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Articolo metodologico

In-Nucleus Hi-C nelle cellule di Drosophila

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DOI:

10.3791/62106

⸱

15 settembre 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

In questo articolo

Sommario

Il genoma è organizzato nello spazio nucleare in diverse strutture che possono essere rivelate attraverso tecnologie di cattura della conformazione cromosomica. Il metodo Hi-C in-nucleus fornisce una raccolta a livello di genoma di interazioni cromatiniche nelle linee cellulari di Drosophila, che genera mappe di contatto che possono essere esplorate a risoluzione megabase a livello di frammento di restrizione.

Abstract

Il genoma è organizzato in domini topologicamente associanti (TAD) delimitati da confini che isolano le interazioni tra domini. In Drosophila, i meccanismi alla base della formazione e dei confini di TAD sono ancora in fase di studio. L'applicazione del metodo Hi-C nel nucleo qui descritto ha contribuito a sezionare la funzione dei siti di legame delle proteine architetturali (AP) ai confini TAD isolando il gene Notch. La modificazione genetica dei confini di dominio che causano la perdita di AP provoca la fusione TAD, difetti trascrizionali e alterazioni topologiche a lungo raggio. Questi risultati hanno fornito prove che dimostrano il contributo degli elementi genetici alla formazione dei confini del dominio e al controllo dell'espressione genica in Drosophila. Qui, il metodo Hi-C in-nucleus è stato descritto in dettaglio, che fornisce importanti punti di controllo per valutare la qualità dell'esperimento insieme al protocollo. Vengono inoltre mostrati i numeri richiesti di letture di sequenziamento e coppie Hi-C valide per analizzare le interazioni genomiche a diverse scale genomiche. L'editing genetico mediato da CRISPR/Cas9 di elementi regolatori e la profilazione ad alta risoluzione delle interazioni genomiche utilizzando questo protocollo Hi-C in-nucleus potrebbero essere una potente combinazione per lo studio della funzione strutturale degli elementi genetici.

Introduzione

Negli eucarioti, il genoma è diviso in cromosomi che occupano territori specifici nello spazio nucleare durante l'interfase1. La cromatina che forma i cromosomi può essere divisa in due stati principali: uno di cromatina accessibile che è trascrizionalmente permissiva e l'altro di cromatina compatta che è trascrizionalmente repressiva. Questi stati di cromatina si segregano e raramente si mescolano nello spazio nucleare, formando due compartimenti distinti nel nucleo2. Alla scala sub-megabase, i confini separano i domini delle interazioni cromatiniche ad alta frequenza, chiamati TAD, che segnano l'organizzazione cromosomica3,4,5. Nei mammiferi, i confini TAD sono occupati dalla coesina e dal fattore di legame CCCTC (CTCF)6,7,8. Il complesso della coesina estrude la cromatina e si ferma nei siti di legame CTCF che vengono disposti in un orientamento convergente nella sequenza genomica per formare anelli di cromatina stabili9,10,13,14. L'interruzione genetica del sito di legame del DNA CTCF ai confini o la riduzione dell'abbondanza di CTCF e della proteina coesina provoca interazioni anormali tra elementi regolatori, perdita di formazione di TAD e derregolazione dell'espressionegenica 9,10,11,13,14.

In Drosophila, i confini tra i TAD sono occupati da diversi AP, tra cui il fattore 32 kDa associato all'elemento limite (BEAF-32), la proteina legante Motif 1 (M1BP), la proteina centrosomiale 190 (CP190), soppressore dell'ala pelosa (SuHW) e CTCF, e sono arricchiti in modificazioni isoniche attive e polimerasi II16,17,18. È stato suggerito che in Drosophila, i TAD appaiono come conseguenza della trascrizione13,17, 19e l'esattoruolodegli AP indipendenti nella formazione dei confini e nelle proprietà di isolamento è ancora in fase di studio. Pertanto, se i domini in Drosophila sono l'unica conseguenza dell'aggregazione di regioni di stati trascrizionali simili o se gli AP, incluso il CTCF, contribuiscono alla formazione dei confini rimane da caratterizzare completamente. L'esplorazione dei contatti genomici ad alta risoluzione è stata possibile attraverso lo sviluppo di tecnologie di cattura della conformazione cromosomica abbinate al sequenziamento di nuova generazione. Il protocollo Hi-C è stato descritto per la prima volta con la fase di legatura eseguita "insoluzione" 2 nel tentativo di evitare prodotti di legatura spuri tra frammenti di cromatina. Tuttavia, diversi studi hanno indicato la realizzazione che il segnale utile nei dati proveniva da prodotti di legatura formati in nuclei parzialmente llysed che non erano insoluzione 20,21.

