Espianto di tessuto corneale suino per studiare l'efficacia degli antivirali Herpes Simplex Virus-1

Le persone che soffrono di infezioni oculari spesso incorrono in perdita della^{vista 1}. Con un'elevata sieroprevalenza in tutto il mondo, gli individui infetti da HSV soffrono di infezioni oculari ricorrenti che portano a cicatrici corneali, cheratite stromale e neovascolarizzazione^2,3,4,5. Le infezioni da HSV hanno anche dimostrato di causare meno frequentemente, una serie di condizioni gravi tra i pazienti immunocompromessi e non trattati come l'encefalite e la morbilità sistemica^6,7,8. Farmaci come aciclovir (ACV) e i suoi analoghi nucleosidici hanno mostrato un successo costante nel frenare l'infezione da HSV-1 e persino controllare la riattivazione, ma l'uso prolungato di questi farmaci è associato a insufficienza renale, anomalie fetali e incapacità di limitare l'emergere di resistenza ai farmaci ai ceppi virali in evoluzione^{9,10,11,12,13}. Le complessità associate alle infezioni oculari da HSV-1, sono state precedentemente studiate in vitro utilizzando monostrati e colture 3D di cellule corneali umane e in vivo utilizzando infezioni oculari murine o di coniglio. Mentre questi modelli in vitro forniscono dati significativi sulle componenti biologiche cellulari delle infezioni da HSV-1, tuttavia, non riescono a imitare l'intricata complessità del tessuto corneale e fanno poco per illuminare la diffusione dendritica del virus¹⁴. Al contrario, sebbene i sistemi in vivo siano più perspicaci nel mostrare la diffusione dell'infezione nelle cornee e le risposte di attivazione immunitaria durante l'infezione da HSV-1, vengono con l'avvertenza che richiedono investigatori addestrati e grandi strutture per la cura degli animali per trascurare gli esperimenti.

Qui usiamo le cornee suini come modello ex vivo per esaminare il sistema di ferite indotte dall'infezione da HSV-1. Sia la potenziale farmacologia di alcuni farmaci che la biologia cellulare e molecolare del sistema della ferita causata dall'infezione possono essere studiate attraverso colture di espianto tissutale. Questo modello può anche essere modificato per l'uso per altre infezioni virali e batteriche pure. In questo studio, le cornee suini sono state utilizzate per testare l'efficacia antivirale di una piccola molecola preclinica, BX795. L'uso di cornee suini è stato preferito a causa della facilità di accesso e dell'economicità. Inoltre, i modelli corneali suini sono buoni modelli di occhi umani con le cornee facili da isolare, adeguatamente dimensionate per l'infezione e la visualizzazione e robuste da gestire¹⁵. Le cornee suini sono anche paragonabili alla complessità dei modelli corneali umani sia nella permeabilità trans corneale che nell'assorbimento sistemico¹⁵. Utilizzando questo modello per lo studio, siamo stati in grado di chiarire come BX795 sia degno di ulteriori indagini come inibitore competente dell'infezione da virus HSV-1 e si aggiunge alla letteratura di classificarlo come potenziale composto antivirale a piccola molecola¹⁶.

Tutto il tessuto suino utilizzato in questo studio è stato fornito da un'organizzazione privata di terze parti e nessuna delle manipolazioni degli animali è stata eseguita dal personale dell'Università dell'Illinois a Chicago.

