Summary
우리는 신생아 심장 대식세포 분리 및 이식을 위한 프로토콜을 성인 마우스 심혼으로, 심장 수리를 승진시키는 유망한 방법이 될 수 있었습니다.
Abstract
부상당한 신생아 심근에서 대식세포는 심근세포 증식과 혈관 신생을 촉진하고 심장 재생을 촉진합니다. 본 연구는 상해에 의해 모집된 신생아 심장 대식세포의 이식이 심장 기능 및 심근세포 증식의 향상과 심근 경색 후에 성인 심장 재생을 승진한다는 것을 제시합니다. 결과는 신생아 심장 대식세포 이식이 심장 상해 처리를 위한 유망한 전략이 될 수 있었다는 것을 표시합니다. 여기서, 우리는 정포 절제술 부상 신생아 마우스 심혼에서 신생아 심장 대식세포의 격리, 심근 경질 경산 마우스로 대식세포이식, 대식세포 이식 후 심장 재생의 추정을 포함하여 기술적 세부 사항을 제공합니다.
Introduction
심장 재생은 심장 손상 후 심장 기능을 회복하고 심장 마비1,2,3로부터보호하는 유망한 전략이다. 심근 손상 후, 대식세포는 부상당한 심혼에 침투하고 신생아 심장재생4,5,6동안 중요한 요인으로 탐구되었습니다. 괴사 세포 파편을 제거하고 염증을 유도하는 것 외에도, 대식세포는 신생아 마우스 심근 경색 후 혈관 신생5 및 심근 세포 증식7을 촉진합니다.
우리의 이전 연구는 부상당한 신생아 심장에서 분리된 신생아 심장 대식세포의 이식이 성인 심장 재생을 향상시킨다는 것을 보여줍니다7,신생아 심장 대식세포 이식이 심장 상해를 치료하는 유망한 전략이 될 수 있음을 나타내는. 여기서는 정포 절제술-신생아 마우스 심혼으로부터 신생아 심장 대식세포의 분리, 심근경색 성인 마우스에 대식세포 이식, 대식세포 이식 후 심장 재생의 추정 등 기술적 세부 사항을제공한다(도 1).
Protocol
모든 실험은 실험실 동물의 사용 및 관리를위한 가이드에 따라 수행되었다. 모든 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 후와이 병원, 중국 의학 과학 아카데미에 의해 승인되었다. 무균 기술은 수술 부위의 오염을 방지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 필요합니다.
1. 신생아 1 일 Cx3cr1 GFP / + 마우스(C57BL / 6 배경)에서 에피칼 절제술 작업
- 마취
- 모든 마우스 새끼를 케이지에서 꺼내 깨끗한 드라이 박스에 넣습니다.
- 각 마우스를 얼음에 약 2-3분 동안 포함시킴을 가했습니다. 동상을 방지하기 위해 얼음과 마우스 새끼 사이에 라텍스 또는 거즈와 같은 얇은 장벽이 있는지 확인하십시오.
- 창백한 피부, 사지 운동 부족, 페달 반사 부족 등 다음과 같은 징후를 관찰하여 충분한 마취를 식별합니다.
- 소라코토미
- 마취를 유지하기 위해 -20 °C에서 하룻밤 동안 청동 작동 플랫폼을 미리 식힙.
- 마취 된 마우스를 얼음 상자에서 꺼내 청동 작동 플랫폼에 놓습니다. 수술 플랫폼에 마우스를 의료 용 접착제 테이프를 사용하여 supine 위치에 고정하십시오.
- 고정 관상 아래에 마우스와 운영 플랫폼을 넣어.
- 베타딘에 담근 준비 패드와 70% 알코올 또는 제도적 정책과 일치하여 마우스 가슴을 소독하십시오.
- 가슴 구멍의 네 번째 늑간 영역에서 1cm 절단된 피부를 절인 다음 심장에 접근할 때까지 미세 수술 가위를 사용하여 늑간 근육을 분리합니다.
- 심장이 기계적 손상없이 가슴 밖으로 외부 될 때까지 두 개의 집게의 도움으로 가슴과 복부를 번갈아 누릅니다.
- 심장을 고정하기 위한 자연스러운 고정으로 작은 절개 아래와 위에 갈비뼈를 놓습니다.
