Summary
De steriele insectentechniek (SIT) wordt gebruikt om specifieke, medisch belangrijke muggenpopulaties te beheersen die bestand kunnen zijn tegen chemische controles. Hier beschrijven we een methode voor massale opfok en voorbereiding van steriele mannelijke muggen voor vrijlating in een operationeel SIT-programma gericht op de Aedes aegypti-mug .
Abstract
De bestrijding van menselijke ziekten zoals dengue, Zika en chikungunya is afhankelijk van de controle van hun vector, de Aedes aegypti-mug , omdat er geen preventie is. Controle van muggenvectoren kan vertrouwen op chemicaliën die worden toegepast op de onvolgroeide en volwassen stadia, die kunnen bijdragen aan de mortaliteit van niet-doelwitten en, nog belangrijker, kunnen leiden tot insecticideresistentie in de vector. De steriele insectentechniek (SIT) is een methode om populaties van plagen te beheersen door de vrijlating van gesteriliseerde volwassen mannetjes die paren met wilde vrouwtjes om niet-levensvatbare nakomelingen te produceren. Dit artikel beschrijft het proces van het produceren van steriele mannetjes voor gebruik in een operationeel SIT-programma voor de bestrijding van Aedes aegypti-muggen . Hier worden de stappen beschreven die in het programma worden gebruikt, waaronder het fokken en onderhouden van een kolonie, het scheiden van mannelijke en vrouwelijke poppen, het bestralen en markeren van volwassen mannetjes en het verzenden van Aedes aegypti-mannetjes naar de releaseplaats. Ook worden procedurele kanttekeningen, programmabeperkingen en toekomstige doelstellingen besproken.
Introduction
Overdracht van door muggen overgedragen ziekteverwekkers op mensen veroorzaakt elk jaar wereldwijd miljoenen gevallen van ziekte en sterfgevallen. Bij gebrek aan effectieve, goedgekeurde vaccins voor door muggen overgedragen ziekten, zoals Zika of knokkelkoorts, is een van de meest effectieve manieren om de overdracht te verminderen het verminderen van ziektevectormuggenpopulaties. Ergerlijk genoeg vertonen steeds meer muggensoorten, traditioneel het doelwit van pesticiden, toenemende niveaus van resistentie tegen pesticiden1. Tegelijkertijd hebben overheidsinstanties zich agressief uitgeschreven of eerder goedgekeurde pesticiden verboden, en er worden weinig nieuwe, effectieve chemische bestrijdingsmaatregelen ontwikkeld 2,3. Deze constellatie van obstakels voor muggenbestrijding heeft de verkenning van alternatieve niet-chemische technieken gemotiveerd om muggenpopulaties te verminderen.
Bepaalde muggensoorten vormen uitdagingen om problemen met resistentie en registratie van pesticiden te beheersen. Aedes aegypti (L.) is een prominente ziektevectormug die uiterst moeilijk te bestrijden is door traditioneel geïntegreerd vectorbeheer vanwege de cryptische peridomestische habitat die door deze soort wordt geëxploiteerd voor onvolwassen ontwikkeling en volwassen rust 4,5. Uitdagingen met betrekking tot de exploitatie van de cryptische habitat rond woningen omvatten de moeilijkheid om deze locaties te bereiken met pesticidenspuittechnieken, evenals het potentiële gebrek aan acceptatie door het publiek voor herhaalde toegang tot privé-eigendom voor vectorcontrolebureaus voor de volksgezondheid om de intensieve bewakings- en controleactiviteiten uit te voeren die cruciaal zijn voor effectief geïntegreerd vectorbeheer (IVM) voor deze soort.
Gelukkig wordt SIT, een aanpak die succesvol is gebleken voor duurzame bestrijding van andere zeer uitdagende insectensoorten6, toegepast op het Aedes aegypti-probleem in een baanbrekende reeks experimenten en operationele proeven in St. Augustine, Florida (KJL, RLA, SCB ongepubliceerde gegevens). SIT is toegepast op een reeks insectensoorten, waaronder muggen, en is grondig beoordeeld 7,8. SIT maakt gebruik van de massale vrijlating van kolonie-gefokte mannetjes gesteriliseerd, bijvoorbeeld door blootstelling aan ioniserende straling of chemicaliën om de partnerkeuze van natuurlijke populaties van vrouwtjes te overweldigen. Gesteriliseerde mannetjes die paren met wilde vrouwtjes maken de eieren onvruchtbaar als gevolg van schade geleden door mannelijke gameten, en als ze in voldoende aantallen aanwezig zijn, kunnen ze theoretisch de natuurlijke Aedes aegypti-populatie laten crashen.
Een SIT-programma werd geïnitieerd om te proberen de populaties van Aedes aegypti te verminderen in een stedelijk gebied aan de Atlantische kust van Florida, waar deze soort onlangs opnieuw is gekoloniseerd en zich uitbreidt en een risico voor de volksgezondheid vormt voor de overdracht van virussen zoals Zika, dengue of chikungunya. Om het potentieel voor compatibiliteit met wilde vrouwtjes te maximaliseren, werd een nieuwe kolonie opgericht met behulp van in het wild gevangen Aedes aegypti uit de doelpopulatie om mannetjes te produceren voor het programma9. Dit was gebaseerd op de hypothese dat lokaal afgeleide, in kolonies gekweekte mannetjes eerder concurrerend zouden zijn met lokale wilde mannetjes om te paren met lokale wilde vrouwtjes. Om de SIT effectief te laten zijn, moeten niet alleen overweldigende aantallen steriele mannetjes aanwezig zijn in het doelgebied, maar ze moeten ook in staat zijn om effectief te baltsen en te paren met lokale wilde vrouwelijke muggen.