1. Materiali

1. Reagenti
   1. Utilizzare i seguenti reagenti per il test della placca: metilcellulosa in polvere, dmEM (Dulbecco's modified eagle' medium), siero bovino fetale (FBS), penicillina e streptomicina (P/S) per il test della placca.
   2. Utilizzare compresse di cristallo viola ed etanolo (grado di biologia molecolare) per preparare la soluzione di cristallo viola per il test della placca.
2. Vero cell growth media - DMEM whole media
   1. Aprire il flacone DMEM all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Rimuovere 55 ml di media dalla bottiglia usando una pipetta sierologica e scartarla. Aggiungi 50 ml di FBS di P / S a DMEM. Conservare in frigorifero a 4 °C.
3. Mezzi per il dosaggio della placca - Stock di mezzi metilcellulosa al 5%
   1. Misurare 2,5 g di polvere di metilcellulosa con un magnete di agitazione all'interno di una bottiglia di vetro da 500 ml e autoclave. Dopo che la bottiglia si è raffreddata a temperatura ambiente, prendere 500 mL di dmem intero contenente 50 mL di FBS e 5 mL di P / S e aggiungerlo al flacone di vetro contenente metilcellulosa.
   2. Mescolare a 4 °C per 2 giorni utilizzando un agitatore magnetico. Conservare in frigorifero a 4 °C.
4. Preparazione dei supporti per la cornea suina asportata
   1. Aprire un flacone MEM (Minimum Essential Media) all'interno del cappuccio di coltura del tessuto. Scartare 10 ml di MEM dalla bottiglia usando una pipetta sierologica.
   2. Aggiungere 5 mL di insulina-transferrina-selenio (ITS) e 5 ml di antibiotico antimicotico (AA) al fluido e conservare in frigorifero a 4°C.
5. Maestro e stock di lavoro di cristallo viola:
   1. Per preparare la soluzione stock di cristallo viola, aggiungere 1 g di polvere viola cristallina a 100 ml di etanolo al 20% in acqua. Questo stock (1% p / v cristallo viola) può essere conservato e utilizzato fino all'anno se conservato in un luogo buio.
   2. Per creare uno stock di lavoro da questo, aggiungere 50 ml di soluzione stock originale a 350 ml di acqua. Aggiungere 100 ml di etanolo a questa soluzione per produrre una soluzione di cristallo viola da 500 mL (0,1% p / v di cristallo viola).
      NOTA: entrambe queste soluzioni devono essere conservate al buio.