- 심실 정점 절제술
- 좌심실의 정점을 찾습니다. 입체 현미경으로 iridectomy 가위를 사용하여 심실 정점 조직의 직경 1mm를 자른다.
- 왼쪽 심실 챔버가 노출되어 있는지 확인하고 스며들기 시작합니다.
- 면봉을 사용하여 심장을 가슴 구멍으로 부드럽게 누릅니다.
- 8-0을 사용하여 근육, 갈비뼈 및 피부를 봉합합니다. 프롤렌 봉합사.
- 조작 후 마우스를 철저히 청소하십시오.
- 수술 후 관리
- 수술 플랫폼에서 마우스를 37°C 가열 담요로 전송하여 수술 직후 몸을 따뜻하게 합니다.
- 자발적인 호흡 복원, 창백한 피부색에서 분홍색으로 변하는 피부, 팔다리의 움직임 등 다음과 같은 징후를 관찰하여 마우스의 아나바이오시스를 확인합니다.
- 수술된 마우스를 회복한 후 어머니에게 다시 가져가십시오.
- 필요한 경우 수술된 마우스를 어머니의 중첩 재료로 섞습니다.
참고 : 한 번에 어머니에서 모든 1 일 된 새끼를 제거하고 모든 새끼가 복구 된 후 한 번에 모두 반환하는 것이 중요합니다.
2. 신생아 심장 대식세포 현탁액 준비
참고: 이러한 모든 실험 절차는 어두운 곳에서 멸균 조건에서 수행해야 합니다.
- 신생아 Cx3cr1GFP /+ 마우스의 심장을 수확 1 일 후 정류 절제술
- Cx3cr1GFP/+ 마우스를 정판 절제 후 하루 만에 안락사시합니다. 이산화탄소를 초과 사용하여 마우스를 순차적으로 참수하여 안락사를 적용하십시오.
- 가슴에서 심장을 꺼내 PBS와 함께 10cm 접시에 담그십시오.
- 혈관과 남은 결합 조직을 심실에서 잘라냅니다. 심장에서 멀리 오리큘러 부록과 유출 관을 잘라.
- 심장 박동을 중지 한 후, 마이크로 수술 가위를 사용하여 PBS 버퍼에서 1-2 mm3 조각으로 심장을 잘라(그림 2A).
- 신생아 마우스 심장 해리
- 수확된 심장 조직을 예열효소믹스(재료표)를함유한 튜브로 옮기고 튜브를 단단히 닫습니다.
- 튜브를 반전시키고 캡다운(그림2B)으로놓습니다.
- 신생아 심장 해리 프로그램(재료의 표)을 실행합니다.
- 프로그램이 완료된 후 해리소에서 튜브를 분리합니다.
- 튜브에 10% FBS로 7.5mL의 DMEM을 추가합니다.
- 서스펜션을 15mL 원심분리튜브(도2C)로필터링하고 이송한다. 세포 현탁액을 300 x g에서 5분간 원심분리합니다.
- 세포 용액 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 실온에서 2 분 동안 배양하십시오.
- 5-10mL의 PBS 버퍼를 서스펜션에 넣고 원심분리기를 300 x g에서 5분간 추가합니다.
- 10% FBS로 DMEM의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
- 신생아 심장 대식세포 격리
- FACS에 의해 GFP+ 신생아 심장 대식세포를 정렬합니다. 10% FBS를 가진 DMEM의 500 μL을 포함하는 멸균 관에 정렬된 대식세포를 수신합니다.
- GFP+ 대식세포(그림2D)를계산합니다. DMEM의 대식세포는 DMEM의 200 μL당 1 x 106 대식세포 농도에서 10% FBS로 대식대를 다시 일시 중단하여 나중에 주입합니다.
참고: GFP+ 대식세포의 수는 한 신생아 (대략 1 x 105);에서작습니다. 따라서, 적어도 10 신생아는 각 성인 마우스 주입에 대한 충분한 대식세포를 얻기 위해 사용되어야한다.
3. 신생아 심장 대식세포 이식
- 좌측 전방 관상 동맥8의결찰에 의해 성인(6-8주 령) 남성 C57BL/6 마우스에 심근경색 수술을 수행한다.
