90倍の容積膨張)まで拡大し、約60-70 nm(300 nm/4.5)の効果的な横解像度に至る。この技術の変更は、10倍の拡張(1,000倍の体積膨張)を可能にし、従来の顕微鏡14、15、16で20〜30nmの解像度をレンダリングする。
マウスとヒト腎臓の糸球体構造は、ExM17を介して可視化されている。本論文では、従来の蛍光顕微鏡を用いて、F-アクチンおよびアクチンアダプタータンパク質ポドシンの超分解能像を細胞内で可視化する詳細なproExMプロトコルを紹介する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞の分割と播種
- 10%の胎児子牛血清(FCS)、滅菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)、滅菌トリプシンを含む無菌ダルベックコの修正イーグル培地(DMEM)を37°Cに温めます。 クリーンベンチをアクティブにします。
- 滅菌鉗子を使用して各ウェルに1つの無菌ガラスカバースリップ(10mm)を加えることによって6ウェルプレートを準備します。
- 清潔なベンチの下にCos7細胞を持つ10cmの細胞培養皿を入れます。クリーンベンチの下で、真空装置を使用して細胞の媒体を吸引する。
- アンギュレードされた細胞培養皿を片手に持ち、細胞培養皿の側面に10mLの無菌PBSを加えて細胞のすすがりを避けます。PBSが完全な細胞培養皿を洗いすがるように細胞培養皿を下に置きます。
- PBSを取り出し、細胞培養皿の途中に1mLのトリプシンを加え、37°Cで5分間インキュベートします。
- 10%FCSを含むDMEMの10 mLを加えてトリプシン反応を停止し、ピペットで細胞溶液を上下にピペットして細胞を手動で分離します。
- カウントチャンバーを使用して、ミリリットル当たりのセル数を分析します。
- 6ウェルプレートのガラスカバースリップに2mL培地あたり68,000個の細胞をシードします。プレートを水平および垂直に慎重に振って、6ウェルプレート内の細胞を分配します。
注: セルは分散している必要があります。 - 細胞を5%CO2で37°Cインキュベーターで一晩インキュベートする。
2. 細胞のトランスフェクション
- 滅菌1.5mLチューブ(1つは希釈DNA(A)用、もう1つはカチオン脂質トランスフェクション用希釈試薬(B))用)を2つ用意します。ピペット0.75μgのネフリンと0.75 μgのポドシンcDNA発現プラスミドを1つの1.5 mLチューブに1ウェルにし、1ウェルあたり100 μLの減らされた血清培地に希釈します。2番目の1.5mLチューブに1ウェルあたり3μLのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を加え、100 μLの減らされた血清培地で希釈します。両方の反応を室温で5分間インキュベートします。
- 両方の反応(AとB)をDNA-脂質複合体に組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。DNA-脂質複合体をそれぞれ200μLずつ添加します。
- トランスフェクトした細胞を培地を変えずに、37°Cで5%CO2で48時間インキュベートします。
3. 細胞構造の免疫表示
- 固定溶液(PBS中のパラホルムアルデヒド4%(w/v)パラホルムアルデヒド、1 mL/well、透過性溶液(0.5%(w/v)トリトンX-100 PBS、1 mL/well)、ブロッキング溶液(PBS中の5%(v/v)ウシ血清アルブミン、1mL/ウェルを調製します。
- 真空装置で媒体を取り外します。各ウェルに2mLのPBSを加え、余分な媒体を取り除きます。PBSを完全に吸引します。
メモ:PBSで細胞を洗い流さないように、ガラスカバースリップに直接ピペットPBSを入れないようにしてください。 - 4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに溶解し、室温で10分間溶解した細胞を固定します。
注:または、細胞を3%(v/v)グリオキサルエタノール18に固定します。 - ガラスカバースリップに直接ピペットを避けることによって、PFAを廃棄し、PBS(それぞれ2mL)で細胞を2回洗浄します。室温で10分間PBSでトリトンX-100 0.5%(w/v)で固定細胞を透過させます。
- パーメアビライゼーション溶液を取り出し、ステップ3.2に示すようにPBSで2回洗浄します。
- PBSで1mLの5%(v/v)BSAを室温で1時間加えて細胞をブロックします。一次抗体の200 μLで細胞をインキュベートする (抗ポドシン抗体 1:200 で 1%(v/v) BSA で 1%の BSA) 4 °C で一晩.