Een reeks experimenten werd uitgevoerd om het optimale aantal steriele mannetjes te bepalen om vrij te geven (KJL, RLA, SCB ongepubliceerde gegevens) evenals optimale doses straling die de mannetjes onvruchtbaar zouden maken zonder te interfereren met overleving, gedrag of acceptatie door wilde vrouwtjes (KJL, RLA, SCB ongepubliceerde gegevens). Deze gegevens worden gepubliceerd in geallieerde publicaties van deze groep, maar sommige van deze bevindingen zijn ook in dit protocol vastgelegd en kunnen elders als uitgangspunt worden gebruikt voor nieuwe SIT Aedes aegypti-controleprogramma's . Deze soort breidt zijn bereik voortdurend uit en SIT-programma's zijn veelbelovend om kosteneffectieve langetermijnoplossingen te zijn om deze populatie onder controle te houden. Het doel van dit protocol is om gesteriliseerde, mannelijke, kolonie-gekweekte Aedes aegypti-muggen te produceren voor systematische vrijlating in buitenruimtes om de natuurlijke voortplantingscycli van lokale Aedes aegypti-populaties te verstoren in een operationeel vectorcontroleprogramma voor de volksgezondheid.
Hoewel soortgelijke protocollen en workflows zijn gepubliceerd voor de productie van transgene Aedes aegypti-mannetjes en productieworkflows voor Aedes SIT, of op Wolbachia gebaseerde incompatibiliteitsprogramma's elders zijn gepubliceerd, illustreert dit protocol hoe bestaande protocollen zijn aangepast voor Aedes aegypti-productie, scheiding en bestraling van mannelijke poppen, markering en verpakking van volwassen mannetjes en verzending naar de releaselocatie voor dit programma9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. De markeringscomponent van dit protocol is mogelijk niet vereist in een volwassen operationeel SIT-programma; het is hier echter opgenomen omdat het een manier is om de effectiviteit te bewaken en de kwaliteit van het hele proces te controleren in de eerste jaren van het opzetten van het SIT-programma. Muggenbestrijdingsprogramma's worden meestal uitgevoerd door lokale autoriteiten, dus ze kunnen sterk variëren in vele aspecten van hun organisatie, van grootte en financieringsbasis tot het afstemmen van controletactieken om lokaal succes te maximaliseren. Daarom moet het hierin beschreven protocol worden beoordeeld op compatibiliteit met beschikbare bronnen.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor de behandeling van Aedes aegypti , maar kan worden aangepast om effectief te zijn voor andere muggensoorten.
1. Productie en onderhoud van een Aedes aegypti kolonie
- Fok volwassen Aedes aegypti en produceren eieren.
- Bereid een inklapbaar, aluminium frame van 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m, een grote opfokkooi met 20 x 20 glasvezelgaasscherm en een reach-in stockinette sleeve op één verticale muur.
- Plaats een plastic kuip van 1900 ml met Aedes aegypti-poppen (1: 1 geslachtsverhouding) in elke opfokkooi, bind de mouw dicht en laat de bekers op hun plaats voor eclosie totdat er geen volwassenen meer tevoorschijn komen (d.w.z. ongeveer 4 dagen). Verwijder op dit moment de kopjes en houd de volwassen opfokkooien op 28-30 ° C, >50% relatieve vochtigheid (Rh) en een 12:12 of 14:10 licht: donker (L: D) cyclus.
OPMERKING: De productie van Aedes aegypti poppen wordt beschreven in rubriek 1.2. De dichtheid van poppen in de kuip van 1900 ml moet zodanig zijn dat er voldoende ruimte is voor alle poppen om tegelijkertijd lucht te krijgen. - Vierentwintig uur nadat de poppen in de opfokkooien zijn geplaatst, plaatst u een container met 10% sucrose-oplossing met een spons lont en hangt u een spons van 10 cm x 2 cm gedrenkt in honing aan een draadhaak in elke kooi om afzonderlijke bronnen van hydratatie en voeding aan volwassen muggen te bieden. Controleer de sponzen en sucrosecontainer op droogheid of schimmelgroei en vul deze indien nodig aan of verander ze.
OPMERKING: Gebruik een plastic beker van 120 ml met een spons lont van 10 cm x 2 cm door een uitsparing in het deksel in kleine opfokkooien en een plastic beker van 460 ml met een spons lont van 12 cm x 8 cm in grote kooien. - Geef een bloedmaaltijd aan elke opfokkooi 48-72 uur nadat de meerderheid van de volwassenen is verschenen en elke 2-3 dagen daarna om een hoog aantal bebloede vrouwtjes te behouden om de eicelopbrengst te maximaliseren. Vul een condoom van lamsleer met 50-100 ml gedefibrineerd runderbloed en verwarm tot ongeveer 37 °C in een warmwaterbad. Gebruik vervolgens een doek of papieren handdoek om het condoom af te deppen en gedeeltelijk af te drogen voordat u het gedurende 30-60 minuten op een met papier beklede petrischaal in de kooi plaatst.