- 작동된 마우스를 37°C 가열 담요에 놓아 복구할 때까지 넣습니다.
- 정맥정맥을 통해 수술 후(약 6시간 후) 극한성 성마우스에 1 x 106 GFP+ 신생아 심장 대식세포가 있는 DMEM 200 μL을 정맥주사한다.
- 마우스를 깨끗한 케이지로 다시 보냅니다.
4. 결과 평가
- 사출 효율 유효성 검사
- 수술된 마우스를 마취하고 심근 경색 수술 후 7일 이내에 심장을 수확한다.
- 미리 냉각된 PBS 버퍼에 심장을 담급니다.
- 심장 조직을 4% 폴리포름알데히드로 흔들어 실온에서 72시간 동안 수정합니다.
- 디메틸벤젠과 에탄올에서 심장 조직을 탈수합니다.
- 파라핀에 심장 조직을 삽입하고 5 μm의 두께로 섹션으로 슬라이스.
- 표준 면역 형광 염색 프로토콜1을수행한다. α 액틴을 사용하여 심근세포를 표시하십시오.
- 이식을 받는 심장에서 GFP+ 대식세포를 감지합니다.
- 표준 면역 형광 염색 프로토콜1을수행한다. α-액틴 및 pH3를 사용하여 각각 심근세포 및 세포 증식을 표시합니다(그림3A).
- 이식 후 심장 수리 평가
- 수술 후 한 달 후 작동 된 마우스에 에코카디그래피를 사용1.
- 좌심실 배출 분획 및 분수 단축을 상이한 그룹에서 비교하여 심장 기능을 분석한다(도3B).
- 수술된 마우스를 마취하고 심장을 수확합니다.
- 4.1.2-4.1.5 단계를 반복합니다.
- 마슨의 염색 프로토콜을 수행합니다.
- 대식세포 주입 후 경색 영역을 분석한다(도3C).
Representative Results
여기에 설명된 프로토콜은 플로우차트(그림 1)로요약되어 있습니다. 우리는 1 일 된 Cx3cr1GFP / + 마우스에 대한 정계 절제술 작업을 수행했습니다. 도 2A에도시된 바와 같이, 신생아 Cx3cr1GFP/+ 마우스는 마취 후 스테레오스코프 하에서 수술 플랫폼에 고정되었다. 우리는 가슴에서 튀어 나오는 심장을 안내하는 기관으로 설정할 수있는 두 개의 집게의 도움으로 마우스 가슴과 복부에 교대로 압력을 가했습니다. 심장 재생에 영향을 미칠 수 있는 심장에 대한 추가 기계적 손상은 피해야 합니다. 심근의 작동을 용이하게 하는 주위 가슴 조직에 의해 심혼이 움직이지 않았습니다. 우리는 왼쪽 심실 챔버가 스며들기 시작했을 때 iridectomy 가위에 의해 절제된 정점 조직의 직경 1mm 미만을 절단하는 것이 적절하다는 것을 발견했습니다. 대식세포 이식8,9에대한 어포형 절제술 모델의 성공적인 유도가 필요하다.
신생아 심장 해리 프로토콜1 (도 2)에따라 GFP+ 대식대를 엄격하게 분류했습니다.
신생아 심장 대식세포는 격리 직후 심근 경색 성인 마우스 심장에 주입되었다. 대식세포 이식의 효율을 확인하기 위해, 주사 후 7일 만에 면역형광 염색을 수행했습니다. 결과는 GFP+ 대식세포가 신생아 심장 대식세포의 성공적인 이식을 나타내는 성인 심근 경각심 경각질 마우스 심혼에서 찾아볼 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 우리는 α 액틴과 pH3의 공동 면역 스테인닝을 고용했습니다. 공동 국소화는 심근세포 증식으로 간주되었다. 결과는 증식성 심근세포의 수가 대식세포 주입단에서 증가하여 이식 후 성인 심근세포 증식 능력이 향상되었음을나타낸다(도 3).