Il protocollo è stato quindi modificato per eseguire la legatura all'interno del nucleo come parte dell'esperimento Hi-C a cellula singola22. Il protocollo Hi-C in-nucleus è stato successivamente incorporato nella popolazione cellulare Hi-C per produrre una copertura più coerente su tutta la gamma di distanze genomiche e produrre dati con meno rumore tecnico23,24. Il protocollo, qui descritto in dettaglio, si basa sul protocollo Hi-C23, 24 in-nucleus di popolazione ed è stato utilizzato per studiare le conseguenze della rimozione genetica di motivi leganti il DNA per CTCF e M1BP da un confine di dominio al locus del gene Notch in Drosophila25. I risultati mostrano che l'alterazione dei motivi di legame del DNA per gli AP al confine ha conseguenze drastiche per la formazione del dominio di Notch, difetti topologici più grandi nelle regioni che circondano il locus di Notch e la derregolazione dell'espressione genica. Ciò indica che gli elementi genetici ai confini del dominio sono importanti per il mantenimento della topologia del genoma e dell'espressione genica in Drosophila25.

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Protocollo

1. Fissazione

  1. Inizia con 10 milioni di cellule Schneider line 2 plus (S2R+) per preparare 17,5 mL di sospensione cellulare in mezzo Schneider contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) a temperatura ambiente (RT).
  2. Aggiungere formaldeide priva di metanolo per ottenere una concentrazione finale del 2%. Mescolare e incubare per 10 minuti a RT, avendo cura di mescolare ogni minuto.
    NOTA: La formaldeide è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate e lavorare nella cappa aspirante.
  3. Spegnere la reazione aggiungendo glicina per ottenere una concentrazione finale di 0,125 M e mescolare. Incubare per 5 minuti a RT, seguiti da 15 minuti sul ghiaccio.
  4. Centrifugare per 400 × g a RT per 5 min e poi per 10 min a 4 °C; scartare il surnatante. Rispenare accuratamente il pellet in 25 ml di soluzione salina fredda tamponata con 1x fosfato.
  5. Centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C, quindi scartare il surnatante.
    NOTA: se si continua con il protocollo, andare al passaggio 2.1 per la lisi; in caso contrario, congelare il pellet nel liquido N2 e conservare il pellet a -80 °C.

2. Lisi

  1. Spesesere le cellule in 1 mL di tampone di lisi ghiacciato (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% di tensioattivo non ionico (vedere la Tabella dei materiali);10 mM NaCl; 1x inibitori della proteasi) e regolare il volume a 10 mL con tampone di lisi ghiacciato. Regolare il volume per ottenere una concentrazione di 1 × 106 celle/ml. Incubare su ghiaccio per 30 min, mescolando ogni 2 min invertendo i tubi.
  2. Centrifugare i nuclei a 300 × g per 5 minuti a 4 °C, quindi scartare con cura il surnatante. Lavare il pellet 1x con 1 mL di tampone di lisi fredda e trasferirlo in un tubo di microcentrifuga. Lavare il pellet 1x con 1 mL di buffer di restrizione freddo 1,25x e risusciere ogni pellet di cella in 360 μL di tampone di restrizione 1,25x.
  3. Aggiungere 11 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% per tubo (concentrazione finale dello 0,3%), mescolare accuratamente mediante pipettaggio e incubare a 37 °C per 45 minuti, agitando a 700-950 giri/min. Pipettare su e giù per interrompere i grumi un paio di volte durante l'incubazione.
  4. Spegnere la SDS aggiungendo 75 μL di tensioattivo non ionico (soluzione al 10%, vedere la Tabella dei materiali)per tubo (concentrazione finale dell'1,6%) e incubare a 37 °C per 45 min, agitando a 950 giri/min. Pipettare su e giù un paio di volte per interrompere i grumi durante l'incubazione.
    NOTA: se i grumi sono grandi e difficili da interrompere, ridurre la velocità di rotazione a 400 giri / min durante i trattamenti SDS e tensioattivi. Se i grumi sono difficili da disaggregare mediante pipettaggio, dividere il campione in due; regolare i volumi di buffer di restrizione, SDS e tensioattivo; e procedere con la permeabilizzazione. Quindi, ruotare i nuclei alla velocità minima (200 × g),scartare con cura il surnatante, raggruppare i campioni insieme in un buffer di restrizione 1X e procedere con la digestione. Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione non digerito (UD).