2. Procedura

1. Isolamento delle cornee suini da occhi interi¹⁷
   1. Dopo aver ricevuto gli occhi suini da un fornitore adatto, conservare sul ghiaccio se c'è un ritardo con l'elaborazione dei tessuti, come illustrato nella Figura 1.
   2. Assicurarsi che i dispositivi di protezione individuale siano utilizzati e indossati durante questa procedura per evitare contaminazioni e incidenti da fuoriuscita di umore vitreo.
   3. Spruzzare l'area di lavoro con etanolo al 70% per pulire e disinfettare. Per garantire che lo spazio di lavoro sia stabile, stendere un coperchio da banco e del nastro adesivo lungo i lati in modo sicuro, come illustrato nella Figura 2.
   4. Posizionare gli occhi suini sulla garza (Figura 3). Utilizzando una garza da 50 mm, tenere la sezione posteriore (Figura 4A) degli occhi suini come mostrato nella Figura 4B con una mano.
   5. Con un ago da 30 G, fare delicatamente un singolo colpo approssimativamente al centro della superficie epiteliale dell'occhio con attenzione e assicurarsi che non vi siano danni allo stroma (Figura 5). Il poke deve essere limitato all'epitelio (~100-200 μm) per evitare il coinvolgimento stromale.
   6. Usando una lama affilata sterilizzata, fai una piccola incisione sulla sclera a 1 mm di distanza dalla cornea. Tagliare il bordo della cornea assicurandosi che l'umore vitreo non perda usando un'azione rotante rapida e liscia della mano (Figura 6A). Tenendo la cornea sul bordo cornea-sclera con una pinzetta piatta, tagliare le restanti membrane di legame dell'occhio usando la lama (Figura 6B).
   7. Prendi la cornea e mettila in una piastra a 12 pozzetti sovrapposta a 2 ml di mezzo corneale. La cornea deve essere posizionata rivolta verso l'alto, dimostrata in una serie di passaggi nelle Figure 7A-D, Figura 8).
   8. Aggiungere 5 μL della soluzione virale contenente 5 x 10⁵ unità formanti placche (PFU) di 17 GFP al sito di strigliatura sulla superficie corneale. Posizionare la piastra a 12 pozzetti contenente cornee suini infette in un'incubatrice con il 5% di CO₂ per 72 ore.
   9. Spruzzare eventuali occhi aggiuntivi non utilizzati in esperimento con candeggina al 10% e smaltiti in modo sicuro in sacchetti a rischio biologico.
2. Visualizzazione
   NOTA: Il virus deve essere visualizzato ogni giorno prima dell'aggiunta di farmaci.
   1. Accendere lo stereomicroscopio e la sorgente luminosa a LED e consentire alla lampada della macchina di riscaldarsi prima di immaginare le cornee. Portare con attenzione la piastra di cornee allo strumento senza disturbare la soluzione. Modificare il filtro in modo che GFP (380-460 nm) venga utilizzato per esaminare i campioni. Impostare il tempo di esposizione su 500 ms per acquisire immagini.
   2. Per prima cosa, posiziona la piastra corneale sotto lo stereoscopio e cattura le immagini con l'ingrandimento più basso di 7,5x. Segui questo con una serie di immagini ad ingrandimento crescente (ad esempio, 15x, 25x, 35x) in modo tale che tutta la diffusione virale e la formazione di dendrite siano visualizzate chiaramente
   3. Assicurati di riportare le cornee infette nell'incubatore di colture tissutali e salva tutte le immagini che sono state scattate.
3. Quantificazione dell'infezione da virus
   NOTA: I titoli dei virus delle cornee suine devono essere valutati ogni giorno per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico.
   1. Per quantificare il virus, seminare cellule Vero ad una densità di 5 x 10⁵ di cellule per pozzo se si utilizza una piastra a 6 pozzetti come fatto in questo esperimento. Fallo un giorno prima dell'infezione. Incubare le cellule placcate durante la notte per assicurarsi che siano confluenti per la quantificazione del virus.
   2. Aliquota 500 μL di mezzi privi di siero in più tubi microcentrifugati. Inserire un tampone sterile con punta di cotone immerso nei tubi riempiti di supporti privi di siero. I tamponi di cotone devono essere immersi e bagnati per almeno 5 minuti prima dell'uso.
   3. Senza disturbare il supporto sottostante, trasportare la piastra corneale suina infetta in un armadietto di biosicurezza. Utilizzando i tamponi di cotone bagnati, effettuare 3 giri in senso orario e 3 giri in senso antiorario ad un diametro di 5 mm dal centro della cornea suina infetta senza applicare una pressione eccessiva.
   4. Inserire di nuovo il batuffolo di cotone nel tubo microcentrifuga riempito con media senza siero e ruotarlo in senso orario e antiorario 5 volte. La punta metallica del batuffolo di cotone deve essere tagliata corta in modo che si adatti interamente al tubo di microcentrifuga e il coperchio possa essere chiuso.
   5. Posizionare il tubo di microcentrifuga contenente la punta di cotone tamponata su una macchina a vortice e vortice ad alta velocità per 1 minuto.
   6. Eseguire la quantificazione del virus tramite un test della placca su questi campioni.
      NOTA: questa fase di quantificazione deve essere eseguita nei giorni 2, 4 e facoltativamente nei giorni 6 successivi all'infezione.
4. Quantificazione del virus mediante test della placca
   NOTA: Per eseguire un test della placca, far crescere e placcare le cellule Vero in una piastra a 6 pozzetti e garantire il 90% di confluenza delle cellule prima dell'inizio del test. Utilizzare un pallone confluente di 75 cm² di queste cellule. Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti all'interno di un armadio di biosicurezza.
   1. Lavare il monostrato confluente di cellule Vero nel matraccio con 10 ml di soluzione salina tampone fosfato fresco (PBS) dopo aver aspirato il terreno di coltura. Ripetere nuovamente la fase di lavaggio con PBS dopo aver aspirato la prima serie di soluzioni di lavaggio.
   2. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% al monostrato cellulare. Incubare il matraccio a 37 °C per 5 min. Ad occhio nudo, assicurarsi che le cellule siano staccate dalla superficie interna del pallone. In caso contrario, attendere altri 5 minuti prima di esaminare nuovamente il pallone. Quando le cellule sembrano essere staccate, aggiungere 9 mL di mezzo intero al monostrato per assicurarsi che le cellule si spostino completamente dalla superficie del pallone.
   3. Raccogliere tutte le cellule dal pallone insieme all'intero mezzo e metterle in un tubo di centrifuga da 15 ml.
   4. Per ogni pozzo delle 6 piastre del pozzo utilizzate per il dosaggio della placca, utilizzare 300 μL dal tubo della centrifuga. Ricaricare ogni pozzo della piastra a 6 pozzi con 2 ml di supporto intero. Lasciare le piastre nell'incubatrice durante la notte per consentire loro di crescere e formare un monostrato confluente in ciascun pozzetti.
   5. Per eseguire un test della placca, eseguire una diluizione seriale dei campioni deve essere condotta prima della quantificazione del virus.
   6. Eseguire una diluizione log₁₀1 volte del virus in tubi di microcentrghifuga utilizzando mezzi privi di siero fino a raggiungere una diluizione di^{10 -8.} Quando a una diluizione 10^-3, trasferire 1 mL della diluizione al monostrato di cellule placcate dopo aver aspirato il mezzo di crescita sulle cellule dalla piastra a 6 pozzetti, questa sarà la fase di infezione. Incubare la piastra infetta a 37 °C incubatore per 2 ore.
   7. Aspirare i mezzi di infezione esistenti, lavare con PBS due volte delicatamente per rivestire le cellule e aggiungere 2 ml di mezzi carichi di metilcellulosa per pozzo a tutti e 6 i pozzi. Incubare per 72 ore o fino a quando non si può vedere la formazione di placche. Le placche possono essere identificate dalla formazione di piccoli spazi tra le cellule nel monostrato cellulare.
   8. Aggiungere lentamente 1 ml di metanolo all'angolo di ciascun pozzo, usando la parete come punta guida. Incubare la piastra da 6 pozzi a temperatura ambiente per 15 min. Aspirare lentamente il contenuto di ciascun pozzo dalla piastra senza disturbare o agitare il monostrato cellulare.
   9. Aggiungere 1 mL di soluzione di lavoro viola cristallino a ciascun pozzo di 6 piastre di pozzo, assicurandosi che tutte le celle siano coperte. Incubare la piastra a 6 pozzi al buio per 30 minuti. Scartare la soluzione viola cristallina aspirandola e asciugare i pozzezze su un foglio di carta assorbente.
   10. Contare bene il numero di placche alla massima diluizione per quantificare il contenuto totale del virus nella soluzione iniziale. Ripeti il processo due volte per confermare il titolo virale.