성인 마우스 심장 재생은 이식 후 1개월 후에 평가되었다. 우리는 성인 마우스에 심초음파를 수행하고 대식세포 주사가 심근 경색 후 심장 기능을 향상시킬 수 있음을 발견했다. 마슨의 염색이 수행되었고, 그 결과는 신생아 심장 대식세포 이식 후 경색 부위가 현저하게 감소되었다는 것을 보여주었다(도 3). 이러한 모든 결과는 신생아 심장 대식세포 이식이 성인 마우스 심장 재생및 심근세포 증식을 촉진한다는 것을 보여주었습니다.
그림 2: 대식세포 격리 이미지. A)하트는 작은 조각으로 잘라. B)마우스 하트가 해리됩니다. C)서스펜션은 15mL 원심분리기 튜브로 여과되고 전달된다. D)신생아 심장 대식세포의 수가 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 신생아 심장 대식세포 이식은 성인 심장 재생을 촉진합니다. A)(왼쪽) 면역 형광 이미지는 증식 심근세포 (화살표, pH3 녹색, α 액틴 빨간색)을 보여줍니다. (오른쪽) 통계 분석에 따르면 대식세포 이식 후 심근세포 증식이 증가합니다. B)(왼쪽) 심초음파 이미지는 심근 경색 후 1개월 후 성인 마우스에서 심장 기능을 보여 준다. (오른쪽) 통계 분석에 따르면 대식세포 이식 후 심장 기능이 향상됩니다. C)마슨의 염색은 심근 경색 후 1개월 후 성인 마우스의 경색 부위를 나타낸다. (오른쪽) 통계 분석에 따르면 Mφ, 대식세포 이식 후 경색 영역이 감소하는 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서, 우리는 성인 마우스 심장 재생을 촉진하기 위해 신생아 심장 대식세포를 준비, 취득 및 이식하는 효과적인 접근 법을 제공합니다.
정포 절제술은 심장 재생을 자극하는 간단하고 효과적인 작업입니다. 우리는 수술(10)에관련된 동물의 최대 생존율을 보장하기 위해 apical 절제술의 세부 사항을 최적화했습니다. 마취 시간은 저체온증으로 인한 사망으로 이어지는 3 분 이상, 또는 수술 중에 과도한 출혈을 일으키는 2 분 미만이어야합니다. 표준 정압 절제술은 정점 조직의 약 1.5 mm 직경을 절단하기로 되어 있었다. 그러나, 여기서 수술의 목적은 심장 재생 과정에서 풍부한 대식세포 침투를 자극하는 것이었다. 직경 1.5mm 미만의 절제술은 최대 생존율과 효과적인 대식세포 모집을 동시에 보장할 수 있으므로 허용되었다. 작업자의 숙련도만이 생존율에 영향을 미쳤으며, 수술된 마우스는 장기간 작동 기간을 견딜 수 없었다. 운영자는 5분 이내에 전체 절차를 완료해야 합니다.
우리의 이전 연구에서, 우리는 급성 염증신생아 심장 재생을 촉진 발견. 신생아 마우스 심장으로 면역원진 자모산 A 입자의 자궁 내분비 미세 주입은 심근세포증식6를촉진할 수 있다. 최근에는 지모산 A, 세포 이물질 및 동결/해동세포의 심부전 주사에 의해 자극되는 대식세포 침투가 심장 수리를 촉진할 수 있다고 주장하며, 급성 염증과 대식세포가심근세포로분화하는 줄기세포가 아닌 심장 수리에 필수적임을 확인했다. 사덱 외5는 대식세포가 혈관신생을 통해 신생아 심장 재생을 촉진할 수 있다고 보고했다. 최근 연구에 따르면 신생아 심장 대식세포 주사는 성인 심장 재생을 촉진하고 성인 심근세포 증식1,7의 능력을 증가시킬 수 있다고밝혔다. 신생아 심장 대식세포 이식은 성인 마우스 심장 재생을 촉진하는 유망한 전략일 수 있습니다. 여기에서 우리는 재생 응용 프로그램 개발에 더 많은 연구원을 돕고 심장 재생 메커니즘의 탐구를 돕기 위하여 프로토콜을 제시합니다.
Disclosures
이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 의학 과학 혁신 기금 (CIFMS, 2016-I2M-1-015), 중국의 국립 주요 연구 개발 프로젝트 (2019YFA0801500), 중국 국립 자연 과학 재단 (NSFC: 81970243, 81770308), 베이징 자연 과학 재단 (7172183, 7182140)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
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