3. Digestione enzimatica

  1. Digerire la cromatina aggiungendo 200 unità (U) di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per un periodo che va da 4 ore a una notte durante la rotazione (950 giri/min).
  2. Il giorno successivo, aggiungere altri 50 U di Mbo I per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore durante la rotazione (950 giri/min).
  3. Inattivare l'enzima incubando i tubi a 60 °C per 20 min. Posizionare i tubi sul ghiaccio.
    NOTA: Prelevare un'aliquota di 10 μL come campione digerito (D).

4. La biotinilazione delle estremità del DNA

  1. Per riempire le sporgenze del frammento di restrizione ed etichettare le estremità del DNA con biotina, aggiungere 1,5 μL ciascuno di 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL di 0,4 mM di biotina dATP, 17,5 μL di tampone Tris a basso EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] e 10 μL di 5 U / μL di Klenow (DNA polimerasi I grande frammento) a tutti i tubi. Mescolare con cura e incubare per 75 minuti a 37 °C. Agitare a 700 giri / min ogni 10 s per 30 s. Posizionare tutti i tubi sul ghiaccio mentre si prepara la miscela di legatura.

5. Legatura

  1. Trasferire ogni miscela di cromatina digerita in un tubo separato da 1 mL con miscela di legatura (100 μL di tampone di legatura 10x, 10 μL di albumina sierica bovina da 10 mg/mL, 15 U di DNA ligasi T4 e 425 μL di acqua a doppia distillazione [ddH2O]). Mescolare accuratamente con un leggero pipettaggio e incubare durante la notte a 16 °C.

6. Inversione del reticolare e purificazione del DNA

  1. Degradare le proteine aggiungendo 50 μL di 10 mg/mL di proteinasi K per tubo e incubare a 37 °C per 2 ore. Invertire i collegamenti incrociati aumentando la temperatura a 65 °C e incubare durante la notte.
  2. Degradare l'RNA aggiungendo 20 μL di 10 mg/mL di RNasi A e incubare a 37 °C per 1 ora.
  3. Eseguire l'estrazione del fenolo:cloroformio seguita dalla precipitazione dell'etanolo.
    1. Aggiungere 1 volume di fenolo-cloroformio e mescolare accuratamente per inversione per ottenere una fase bianca omogenea.
      NOTA: Il fenolo è una sostanza chimica pericolosa. Seguire le norme di salute e sicurezza appropriate. Lavora nella cappa aspirante.
    2. Centrifuga a 15.000 × g per 15 min. Trasferire la fase acquosa in un tubo microcentrifuga fresco da 2 ml. Eseguire una retro-estrazione dello strato inferiore con 100 μL di tampone TLE e trasferire la fase acquosa nello stesso tubo da 2 mL.
    3. Precipitare il DNA aggiungendo 2 volumi di alcol etilico al 100% (EtOH), 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M e 2 μL di glicogeno da 20 mg/mL. Incubare a -20 °C per un periodo che va dalle 2 ore alla notte.
    4. Girare a 15.000 × g per 30 minuti a 4 °C e lavare il pellet 2 volte con etOH al 70% ghiacciato. Asciugare i pellet a RT e ricaspenare in 100 μL di tampone TLE. Quantificare il DNA utilizzando un colorante fluorogenico che si lega selettivamente al DNA e un fluorometro secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
      NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i prodotti di legatura a 4 °C per il breve periodo o a -20 °C a lungo termine. Utilizzare un'aliquota (100 ng) del materiale come campione legato (L) per il controllo di qualità.