OPMERKING: Spoel voor gebruik de binnen- en buitenkant van elk condoom 2-3x met water om glijmiddelen of andere substraten te verwijderen en controleer op gaten. Condooms kunnen worden hergebruikt voor 3-5 voedingen door het bloed uit te spoelen en op te slaan in een kopje koel water. Omdat sommige kolonies mierenplagen kunnen ervaren, moeten condooms mogelijk worden opgeschort om de toegang te beperken. - Wacht 48-72 uur na elke bloedtoevoer en introduceer vervolgens een ovipositiebeker in elke volwassen opfokkooi. Bereid de ovipositiebekers voor door 200 ml gefilterd popwater (d.w.z. de waterlarven en poppen werden grootgebracht) toe te voegen aan een plastic beker van 460 ml met een 8-10 cm hoog x 30 cm breed vel zaadkiempapier (ovipositiepapier) dat vlak langs de binnenomtrek van de beker is aangebracht. Controleer de ovipositiepapieren dagelijks, vervang ze om de 2-4 dagen en bewaar de met eieren beladen ovipositiepapieren zorgvuldig door ze 24-48 uur te laten drogen bij >50% Rh19.
OPMERKING: Laat de ovipositiebekers niet langer dan 72 uur in de opfokkooien staan om te voorkomen dat de eieren uitkomen. - Onderhoud de volwassen opfokkooien maximaal 3-4 weken voordat u ze afbreekt en nieuwe volwassen opfokkooien opzet.
- Om een opfokkooi af te breken, verwijdert en reinigt u de ovipositiebeker, bewaart u het met eieren beladen ovipositiepapier, verwijdert en reinigt u de sucrose-oplossingscontainer en honingspons en vriest u de kooi in om alle muggen te doden.
- Verwijder alle muggenlichamen en reinig de binnen- en buitenkant van elke kooi grondig met verdunde zeep en water met behulp van papieren handdoeken en schuursponzen met sponzen. Laat de schone kooi minstens 24 uur drogen voordat u hem in de volgende opfokcyclus gebruikt.
OPMERKING: Gebruik vacuümapparatuur uitgerust met zeer efficiënte filtratie om deeltjes te verwijderen die tot allergieën kunnen leiden. Sucrose-oplossingscontainers kunnen 3-5x worden gereinigd en hergebruikt.
- Aedes aegypti larven grootbrengen uit eieren
- Bereid een voorraad larvale voedingsslib door 80 g van een 3:2 verhouding runderleverpoeder te mengen: biergist in 2200 ml kraanwater. Bereid verpulverd visvoer. Giet visvlokken in een kruidenmolen en maal tot een fijn poeder.
OPMERKING: Deze drijfmest wordt in dit laboratorium als bruin aangeduid. - Gebruik ei-beladen (5.000-10.000 eieren) ovipositiepapier uit stap 1.1.5, snijd een 3-7 cm deel van het ei papier loodrecht op de ovipositielijn en plaats het in een container van 460 ml half gevuld met kraanwater samen met een snufje verpulverde visvlokken. Bedek en roer krachtig gedurende ten minste 1 min.
OPMERKING: Eipapier moet ten minste 7 dagen (maar niet meer dan 90 dagen, wat het uitkomen kan verminderen) na de eileiderschap worden bewaard voordat het broedproces wordt gestart om embryonatie mogelijk te maken. Bacteriën en algen die in het visvoer aanwezig zijn, deoxygeneren het water snel, wat de ontwikkeling van larven veroorzaakt. - Giet de volledige inhoud van de container uit stap 1.2.2 in een larvale kweekpan bereid met 3 L kraanwater en 50 ml bruine drijfmest. Markeer de pan met startdatum, staminformatie, het voedingsschema volgens tabel 1 en bewaar bij 28-30 °C, >50% Rh en een 12:12 of 14:10 L:D cyclus.
OPMERKING: De verhouding van 3 L water tot 50 ml bruin is gebaseerd op de diepte van het water in de specifieke larvale pannen die in de tabel met materialen worden genoemd. Pannen van verschillende grootte ondersteunen verschillende popdichtheden en vereisen dus verschillende hoeveelheden water en bruine drijfmest. De voedersnelheden van larven in tabel 1 worden gegeven als een bereik; selectie van de gebruikte hoeveelheid is gebaseerd op ervaring en bepaling van de algehele gezondheid van de zich ontwikkelende larven met behulp van variabelen zoals watertroebelheid, kleur en geur; aanwezigheid van bacteriële film op het water; aantal of verhouding van levende en dode larven; en de beweeglijkheid van larven. Voer op dag 3 tot 6 onrijpe muggen verpulverd visvoer volgens tabel 1. Het toevoegen van water, het verminderen van voedsel en het opzetten van 2-3 extra pannen dan het project vereist, zijn manieren om ongezonde larvale pannen te beheren.
- Bereid een voorraad larvale voedingsslib door 80 g van een 3:2 verhouding runderleverpoeder te mengen: biergist in 2200 ml kraanwater. Bereid verpulverd visvoer. Giet visvlokken in een kruidenmolen en maal tot een fijn poeder.
| Dag | Volume nutritionele drijfmest toegevoegd | Volume water toegevoegd | Acties |
| 1 | 50 ml (drijfmest) | 3000 ml | |
| 2 | (geen eten) | (geen water) | |
| 3 | 1/4 - 1/2 theelepel (verpulverd visvoer) | 500-1000 ml | |
| 4 | 1/2 - 3/4 theelepel (verpulverd visvoer) | 500-1000 ml | |
| 5 | 1/2 - 3/4 theelepel (verpulverd visvoer) | 500-1000 ml | |
| 6 | 1/4 - 1/2 theelepel (verpulverd visvoer) | 500-1000 ml | |
| 7 | (geen eten) | (geen water) | stampoppen en larven |
Tabel 1: Voedingsschema voor massale opfok van Aedes aegypti-larven.