注:または、一次抗体を室温で1時間インキュベートします。 - 一次抗体を取り出し、ステップ3.2のようにPBSで3回洗浄します。二次抗体(ヤギ抗ウサギアレクサ488 1:1000 1%(v/v)PBSのBSA)を室温で1時間加えます。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。
- 二次抗体を捨て、PBSで3回洗浄します。
- PBSを取り除き、200 μLの抗ネフリン抗体1:100をPBSで1%(v/v)BSAで室温で1時間インキュベートします。PBSで3回洗います。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。
- PBSを取り除き、二次抗体ロバ抗モルモット633、1:200、室温で1時間インキュベートします。PBSで3回洗います。ボックスを使用して暗闇の中でセルを維持します。
4. 拡張顕微鏡
- 準備
- ゲル化チャンバー用スペーサーを形成するには、ダイヤモンドナイフを使用して、ガラスカバーを#1.0、#1.5を5mmストライプ(1枚4枚スライド)にカットします。#1.5 mmカバースリップストライプを、ガラススライド上に2.5cmの長さの正方形を形成し、染色チャンバーに配置します(図2A1-C1)。正方形の角にddH2Oの液滴をピペットし、ガラスカバースリップストライプを互いに接着し、ガラススライドに付着する(図2A2-C2)。
注:接着力が失われるため、ddH2Oの完全な乾燥は避けてください。必要に応じて、ddH2O.の液滴を塗布し、約20分間待ち、#1.5 mmカバースリップが安定して取り付けられてからステップ4.1.2で始めます。 - カバースリップごとに4つの#1.0ガラスカバースリップストライプを#1.5mmカバースリップに置きます。各#1.5 mmカバースリップストライプに液滴をピペットしてストライプを付着させる(図2A3-C3)。
注: プロトコルの進行の処理を容易にするために、ゲルの厚さは 0.15 mm 以上である必要があります。しかし、細胞の上に過度のゲルを避けるために、スペーサーの高さを細胞の基質に近づけます。スペーサーとして#1.5および#1.0カバースリップストライプを使用すると、スペーサーの高さは約0.3 mmになります。セルはカバーガラス(高さ0.12mm)に付着します。したがって、ゲルは取り扱いに十分な厚さになりますが、細胞の上に過度のゲルがスペーサーとして#1.0と#1.5カバーガラスストライプを使用して回避されます。 - ゲル化チャンバ蓋の場合は、カバーガラス(#1.5)をパラフィンフィルムで包みます。パラフィンフィルムの折り目や汚れを避けてください(図2A5-C5)。
- ゲル化チャンバー用スペーサーを形成するには、ダイヤモンドナイフを使用して、ガラスカバーを#1.0、#1.5を5mmストライプ(1枚4枚スライド)にカットします。#1.5 mmカバースリップストライプを、ガラススライド上に2.5cmの長さの正方形を形成し、染色チャンバーに配置します(図2A1-C1)。正方形の角にddH2Oの液滴をピペットし、ガラスカバースリップストライプを互いに接着し、ガラススライドに付着する(図2A2-C2)。
- アンカーと重合(ゲル化)
- アンカー バッファを準備します ( 表 1を参照)。アンカー処理の場合は、PBSをガラスカバースリップに直接当たり250 μLのアンカーバッファに交換し、室温で3時間インキュベートします。箱を使って、基板を暗い状態に保ちます。
注:または、室温で一晩インキュベートしてください。すべての実験に新鮮なアンカーバッファを準備し、それが適切に溶解するまで10〜15分待ちます。6-(((Acryloyl)アミノ酸、コハシニミジルエステル(AcX)は、適切なアンカーを確保するために4〜5ヶ月ごとに交換する必要があります。 - アンカーバッファを取り外し、井戸あたり1.5 mL PBSで1回洗います。
- アクチン繊維を染色するには、ExM適合のファロイジン溶液を解凍し、ファロイジン(195 μLで195 μLの1%(v/v)BSAをPBS/ウェルで希釈したファロイジン5μL)を室温で45分間インキュベートします。箱を使って暗闇の中でサンプルを保ちます。
- その間、攪拌装置を用いてddH2O中にアクリレートナトリウムを溶解する。氷の上で、単量体溶液を準備する( 表1を参照)。
注:溶存ナトリウムアクリレートは、明確で無色の溶液でなければなりません。溶液が黄色の場合は、新しいアクリレートナトリウムに交換してください。 - 氷の上でゲル化液を準備する( 表1を参照)。ゲル化液がゲル化チャンバーに塗布される直前に、ゲル化液中にピペットアンモニウムペルオキシドスルフェート(APS)を投入した。