7. Valuta la qualità del modello Hi-C

  1. Controlli qualitativi di digestione e legatura
    1. Purificare il DNA dalle aliquote UD e D invertendo i collegamenti incrociati ed eseguire l'estrazione fenolo:cloroformio e la precipitazione dell'etanolo come descritto sopra.
    2. Caricare 100 ng di campioni UD, D e L in un gel di acarosio all'1,5%. Cerca uno striscio centrato intorno a 500 bp nel campione D rispetto a una banda ad alto peso molecolare per il campione L (vedi risultati rappresentativi).
  2. Controllo quantitativo dell'efficienza digestiva
    NOTA: per valutare l'efficienza della digestione in modo più accurato, utilizzare i campioni UD e D come modelli per eseguire reazioni quantitative a catena della polimerasi (qPCR) utilizzando primer progettati come segue.
    1. Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA contenente il sito di restrizione del DNA per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I nel presente protocollo), chiamato R nella formula nel passaggio 7.2.3.
    2. Progettare una coppia di primer che amplifichi un frammento di DNA di controllo che non contiene il sito di restrizione per l'enzima utilizzato per la digestione (Mbo I per il presente protocollo), chiamato C nella formula nel passaggio 7.2.3.
    3. Utilizzare i valori di soglia del ciclo (valori Ct) dell'amplificazione per calcolare l'efficienza di restrizione secondo la formula mostrata di seguito:
      % Restrizione = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Dove CtR si riferisce al valore Ct del frammento R e CtC si riferisce al valore Ct del frammento C per il campione D e il campione UD.
      NOTA: la percentuale di restrizione riflette l'efficienza dell'enzima di restrizione che scinde il frammento di DNA (R) ristretto rispetto a un frammento di DNA di controllo (C) che non contiene il sito del DNA di restrizione. Si raccomanda un'efficienza di restrizione dell'≥ dell'80%.
  3. Rilevamento di interazioni note
    1. Eseguire la PCR per amplificare un controllo di legatura interno per esaminare le interazioni a corto raggio e/ o medio o lungo raggio (vedere risultati rappresentativi).
    2. In alternativa, progettare primer per amplificare un prodotto di legatura in cui i primer sono in orientamento avanti-avanti o indietro-indietro in frammenti di restrizione adiacenti.
  4. Controllo del riempimento e dell'etichettatura della biotina
    1. Verificare la marcatura Hi-C e l'efficienza di legatura mediante amplificazione e digestione di un'interazione nota o di un prodotto di legatura tra frammenti di restrizione adiacenti nel genoma, come descritto sopra.
      NOTA: Il riempimento e la legatura riusciti del sito Mbo I (GATC) generano un nuovo sito per l'enzima di restrizione Cla I (ATCGAT) alla giunzione di legatura e rigenerano il sito Mbo I.
    2. Digerire il prodotto PCR con Mbo I, Cla I o entrambi. Dopo aver eseguito i campioni su un gel all'1,5-2%, stimare il numero relativo di giunzioni di legatura 3C e Hi-C quantificando l'intensità delle bande tagliate e nontagliate 26.
      NOTA: si desidera un'efficienza del > il 70% (vedere risultati rappresentativi).

8. Sonicazione

  1. Sonicare i campioni per ottenere frammenti di DNA da 200-500 bp. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo (vedi tabella dei materiali),diluire il campione (da 5 a 10 μg) in 130 μL di ddH2O per tubo e impostare lo strumento su sonicare a 400 bp: livello di riempimento: 10; fattore di dazio: 10%; potenza incidente di picco (w): 140; cicli per scoppio: 200; tempo (i): 80.

9. Rimozione della biotina / riparazione finale

NOTA: I passaggi mostrati di seguito sono regolati per 5 μg di DNA Hi-C.