2. Scheiding van mannelijke Aedes aegypti poppen
- Concentraat poppen uit de larvale pannen. Zodra de geschatte drempelverhouding van poppen is bereikt, giet u de inhoud van elke pan door een zeef (maat 20-40). Gebruik een knijpfles kraanwater om de poppen en larven uit de zeef te wassen in een gegradueerd plastic bekerglas van 3000 ml.
OPMERKING: Slechts 2-3 larvale pannen moeten worden overgebracht naar elke beker van 3000 ml om overbevolking te voorkomen, zodat poppen comfortabel het oppervlak kunnen bereiken. Popae zullen zich naar verwachting ontwikkelen tussen 130-140 uur na het uitkomen van de eieren onder de temperatuur en lichtomstandigheden vermeld in stap 1.2.3. Verwacht merkbaar ei uitkomen op dezelfde dag dat de eieren worden opgezet. Afhankelijk van de omgevingsomstandigheden zal ongeveer 20-70% van de larven verpopt zijn en binnen 6 dagen klaar zijn om gezeefd te worden. Het verdelen van de poppen over meerdere bekers van 3000 ml zorgt voor beheersbare volumes om in de separator te gieten. - Scheid mannelijke poppen van de larven en vrouwelijke poppen.
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd door één operator of twee operators.- Voor een enkele operator die mannelijke poppen scheidt:
- Verdeel de inhoud van elk bekerglas van 3000 ml dat in stap 2.1 is gegenereerd in meerdere plastic containers van 1900 ml om morsen en overbelasting van de afscheider te verminderen. Bereid de platenscheider voor door een stijve ondiepe opvangcontainer van 4000 ml onder de sluis aan de basis van de separator te plaatsen (figuur 1). Vul twee 3000 ml gegradueerde plastic bekers ongeveer 3/4 vol met kraanwater.
OPMERKING: Gebruik een gootsteenslang als alternatief voor de 3000 ml plastic gegradueerde bekers. Anders moeten bekers tijdens het scheidingsproces continu worden bijgevuld. Aanvullende informatie over het gebruik van de popscheider is te vinden in de referenties12,20. - Giet water door de ruimte tussen de glasplaten en stel de bovenste en onderste knoppen met de klok mee of tegen de klok in aan om water continu door te laten stromen en tegelijkertijd stilstaand water te genereren tot een hoogte van ongeveer 1,25 cm vanaf de basis van de platen. Markeer de beginposities van de onderste knoppen met tape. Zodra stilstaand water gelijkmatig over de basis van de glasplaten is verdeeld met gelijke hoogte en afvoersnelheid, begint u de inhoud van de containers met poppen en larven door de ruimte tussen de platen te gieten.
OPMERKING: Er moet een duidelijke scheiding aanwezig zijn tussen kleine (mannelijke) en grote (vrouwelijke) poppen; spoel anders deze batch door en pas de bovenste knoppen aan om de ruimte tussen de platen te verkleinen. - Terwijl u langzaam water door de separator giet, draait u de onderste knoppen continu als een paar tegen de klok in ~ 1-2 cm vanaf de met tape gemarkeerde startpositie totdat de meeste of alle larven zijn doorgespoeld en door de sluis in de verzamelcontainer zijn gegleden.
OPMERKING: Terwijl de ene hand wordt gebruikt om water te gieten, draait de andere hand de knoppen één voor één, maar even en in kleine stappen, om de platen langzaam te openen. De meeste larven worden snel doorgespoeld, maar er zullen enkele larven worden gevangen met de mannelijke poppen. Deze achterblijverlarven zullen worden bestraald, maar zullen achterblijven in ontwikkeling en niet eclose naar volwassenen met het focale cohort van poppen. - Gooi de larven weg of recycle ze terug in de kolonie, maar verwijder ze in beide gevallen uit de verzamelcontainer voordat de mannelijke poppen door de separator beginnen te wassen. Pauzeer het proces door de waterstroom te stoppen terwijl de opvangcontainer aan de basis van de sluis wordt ontdaan van larven door door een # 30-zeef te gieten, die wordt teruggespoeld in een aparte container.
OPMERKING: Larven stromen eerst door, gevolgd door mannelijke poppen en ten slotte de vrouwtjes (figuur 1). - Blijf water gieten en draai aan de onderste knoppen totdat de mannelijke larven zijn doorgespoeld en gescheiden in de opvangcontainer. Pauzeer het proces om te controleren op larven en deze uit de verzamelcontainer te verwijderen voordat de mannelijke poppen in de volgende stap worden overgebracht.
OPMERKING: Het aantal spoelingen dat nodig is om de mannetjes te scheiden, hangt af van het tempo van de waterstroom en de snelheid waarmee de knoppen worden gedraaid. Er is meestal 2000-2500 ml water nodig om de larven weg te spoelen, 1000-1500 ml om de mannelijke poppen weg te spoelen en 200-400 ml om de vrouwelijke poppen weg te spoelen. - Giet de mannelijke poppen uit de verzamelcontainer door een # 20 zeef boven een gootsteen. Gebruik een knijpfles van 1000 ml kraanwater om de mannelijke poppen uit de zeef te spoelen terwijl u in een aparte container van 1900 ml giet.
- Zodra alle mannelijke poppen zijn gescheiden, blijft u water door de afscheider gieten en past u de onderste knoppen aan om door de vrouwelijke poppen te spoelen. Breng de vrouwtjes over met behulp van het in stap 2.2.1.6 beschreven zeefproces in een aparte container totdat alle onrijpe muggen uit de afscheider zijn gespoeld. Gooi de vrouwelijke poppen weg. Zodra de batch is verwerkt, brengt u de knoppen terug naar hun oorspronkelijke beginpositie en herhaalt u het proces met de volgende batch. Zodra alle batches zijn verwerkt, laat u de platen open zodat de separator kan drogen.