- 細胞からファロイジンを取り出し、室温で2回PBSの1.5mLで洗浄します。ガラスカバースリップのサンプルの除去を容易にするために井戸の中に1.5 mL PBSを残します。
- 鉗子とカニューレを使用して、カバーガラスの上の細胞をゲル化チャンバーに入れ、6ウェルプレートからカバーガラススリップを持ち上げます。
注: セルは、ガラスカバースリップの上部に置く必要があります。ガラスカバースリップはスペーサーに触れてはならない。 - すぐにゲル化液と渦にAPSを追加します。サンプル上の200μLのゲル化溶液(図2A4-C4)を用いた)。ゲル内の気泡を避けることでゲル化チャンバーを慎重に閉じる(図2A5-C5)。
- ゲル化チャンバーを37°Cで少なくとも1時間インキュベートし、濡れた染色チャンバ内でゲルを重合させる。
- アンカー バッファを準備します ( 表 1を参照)。アンカー処理の場合は、PBSをガラスカバースリップに直接当たり250 μLのアンカーバッファに交換し、室温で3時間インキュベートします。箱を使って、基板を暗い状態に保ちます。
- 均質化(消化)
- インキュベーターから染色チャンバーを取り出します。ゲル化チャンバーの蓋を開けるには、蓋とスペーサの間にカミソリの刃を導入します。蓋は慎重に取り外します。カミソリの刃でスペーサーを取り外し、カミソリの刃で切ることによってすべての余分なゲルを排除する。
- スライドにゲルを入れ、ガラスをカバーしてPBSで満たされた皿に入れます。軽く振ることで、取り外したカバーガラスをゲルから取り外します。食器からゲルを取り除きやすくするには、スライドをゲルの下に置き、スライドにゲルを取り付けます。
- スライド上のゲルで、カミソリの刃を使用してゲルを小さく分割します(ゲルの4分の1は2〜3個に分割されます)。ゲルの1枚をガラス底の6ウェルプレートの井戸にそっと押し込み、ペイントブラシで包みます。ゲルの脱水を避けるために、ペイントブラシを使用してPBSの少量でゲルを保湿してください。
メモ: セルは下向きに向いています。 - 反転顕微鏡を使用して、低い数値開口で画像を撮り、膨張後の膨張因子を決定します。
- ダイジェスト バッファを準備します ( 表 1を参照)。消化液を受け取る消化バッファーで4 U/mLにプロテイナーゼKを希釈。
注:プロテアーゼKなしの消化バッファーは、4°Cで1〜2週間保存することができます。 - 消化液500μLを各ウェルに加え、ゲルを溶液内に浸します。室温で一晩消化させ、サンプルを暗闇の中に保つ蓋を閉じます。
注:または、37°Cで1時間消化させます。
- 拡張
- ピペットで消化液を取り出し、廃棄します。ddH2O.1 mLを加えて、浸漬ゲルを室温で10分間インキュベートします。
- 水を取り除き、1mLの新鮮なddH2O.を加え、10分間待ち、膨張の高原に達するまで10分ごとに水を交換し続けます。
注:サンプルの拡大は4.5倍まで達成可能です。ゲルは光学的に透明になる。
- イメージング
- ゲルから水を取り出し、直接顕微鏡を開始します。反転顕微鏡を用いて、主に空気対物(低倍率)を使用して、前膨張状態の画像化された細胞を見つける(ステップ4.3.4)。
- 40x(オイル/水)と63倍の目標に切り替えて、解像度を向上させます。興味のある波長で興奮し、カメラを介して画像を撮ります。
- 検証
- サンプルの概要画像を表示します。サンプル内の、手順 4.3.4 でイメージした構造と同じ構造を見つけて一致させます。検証に最適な信号対雑音比のチャンネルを使用します(図3 A-B)。
注: イメージング パラメータを調整して、非展開状態で取得したイメージと同様の明るさを実現します(ステップ 4.3.4)。 - ImageJ で展開前と後のイメージを回転およびシフトしてオーバーレイします。ImageJ の距離測定ツールを使用して、明確に識別可能な構造間の距離を測定します。少なくとも10種類の構造を測定します。
注: または、Python スクリプトを使用して、14で説明したように距離を測定します。 - 展開後/展開前の測定値を除算して、拡張係数を計算します。
- 歪みを判断するには、より高い数値絞りを持つ画像を撮影します(図4A-B)。これらの画像をオーバーレイし、ImageJ または15で説明されているように分析します。
注: 歪みの判定は、必ずしもすべてのサンプルで行う必要がありますが、必ずしも行う必要があります。