  1. Per eseguire la rimozione della biotina, trasferire il campione (130 μL) in un tubo microcentrifuga fresco. Aggiungere 16 μL di tampone di legatura 10x, 2 μL di dATP 10 mM, 5 μL di T4 DNA polimerasi (15U) e 7 μL di ddH2O (160 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.
  2. Aggiungere 5 μL di 10 mM dNTPs, 4 μL di tampone di legatura 10x, 5 μL di polinucleotide chinasi T4 (10 U/μL), 1 μL di Klenow e 25 μL di ddH2O (200 μL di volume totale). Incubare a 20 °C per 30 min.

10. Selezione delle dimensioni

  1. Per selezionare frammenti per lo più nell'intervallo di dimensioni 250-550 bp, eseguire la selezione sequenziale delle dimensioni dell'immobilizzazione reversibile in fase solida (SPRI) prima con 0,6x, seguita da 0,90x secondo le istruzioni del produttore, ed eluire il DNA utilizzando 100 μL di TLE.

11. Pulldown di biotina / A-tailing / legatura dell'adattatore

NOTA: Eseguire i lavaggi risussoscendendo le perle magnetiche vorticosamente, ruotare i campioni per 3 minuti su una ruota rotante, quindi ruotare brevemente il campione e posizionarlo sul supporto magnetico. Lasciare che le pere si attacchino al magnete, scartare il surnatante e procedere con la successiva fase di lavaggio. Eseguire i lavaggi a 55 °C su un termoblotto con rotazione al posto della ruota rotante.

  1. Portare il volume finale a 300 μL per campione con TLE per il pull-down. Preparare i tamponi per il lavaggio delle perle: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x Tampone No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Utilizzare 150 μL di perle magnetiche legate alla streptavitina (vedere la Tabella dei materiali)per biblioteca. Lavare le perle 2x con 400 μL di 1x TB. Quindi sospendare le perle in 300 μL 2x NTB.
  3. Mescolare le perle con il materiale Hi-C da 300 μL e incubare a RT per 30 minuti su una ruota rotante per consentire il legame della biotina alle perle di streptavicina.
  4. Lavare le perle con 400 μL di 0,5x TB e incubare a 55 °C per 3 min, ruotando a 750 giri/min. Lavare le perle in 200 μL di 1x buffer di restrizione.
  5. Riespendare le perle in 100 μL di miscela di coda dATP (5 μL di 10 mM dATP, 10 μL di tampone di restrizione 10x, 5 μL di Klenow exo- e 80 μL di ddH2O). Incubare a 37 °C per 30 min.
  6. Rimuovere il surnatante, lavare le perle 2x con 400 μL di 0,5x TB incubando a 55 °C per 3 min e ruotando a 750 rpm.
  7. Lavare le perle con 400 μL di 1x NTB e poi con 100 μL di 1x tampone di legatura.
  8. Risuscimere le perle in 50 μL di tampone di legatura 1x e trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Aggiungere 4 μL di adattatori in PE preittidati (15 μM di stock) e 2 μL di T4 ligasi (400 U/μL, cioè 800 U/tubo); incubare a RT per 2 ore.
    NOTA: Pre-ricottura degli adattatori aggiungendo volumi uguali di entrambi gli adattatori PE 1.0 e PE 2.0 (stock da 30 μM) e incubando per 10 minuti a RT (vedi la Tabella dei materiali).
  9. Ricatturisci le perle rimuovendo il surnatante e lavando le perle 2x con 400 μL di TB. Lavare le perle con 200 μL di 1x NTB, quindi con 100 μL di 1x buffer di restrizione, e risospendare le perle in 40 μL di 1x buffer di restrizione.