OPMERKING: Er is geen perfecte scheiding met behulp van dit apparaat, wat geduld en oefening vereist. Hardnekkige poppen of larven kunnen worden losgemaakt met een zware stroom water, maar niet in die mate dat het ze naar de zijkanten duwt, wat toekomstige overstromingen zou kunnen besmetten.
- Verdeel de inhoud van elk bekerglas van 3000 ml dat in stap 2.1 is gegenereerd in meerdere plastic containers van 1900 ml om morsen en overbelasting van de afscheider te verminderen. Bereid de platenscheider voor door een stijve ondiepe opvangcontainer van 4000 ml onder de sluis aan de basis van de separator te plaatsen (figuur 1). Vul twee 3000 ml gegradueerde plastic bekers ongeveer 3/4 vol met kraanwater.
- Voor twee toedieners die de mannelijke poppen scheiden, moet u punt 2.2.1 als volgt wijzigen.
- Eerste operator: Giet water door de separator en draai de knoppen stapsgewijs om larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen te scheiden.
- Tweede operator: Zodra elke fase in de sluiscontainer is verzameld, zeeft u de inhoud van de sluiscontainer uit om de larven, mannelijke poppen en vrouwelijke poppen in meerdere, afzonderlijke sluisopvangcontainers te verdelen. Houd de grote bekers gevuld met water als er geen gootsteenslang beschikbaar is.
- Voor een enkele operator die mannelijke poppen scheidt:
Figuur 1: Popscheider met een partij onrijpe Aedes aegypti. De scheiding begint door water door de afscheider te gieten terwijl u de onderste knoppen 1-2 cm tegen de klok in draait totdat de beoogde set, d.w.z. larven, mannelijke poppen of vrouwelijke poppen, zoveel mogelijk is geïsoleerd van de sets die overblijven (linker afbeelding). Rechter afbeelding toont scheiding van larven (onderste band), mannelijke poppen (middelste band) en vrouwelijke poppen (bovenste band). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bereiding van mannelijke Aedes aegypti poppen voor bestraling
- Verdeel de mannelijke poppen in plastic petrischalen van 60 mm.
OPMERKING: Het aantal petrischalen dat nodig is, hangt af van het aantal mannelijke poppen dat beschikbaar is voor bestraling: één larvale kweekpan uit stap 1.2 vult ongeveer 1,5 petrischalen. De leeftijd van de poppen varieert van 1 tot 40 uur oud. In dit protocol wordt de kleinere diameter diepere helft van de petrischaal de onderkant genoemd en de grotere diameter ondiepere helft de bovenkant.- Bereid voorgesneden schijven van filterpapier voor op de binnendiameter van de bodem van de petrischaal. Plaats een met water bevochtigde filterpapierschijf in elk van de bodems van de petrischalen om de poppen gehydrateerd te houden tijdens het transport en het bestralingsproces.
- Breng de poppen over in petrischalen. Zeef de in stap 2.2.1.6 verzamelde mannelijke poppen met een zeef en was de poppen in een maatbeker van 1000 ml met zo min mogelijk water. Giet de poppen voorzichtig in petrischalen totdat elke filterpapierschijf gelijkmatig bedekt is met een enkele laag poppen (figuur 2A - C). Schik de petrischalen aan de rand van een tafel op een rij om het gieten te vergemakkelijken.
OPMERKING: Een alternatief voor het persen van de poppen is om de punt van een plastic Pasteur-pipet van 3 ml te knippen tot een diameter die groot genoeg is om de poppen te huisvesten. Gebruik de pipet om de poppen uit de in stap 2.2.1.6 geproduceerde houder rechtstreeks op de filterpapierschijven over te brengen, zodat er in elke petrischaal één dicht opeengepakte laag poppen zit. Dit is alleen praktisch voor kleine partijen. - Gebruik een ongewijzigde Pasteur-pipet van 3 ml om stilstaand water van de bodem van de petrischaal te verwijderen om beweging van de pop tijdens de seksstap (3.2) en het transport te voorkomen.
Figuur 2: Poppen overbrengen naar petrischalen voor bestraling. (A) Gezeefde poppen worden gegoten en teruggespoeld in een plastic bekerglas van 1000 ml. (B) Er wordt minimaal water in het bekerglas vastgehouden om het gieten in petrischalen te vergemakkelijken. (C) Petrischalen langs de rand van een oppervlak opgesteld om het gieten in een enkele laag poppen te vergemakkelijken. D) Petrischalen geladen met poppen worden gestapeld en vastgezet voor levering aan de bestralingsinstallatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Seks de poppen om te controleren op besmetting met vrouwtjes. Gebruik onder een ontleedbereik sondes om elke pop te roteren om het ventrale oppervlak te controleren op een grote genitale kwab (figuur 3) die mannelijk geslacht aangeeft. Verwijder en gooi de poppen weg met gereduceerde of kleine genitale lobben die vrouwtjes aangeven en vervang door een gelijk aantal mannelijke poppen om de juiste telling te behouden.
OPMERKING: In een operationeel programma is deze stap niet praktisch vanwege grote aantallen muggen en het feit dat scheiding, overdracht, bestraling en het voorbereiden van kooien na bestraling allemaal op één dag met beperkte tijd worden gedaan. Een monster van geselecteerde petrischalen kan worden gecontroleerd op kwaliteit, met name in de vroege fasen van de ontwikkeling van het SIT-programma.