- サンプルの概要画像を表示します。サンプル内の、手順 4.3.4 でイメージした構造と同じ構造を見つけて一致させます。検証に最適な信号対雑音比のチャンネルを使用します(図3 A-B)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
この proExM プロトコルの概念とタイミングを図 1に示します。5日目、トランスフェクトされた細胞は、目的のタンパク質を標的とする蛍光抗体で固定され染色される(図1A、B)。6日目、AcXによる治療は、全てのタンパク質(フルオロフォアを含む)上でアミン基の形成を導く(図1A、B)12。ヒドロゲルの重合の際、これらのアミン基はヒドロゲル(Day 6)に共有結合する。ゲルの重合後、均質化(消化)は、細胞の構造タンパク質の破壊をもたらすプロテイナーゼKで行われる(Day 6,図1A,B)。蛍光標識抗体は、消化後にほとんど保存されたままです。構造タンパク質の破壊により、ヒドロゲルの透析は7日目にヒドロゲル内の細胞の等方性膨張をもたらす(図1A、B)。試料の撮像は、従来の蛍光顕微鏡で行われる(図1A)。拡張因子を決定し、歪みを排除するためのデータ検証を実行する必要があります (図 1A)。
細胞の伸張を等熱帯に行うためには、ゲル化工程が必須である。図2は、ゲル化チャンバの側面および上図を示す。ガラスカバースリップは、ゲル化チャンバのスペーサーを構築します(図2A1-3/C1-3)。固定セルと染色されたセルを持つカバーガラスは、セルを上方にスライドして上方に配置します(図2A4-C4)。ゲル化チャンバの蓋はパラフィルムで包まれ、気泡を含まない閉じ込めである(図2A5-C5)。
この ExM プロトコルは、最大 4 倍の拡張を可能にします。拡大因子を決定するには、拡大前後の画像細胞に不可欠である(図3A+B)。 不十分なアンカーと均質化は、細胞の歪みや破裂につながる可能性があります。図4A+Bは、異なる倍率画像における破裂細胞の代表的な例を示す。
この方法は、F-アクチンとアクチンアダプタタンパク質、例えば、ポドシンおよびネフリンの共局在化を調べるのに使用することができる(図5)。ポドシンは緑色で描かれ、アクチンは青でラベル付けされています(図5)。ニーフリンは緑色でマークされています。白い領域は、共局在を示します。
図1: このExMプロトコルの概念とタイミング (A) 「プロトコル」欄では、プロトコルの各ステップの概要が示されています。(A + B)細胞の播種およびトランスフェクション後、免疫蛍光標識(免疫標識)が行われる。(A + B)小分子AcX(赤い点)は、すべてのタンパク質に結合し、それらをヒドロゲル(アンカー)に固定します。(A + B)重合を介して、フルオロフォアを含むすべてのタンパク質は、AcXを介してヒドロゲル(重合)に共有結合される。(A + B)均質化は、構造マトリックスタンパク質の消化につながります。(A + B)水の透析によって拡張が達成される。(A)イメージングのイメージングと検証が実験を終了します。(A)プロトコル全体は、インキュベーションステップ(1日あたりの合計時間「合計時間」)を伴う7日間(カラム「日」)を必要としますが、実際のベンチタイムはそれぞれの列「ベンチタイム」に示されているようにはるかに少なくなります。14から変更。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゲル化チャンバーを構築する。4つの#1.5カバーストライプを持つガラススライドのサイドビュー(A1)とトップビュー(B1 + C1)。ガラススライドとカバースリップストライプの間に水滴を加えることで、ストライプはガラススライド(サイドビューA2、トップビュー B2、C2)に付着します。#1.5カバーストライプの水滴は、#1.5カバーストライプ(サイドビューA3、トップビューB3、C3)の上に敷設された#1.0カバーストライプの付着につながります。カバースリップのサンプルは鉗子を使用して長方形の中央に置かれる。ゲルは上にピペットで(側面図A4、上面図B4、C4)である。(A5)パラフィルムで包まれたカバースリップから造られる閉鎖されたふたを含む組み立てられたゲル化室の側面および上の眺め(B5およびC5)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:拡張前後の細胞(A)拡張前の細胞はアクチンに染色された。このボックスは、図 3Bの展開されたセルがどの領域にあるかを示します。(B)拡張後の細胞は、緑色の赤でアクチンとポドシンに染色された。