Per comprendere l'efficacia degli antivirali sperimentali, devono essere ampiamente testati prima di essere inviati per studi clinici umani in vivo. A questo proposito, devono essere identificati i gruppi di controllo positivo, controllo negativo e test. La trifluorothymidina (TFT) è stata a lungo utilizzata come trattamento preferito per trattare l'herpes cheratite topicamente16. Usato come controllo positivo, i gruppi corneali trattati con TFT mostrano una minore diffusione dell'infezione. Come controllo negativo, abbiamo usato DMSO o controllo del veicolo disciolto in PBS. BX795, il farmaco preclinico sperimentale era il gruppo di test. Un totale di 4 cornee sono state assegnate a ciascun gruppo e i farmaci sono stati aggiunti 3 volte al giorno alle cornee suini. I nostri risultati utilizzando l'imaging a fluorescenza stereoscopica mostrano che l'efficacia antivirale di BX795 è simile a TFT nel controllo della diffusione virale. La diffusione virale nei nostri studi può essere visualizzata mediante l'imaging del canale di fluorescenza verde nello stereoscopio. Abbiamo osservato che le cornee del gruppo di controllo negativo trattate solo con veicoli mostravano la diffusione del virus dalla zona centrale di infezione alla sua periferia entro 6 giorni dall'inoculazione virale iniziale, mentre entrambi i farmaci (BX795 e TFT) eliminano l'infezione nelle immagini del giorno 4 - 6 (Figura 9A). Allo stesso modo, i tamponi oculari prelevati nei giorni 2 e 4 successivi all'infezione mostrano una completa inibizione del virus nel controllo positivo e nei campioni trattati con BX795 mentre si osserva un forte aumento del titolo del virus infettivo nel gruppo di controllo negativo (Figura 9B).

Figura 1: Occhi suini tenuti sul ghiaccio fino alla lavorazione del tessuto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Configurazione del banco di lavoro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Occhi suini posti su una garza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Occhio suino con ago da 30G nella foto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Ago da 30 G utilizzato; foro praticato al centro della superficie epiteliale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Azione rotante utilizzata per tagliare il bordo corneale utilizzando una lama sterilizzata affilata (A,B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Immagini della cornea. (A,B) La cornea infine tagliata con forbici affilate (C) La cornea isolata è tenuta da una pinzetta (D) Cornea completamente isolata, pronta per l'uso Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Cornee poste in una piastra a 12 pozzetti e incubate per 72 ore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Progressione della diffusione virale assunta durante il decorso dell'infezione. Le cornee sucine appena asportata sono state infettate da HSV-1 17-GFP e(A)ripreso al microscopio nei giorni 2, 4 e 6 dopo l'infezione. Il trattamento topico con DMSO, TFT o BX795 è stato iniziato il giorno 2 dopo l'infezione. (B) I saggi della placca sono stati eseguiti utilizzando tamponi prelevati dalle cornee suini su Cellule Vero. Il test ANOVA bidirezionale è stato eseguito per comprendere le differenze significative tra i gruppi di trattamento. n=4, ****p=0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi e nessun interesse finanziario concorrente.