Figuur 3: Poppen seksen met behulp van de genitale kwab. (A) Ventrale en (B) laterale weergaven van vrouwelijke (♀) en mannelijke (♂) Aedes aegypti poppen, met genitale kwabben aangegeven om het seksuele dimorfisme te vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bedek de onderkant met de bovenkant van de petrischalen en bevestig ze met laboratoriumtape. Bundel de getapete petrischalen met elastieken in stapels die zo groot zijn dat ze in de bestralingskamer passen en sluit af in een gelabelde hersluitbare zak van 3,8 L (figuur 2D). Laat poppen niet onbedekt blijven gedurende >1 uur.
4. Bestraling van mannelijke Aedes aegypti poppen
- Bereid dosimetriefilm van dezelfde partij door 1 cm2 vierkanten films te snijden en elk vierkant in zijn individuele envelop te plaatsen.
OPMERKING: Alle folie die op elke dag wordt gebruikt, wordt op hetzelfde moment gesneden. Dit vermindert de kleine hoeveelheid variatie veroorzaakt door opslag. Het aantal vierkanten dat nodig is voor elke stapel is 1 + (aantal petrischalen). - Bereid een kit voor om mee te nemen naar de bestralingsfaciliteit, die een laboratoriumtimer, laboratoriumtape, permanente marker, voorbereide enveloppen met dosimetriefilm, dosimetriebadge en een laboratoriumnotitieblad met checklists moet bevatten om belangrijke informatie bij te houden (figuur 4).
Figuur 4: Laboratoriumboek outline-IR sheet ingevuld voor een dosis response set. Tekstvakken die rood zijn omlijnd (gemarkeerd met rode pijlen) geven nuttige opmerkingen over de verschillende secties aan en herhalen belangrijke informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vervoer de poppen naar de bestralingsinstallatie. Plaats de petrischalen van mannelijke poppen uit stap 3.3 in geïsoleerde containers en bewaar ze tijdens het transport uit direct zonlicht en met airconditioning.
- Bereid stapels petrischalen voor op bestraling bij de bestralingsoven. Stapel het juiste aantal petrischalen om in de bestralingskamer te passen met een dosimetriefilmomhulsel gecentreerd tussen elke schotel en aan de boven- en onderkant van de stapel. Bevestig de enveloppen en de hele stapel met laboratoriumtape om morsen te voorkomen en de plaatsing van de stapel in de kamer te vergemakkelijken.
- Bestraal de petrischalen van mannelijke poppen. Plaats de stapel petrischalen op het stijve metalen gaas in de kamer om op de juiste hoogte te staan voor de optimale blootstellingskegel op basis van eerdere dosistoewijzing van de specifieke bestralingseenheid21. Activeer de draaitafel op de bestralingsoven en bestraal, waarbij tegelijkertijd de laboratoriumtimer wordt gestart. Bestraal gedurende het juiste interval om de gewenste dosis te bereiken (voorbeelden zijn weergegeven in tabel 2).
OPMERKING: Dit protocol is gebaseerd op een cesium-137 bestralingsmiddel (zie de Tabel van Materialen) en een streefdosis van 50 Gy. Omdat Cs-137 in de loop van de tijd vervalt, wordt het dosistempo elk jaar aangepast door een dosis-responsreeks uit te voeren met behulp van alaninedosimeters, aangevuld met radiochrome film voor routinematige dosimetrie en alanine in ongeveer 10% van de bestraalde monsters. Gezien het huidige dosistempo van 8,8 Gy/min vereist het bereiken van de streefdosis van 50 Gy 5 min, 41 s blootstelling. Routinematige filmdosimetrie vindt plaats zoals beschreven in stap 4.7. Alanine pellet dosimetrie wordt uitgevoerd in het National Center for Electron Beam Research aan de Texas A &M University of aan het National Institute of Standards and Technology in Gaithersburg, MD, VS.
| Dosering (Gy) | Tijd (gebaseerd op 8.8 Gy/min) |
| 0 | NA |
| 10 | 1 min 8 s |
| 30 | 3 min 24 s |
| 50 | 5 min 41 s |
| 65 | 7 min 23 s |
| 85 | 9 min 39 s |
| 100 | 11 min 22 s |
| 110 | 12 min 30 s |
Tabel 2: Voorbeeld doseringstijden voor de Cesium-137 bestralingsinstallatie.
- Zodra de voorgeschreven tijd is verstreken, verwijdert u de petrischalen uit de bestralingsmachine en verwijdert u de stapel voorzichtig. Label alle petrischalen en filmenveloppen met de datum en locatie in de stapel. Verzegel de enveloppen en bewaar voor dosimetrie. Verpak de petrischalen opnieuw in de geïsoleerde container voor transport terug naar het hoofdlaboratorium.
OPMERKING: Noteer of er volwassenen zijn gekomen tijdens de bestraling en markeer de aangetaste petrischaal zodat de volwassene(n) niet zullen ontsnappen wanneer de poppen in de opfokkooien worden geplaatst (stap 5.2). - Bevestig de bestralingsdosis met dosimetriefilm door de film ongeveer 24 uur na de belichting te meten. Activeer de dosimetrielezer en laat deze in evenwicht brengen tot kamertemperatuur. Laad de film met behulp van een bij de lezer geleverde tang en volg de instructies van de fabrikant voor het aflezen van de bestraalde film en de niet-bestraalde blanco film uit dezelfde batch. Nul de lezer zonder film tussen metingen en registreer gegevens zoals in het voorbeeldgegevensblad in figuur 5.
OPMERKING: Dit protocol is gebaseerd op de ND0.5- en ND1.0 QA-filtersetstandaarden. Het is belangrijk om de film te meten met de matte kant naar de operator gericht.