ポドシンは、細胞周辺のアクチンと共に局所化する。スケールバー = 5 μm、拡張係数 = 2。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞の歪みと破裂(A+B)アクチンに対して免疫染色されたcos7細胞の代表的な顕微鏡画像(赤色)。細胞を固定し、染色し、固定し、消化し、拡大した。(A) 細胞の破裂。矢印は破裂した領域を示した。スケールバー = 5 μm、拡張係数 = 4。(B) 細胞の破裂と歪み。白い矢印は破裂した領域を示した。スケールバー = 5 μm、拡張係数 = 4。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ポドシンはネフリンとアクチンと共にローカライズする。ポドシン、アクチン、ネフリンについて免疫蛍光標識されたCos7細胞。(A)Cos7細胞は、Podocin(緑)、アクチン(青)、ネフリン(赤)にExMで染色した。ポドシンはアクチンとネフリンと共同ローカライズします。スケールバー = 200 nm、拡張係数 = 4。(B)で示された領域の拡大(A)、スケールバー= 40nm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| アンカーバッファ | 最終濃度 | ||
| ナフコ3 | 150mM | ||
| アクリルX、SE(AcX) | 0.1 mg/ml | ||
| モノマー溶液 | ストック溶液濃度 g/100 ml | 量 (ml) | 最終濃度(g/100 ml) |
| アクリレートナトリウム | 38 | 2.25 | 8.6 |
| アクリルアミド | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-メチレンビサクリアミド | 2 | 0.75 | 0.15 |
| 塩化ナトリウム | 29.2 | 4 | 11.7 |
| PBS | 10倍 | 1 | 1x |
| 水 | 0.75 | ||
| トータル | 9.4 | ||
| ゲル化液 | ストック溶液濃度 | 量(μl) | 最終濃度 (mg/ml) |
| モノマー溶液 | NA | 190 | NA |
| APS | 10% | 4 | 0.1 |
| テムド | >99% | 4 | 0.1 |
| 水 | NA | 2 | NA |
| トータル | 200 | ||
| 消化液 | 最終濃度 | ||
| トリス Cl, pH 8.0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8.0 | 0.5 M | ||
| トリトンX-100 | 0.005% | ||
| グアニジン HCL | 8 M | ||
| 水 | |||
| プロテアーゼ K | 4 U/ml |
表 1: ExM のソリューション
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
提示された方法は、研究者が細胞タンパク質、例えば、ポドシン、ネフリン、および細胞骨格成分、例えば、F-アクチンを可視化することを可能にする。このプロトコルでは、トランスフェクトされたcos7細胞がF-アクチンとスリットダイヤフラムタンパク質の相互作用を研究するモデルとして使用されています。残念なことに、不死化ポドサイト細胞株は、スリットダイヤフラムタンパク質19の十分な内因量を発現しない。
この方法により、細胞タンパク質は従来の蛍光顕微鏡を用いてナノスケール分解能で可視化できる。プロトコル内で最も重要なステップは、1)AcXを用いたヒドロゲルへのタンパク質アミン基の十分なアンカー、2)ヒドロゲルの適切な重合、3)消化のための最適なタイミング、および4)適合性フルオロフォアの選択である。
この方法では、細胞タンパク質をヒドロゲルに固定することが不可欠であり、膨張時にヒドロゲル内でタンパク質の位置を維持するためには必須です。AcXは、細胞および組織内のタンパク質のアミングループに結合する小分子です。AcXは、タンパク質を有する炭素炭素二重バンドを作成し、重合工程20においてタンパク質をヒドロゲルに組み込むことができる。AcXはまた、AcX治療の前に免疫蛍光抗体との標識を行うことができるように抗体を統合しています。アンカーが不十分な場合、細胞の破裂や歪みにつながる可能性があります。固定剤によるアミン群の修飾により、固定剤または固定時間を最適化する必要があります。また、保存が不十分であったり、アンカーの条件が最適化されていない場合は、破裂や歪みが生じる可能性があります。当社の経験に基づいて、AcXは3〜4ヶ月以上使用すると最適な効果を失います。