12. Amplificazione PCR

  1. Impostare PCR di 25 μL di volume con 5, 6, 7 e 8 cicli. Per ogni PCR, utilizzare:
    Ricetta di reazione
    Pere Hi-C2,5 μL
    10 μM PE PCR primer 1 (Tabella dei materiali)0,75 μL
    10 μM PE PCR primer 2 (Tabella dei materiali)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    5x tampone di reazione5 μL
    DNA polimerasi0,3 μL
    ddH2O14,65 μL
    Totale25 μL
    CicliTemperaturaOre
    198 °C30 anni
    n cicli98 °C10 s
    65 °C30 anni
    72 °C30 anni
    172 °C7 minuti

13. Amplificazione PCR finale

  1. Eseguire l'amplificazione PCR finale utilizzando le stesse condizioni sopra descritte e il numero di cicli selezionati. Dividere il campione utilizzando 5 μL di perle Hi-C come modello in reazioni da 50 μL.
  2. Raccogliere tutte le reazioni PCR e trasferirle in un tubo fresco. Utilizzare il magnete per rimuovere le pere di streptavitina e recuperare il surnatante (prodotti PCR). Trasferire le perle in un tubo fresco, lavare le perle come indicato al punto 11.2.9 e conservare in 1x buffer di restrizione a 4 °C come backup.
  3. Purificare i prodotti PCR utilizzando 0,85 volte il volume delle perle SPRI secondo le istruzioni del produttore. Elute con 30 μL di tampone TLE.
  4. Quantificare la libreria Hi-C utilizzando uno strumento fluorometrico e confermare la qualità della libreria mediante elettroforesi capillare basata su chip.
  5. Come ultimo punto di controllo di qualità, utilizzare 1 μL della libreria Hi-C come modello per eseguire una reazione PCR utilizzando 10 cicli utilizzando le stesse condizioni descritte nel passaggio 12.1. Dividere il prodotto PCR in due tubi microcentrifuga: digerire uno con Cla I e lasciare l'altro non digerito come controllo. Eseguire i prodotti in un gel di acarosio all'1,5-2% (vedere risultati rappresentativi).
  6. Procedere al sequenziamento accoppiato a 50 bp o 75 bp su una piattaforma di sequenziamento adeguata.

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Risultati

Di seguito sono descritti i risultati di un protocollo Hi-C di successo (vedere un riepilogo del flusso di lavoro del protocollo Hi-C nella Figura 1A). Ci sono diversi punti di controllo della qualità durante l'esperimento Hi-C in-nucleus. Le aliquote del campione sono state raccolte prima (UD) e dopo (D) la fase di restrizione della cromatina e dopo la legatura (L). I collegamenti incrociati sono stati invertiti e il DNA è stato purificato eseguito su un gel di agarosio. Uno striscio di 200...

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Discussione

Il metodo Hi-C in-nucleus qui presentato ha permesso l'esplorazione dettagliata della topologia del genoma di Drosophila ad alta risoluzione, fornendo una visione delle interazioni genomiche a diverse scale genomiche, dai loop di cromatina tra elementi regolatori come promotori e potenziatori a TAD e identificazione di grandi compartimenti25. La stessa tecnologia è stata applicata in modo efficiente anche ai tessuti dei mammiferi con alcune modifiche33. Ad esempio, quando s...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal numero di sovvenzione DELL'UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) IN207319 e dal numero di sovvenzione del Consiglio nazionale della scienza e della tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. è uno studente di master supportato dal Consiglio Nazionale della Scienza e della Tecnologia (CONACyT) CVU numero 968128.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di paraformaldeide al 16% (vol/vol)Agar ScientificR1026
Biotina-14-dATPInvitrogenCA1524-016
Enzima ClaINEBR0197S
COVARIS UltrasuonatoreCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Siero fetale bovino (FBS) filtrato sterileSigmaF9665
Klenow Dna PolI grande frammentoNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S Tampone
di legaturaNEBB020S
Enzima MboINEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Tensioattivo non ionico per l'aggiunta in tampone di lisi
Adattatore PE 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
adattatore 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR primer 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR primer 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCTCT-3'Fenolo
: Cloroformio:Alcool isoamilico 25:24:1SIGMAP2069
Primer 1 (interazione nota, Figura 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (interazioni note, Figura 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Compresse
da cocktail con inibitore della proteasiRoche4693132001
Proteinasi KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAsiRoche10109142001
SPRI PerlineBeckmanB23318
T4 DNA ligasiInvitrogen15224-025
T4 DNA polimerasiNEBM0203S
T4 polinucleotide chinasi (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SDNA polimerasi
Triton X-100Tensioattivo non ionico per l'estinzione di SDS

Riferimenti

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
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