Figuur 5: Dosimetriegegevensblad gevuld met voorbeeldgegevens. De kolomkoppen vragen de operator om belangrijke gegevens vast te leggen voor latere analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Opfokken van doorstraalde mannelijke Aedes aegypti poppen tot volwassenen
- Reinig en bereid kleine plastic kooien van 30 cm x 30 cm x 30 cm voor, zodat ze bij terugkeer in het hoofdlaboratorium klaar zijn voor bestraalde poppen. Bereid voor elke 2 petrischalen van bestraalde mannelijke poppen 1 opfokkooi voor. Vul elke houderijkooi in met een half gevulde plastic beker met 460 ml leidingwater en een container met 10% sucroseoplossing, zoals beschreven in stap 1.1.3.
- Breng de doorstraalde poppen onmiddellijk over naar de voorbereide opfokkooien na terugkeer uit de bestralingsinstallatie. Gebruik een knijpfles water om de poppen van elke petrischaal voorzichtig te wassen in de 460 ml water in de plastic beker in elke opfokkooi. Breng na 24 uur de bekers over naar nieuwe, schone opfokkooien met de voedingsbron en wacht op de resterende eclosie van volwassen, door mannen bestraalde Aedes aegypti.
OPMERKING: Als er tijdens het bestralingsproces poppen zijn ontstaan, opent u de petrischalen met de flyers in een lege kooi en gaat u verder met stap 5.2. Gooi de mannetjes weg die in deze kooi zijn verzameld. Poppen worden na 24 uur overgebracht naar nieuwe opfokkooien omdat mannetjes vóór vrouwtjes van hetzelfde cohort tevoorschijn komen en het isoleren van de dagen van opkomst de incidentie van vrouwelijke besmetting kan verminderen en een nauwkeurige veroudering van mannetjes kan garanderen.
6. Merken en wegen van doorstraalde volwassen Aedes aegypti-mannetjes
OPMERKING: In dit gedeelte van het protocol wordt ervan uitgegaan dat twee personen de taken uitvoeren; voor 1 persoon, zie 6.4.
Figuur 6: Verpakking van gemerkte, doorstraalde, mannelijke Aedes aegypti in lossingscontainers. (A) Laat de container met stockinette los die is bevestigd aan een gat dat in de zijkant van de cardstock-cilinder is gesneden met afplaktape, nietjes en hete lijm. De bezel is op zijn plaats met een masking tape label achterkant bevestigd aan de zijkant. De bezel behoudt de strak getrokken tule mesh cover; een elastische band (niet zichtbaar) houdt ook de tule op zijn plaats onder de bezel. (B) Partij verdoofde mannetjes die in een kleine kartonnen beker worden getrommeld in roze kleurstof. (C) Vier lossingscontainers in geïsoleerde zeecontainers. Merk op dat de stockinette-sleeves zijn gericht op het midden van de verzendcontainer, verpakkingsmaterialen zijn weggestopt rond de releasecontainers en voedings- en hydratatiebronnen zijn op hun plaats bovenop elke releasecontainer bedekt met een omgekeerde petrischaalbodem die vast wordt gehouden door gekruiste elastische banden en stukjes tape. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bereid kaartpapiercontainers voor.
- Knip een gat met een diameter van 11,5 cm in de zijkant van een deksel, cilindrisch 3,9 L cardstock-container op 1,5-3,0 cm van de bodem, zodat het gat niet door het deksel wordt bedekt (figuur 6A).
- Snijd een 40-50 cm lengte van stockinette en niet het ene uiteinde ervan rond de binnenkant van het gat van 11,5 cm gesneden in 6.1.1. Gebruik een standaard kantoor nietmachine die is geopend, zodat nietjes vanaf de binnenkant van de container door de stockinette en de cardstock kunnen worden geperst en in een geschikt werkoppervlak kunnen worden geperst, zoals een blok hard geëxtrudeerd polystyreenschuim. Krimp de nietjes met een platte schroevendraaier om de stockinette stevig aan de omtrek van het gat te bevestigen en bevestig afplaktape over de gekrompen kant om haken en ogen te voorkomen. Sluit de rand van de stockinette aan de binnenkant van de cilinder af op de cardstock met hete lijm en controleer de hele assemblage op ontsnappingsgaten.
- Maak een bevestigingsrand door de binnenste schijf van het deksel te verwijderen en snijd een vierkant van 33 cm x 33 cm nylon tule gaas fijn genoeg om volwassen mannelijke Aedes aegypti-muggen te behouden. Plaats het gaas op het open uiteinde van de cilinder en plaats de rand over het gaas om het op zijn plaats te houden zonder openingen. Trek het gaas naar beneden zodat het onder de rand uitsteekt om het gaas over het open uiteinde te laten leren en sluit het uitstekende gaas strak tegen de cilinder af met een elastiekje.
- Plaats een stuk afplaktape van 10 cm aan de zijkant van de bezel bedekt met een stuk labeltape van 8 cm, zodat de labeltape gemakkelijk kan worden vervangen zonder de rand te scheuren.
OPMERKING: Lossingscontainers zijn duurzaam en kunnen > 10x worden hergebruikt met de juiste behandeling. Voordat u elke nieuwe partij gemarkeerde, bestraalde, volwassen, mannelijke muggen introduceert, controleert u of de stockinette veilig aan de container is bevestigd en voert u indien nodig onmiddellijk reparaties uit.
- Bereid het weeg- en markeerstation voor.