ゲルの重合は温度依存性である。したがって、ゲル化チャンバーにピペットする前に、重合溶液を氷の上に置い続けることをお勧めします。さらに、ゲル化工程の取り扱い時間は、早期のゲル形成を避けるために短く(5分未満)保つ必要があります。重合溶液を完全に混合することで、不均一な重合を防ぎます。気泡はサンプルに触れると膨張過程に影響を与え、さらに重合溶液を添加することで防止できます。
ヒドロゲル内に細胞タンパク質を組み込んだ後、拡張を確実にするために機械的均質化工程(または消化)が必要となる。熱や洗剤や酵素消化などの異なる方法が存在し、調査したサンプル12、14、20にカスタマイズする必要があります。このプロトコルの中で、プロテアーゼプロテアーゼKは酵素消化に使用される。プロテイナーゼKは、蛍光抗体12を含む他のほとんどのタンパク質を保存しながら、構造タンパク質を破壊するのに十分な用量で適用される。消化が不完全な場合、サンプルの膨張が不十分である。さらに、サンプルは膨張プロセス中に裂ける可能性があります(図3)。不十分なサンプル拡張が発生した場合は、水の交換をお勧めします。あるいは、酵素消化のための時間を調整するか、またはプロテイナーゼKの新しいアリコートを開くことができる。
サンプルが過剰に消化されると、蛍光シグナルは減少します。この場合、消化時間を短縮する必要があります。一般にExMでは、サンプル14の体積膨張により体積の単位当たりの蛍光信号強度が低下する。したがって、イメージング中の露光時間が長く考慮される必要があります。
ExM対応蛍光体を選択することが不可欠です。シアニン色素は重合工程13の間に分解される。バクテリオフィトクロムに基づく蛍光タンパク質も13に大きく破壊される。しかし、ほとんどのGFP様タンパク質は13.また、ストレプトアビジンは、事前拡張、低分子タグ13を介したS-ニトロライジングなどの翻訳後修飾を標識して適用することもできる。
ファロイジンは、アクチン細胞骨格を標的とする小さな標識分子であり、ExM21と互換性がない。ファロイジンの不十分なアンカーを克服するために、三価アンカー(TRITON)が導入された。このアプローチは、生体分子21の同時標的化、標識および移植を提供する。
この方法は、RNA分子(ExFish)22を染色するように修飾することができる。反復膨張顕微鏡(iExM)またはX10顕微鏡では、60-70nmの分解能は、第1の膨張ヒドロゲル内に第2の膨脹可能なゲルを塗布するか、または別のヒドロゲル15,16を用いて単一の膨張ステップを実施することによって、約25nmまで拡張することができる。超構造拡張顕微鏡(U-ExM)は、超構造元素(例えば、ミトクロンドリア、微小管)23に帰属を維持するタンパク質の超分解能を可能にする。ExFish (RNA と DNA) と proExM の方法の組み合わせも以前に22,24と同様に行われています。提示されたプロトコルは、スリットダイヤフラムタンパク質を調査するモデルとしてトランスフェクトされたcos7細胞を使用しています。我々は、他の常駐培養腎臓細胞、例えば、HEK293T細胞も同様にこのプロトコルに使用できることを期待する。細胞株によっては、異なる培養条件とトランスフェクション条件に対して調整が必要な場合があります。
ExMは、70 nm13の横空間分解能に達して約4倍に達することにより、免疫染色サンプルの分解能を高める。他の超解像技術と比較して、ExMは、従来の蛍光顕微鏡13,14上で行われる。したがって、ExM法14を実施するために高価な機器や特別に訓練された人員は必要ありません。すべての蛍光体がExMと互換性があるわけではないが、一般に、超解像度顕微鏡14に必要な光物性を有する最適化されたフルオロフォアを有する抗体が多数存在する。この方法の主な欠点は、ExM がライブ サンプル12、14と互換性がないことです。
将来的には、ヒドロゲルの化学組成を改善することは、さらに高い空間分解能12につながる可能性があります。異なるプロトコルの組み合わせは、このような高分解能12と同じサンプル内の複合体中のタンパク質、RNA、DNA、または脂質の可視化を可能にしてもよい。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ブランカ・ドゥヴンジャクとニコラ・クルの優れた技術支援に感謝したいと考えております。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