- Giet ongeveer 50 mg markeerkleurstof in een 240 ml cardstock-container en verdeel de kleurstof als een laag poeder gelijkmatig over de binnenoppervlakken van de container. Tik voorzichtig om overtollige kleurstof weg te gooien. Gebruik duidelijk gelabelde kopjes voor meerdere kleurstoffen om de kleuren gescheiden te houden.
- Tarra een weegboot van 100-500 g op een elektronische balans van 0,0001 g; een gegevensformulier maken (tabel 3); en plak vier vellen kopieerpapier van 215,9 mm x 355,6 mm aan elkaar tot een werkoppervlak van 431,8 mm x 711,2 mm.
| Vrijgave container | Gewicht van muggen | Kooinummer | Vrouwtjes in Batch | Aantal mannen | Vrijgave container | Totale massa |
| ROZE I | 0.024 | D1 # 1 | 25 | ROZE I | 2.03 | |
| ROZE I | 2.007 | D1 # 1 | 7 | ROZE II | 1.99 | |
| ROZE II | 1.990 | D1 # 1 | ROZE III | 2.03 | ||
| ROZE III | 0.026 | D1 # 3 | 25 | |||
| ROZE III | 2.000 | D1 # 3 | 18 |
Tabel 3: Tabel met weegstations.
- Mark kwantificeerde partijen volwassen bestraalde mannetjes met fluorescerend pigment.
- Breng volwassen muggen (2,5-3,5 dagen oud) van elke opfokkooi over in injectieflacons met aspirator. Verwijder voedingsbronnen uit de opfokkooi vanaf stap 5.2 en plaats de hele kooi gedurende 5-7 minuten in een grote CO2-kamer , waarbij u de zijkanten van de container klopt om muggen te verjagen die zich mogelijk aan de opfokkooi vastklampen. Nadat de blootstellingstijd is verstreken, verwijdert u de opfokkooi uit de kamer en zuigt u alle volwassen muggen op in een reeks plastic aspiratieflacons.
OPMERKING: Toediening van de 99,5-100% CO2 is afkomstig van een tank met een regelaar, messing weerhaak en siliconenbuis die in de kamer zijn gekanaliseerd met een stroomsnelheid van 6 L / min. Het aantal injectieflacons dat nodig is om de opfokkooi vrij te maken, hangt af van het aantal muggen in de kooi en de vaardigheid van de operator, maar er zijn meestal 3-5 injectieflacons per kooi nodig. Kies een aspirator met kleine snelwisselflacons om het beheer van volwassen muggen in batches te vergemakkelijken, bijvoorbeeld een met behulp van een 60 ml polystyreen verzamelflacon verzegeld met 20 x 20 mesh aluminium scherm aan het ene uiteinde en een duidelijke acetaatklepklep aan de andere kant. De hele kooi wordt verdoofd voordat de tijd wordt verkort om muggen over te brengen naar flacons om de stress op muggen te verminderen en het protocol handelbaar te houden. - Sorteer alle volwassen muggen uit elke opfokkooi op geslacht.
- Stel de eerste injectieflacon van stap 6.3.1 gedurende 4 minuten bloot aan CO2 in een kleine kamer en schud vervolgens de verdoofde muggen voorzichtig uit en verspreid ze over het witte papieren werkoppervlak dat is voorbereid in stap 6.2.2.
- Laad een nieuwe lege injectieflacon in de aspirator en zuig alle mannetjes voorzichtig van het werkoppervlak en geef deze injectieflacon door aan het weegstation (stap 6.3.3.). Tel alle achtergebleven vrouwtjes op en haal ze in een aparte flacon en gooi ze weg, samen met eventuele verpletterde mannetjes.
- Herhaal dit proces met de resterende injectieflacons van 6.3.1, maar genereer op een bepaald moment in het sekssorteerproces een aparte injectieflacon met slechts 25 mannetjes die ook aan het weegstation wordt doorgegeven. Herhaal stap 6.3.2. voor elke opfokkooi.
OPMERKING: Houd tijdens het verwerken van bestraalde volwassen mannetjes voor seks, wegen en markeren het aantal vrouwtjes in elke batch bij, wat belangrijke gegevens zijn voor het oplossen van problemen en kwaliteitsborging van het sorteren van popseks en het hele proces. Als het aantal vrouwen hoger is dan verwacht, moet een tweede persoon vrouwtjes extraheren terwijl de hoofdoperator de mannetjes aspirateert. Het is belangrijk om een monster van 25 mannetjes uit elke opfokkooi te wegen om een gemiddeld gewicht per mug te berekenen, dat zal worden gebruikt om het aantal gemarkeerde bestraalde mannetjes te schatten dat aan het einde van het protocol wordt vrijgegeven.
- Weeg en verf partijen volwassen mannelijke muggen.
- Plaats op het weegstation de eerste injectieflacon met volwassen mannelijke muggen van het seksstation (punt 6.3.2) gedurende 2 minuten in een kleine CO2-kamer en schud de muggen voorzichtig in de geteerde weegboot die in stap 6.2.2 is voorbereid. Noteer het gewicht van de muggen en giet de muggen in de kleurstofbeker bereid in 6.2.1.
- Kantel en draai de beker langzaam 1 volledige rotatie met de klok mee en tegen de klok in, zodat de muggen contact maken met de poedercoating op de binnenoppervlakken van de beker en allemaal licht worden bestrooid met kleurstof (figuur 6B). Giet de gemarkeerde muggen in een weegboot.
- Ga snel verder met de volgende stap, zodat de muggen niet herstellen en ontsnappen. Herhaal deze stap totdat alle injectieflacons uit rubriek 6.3.2 zijn verwerkt.
OPMERKING: Het gewicht van de mannetjes uit de afzonderlijke injectieflacon met 25 mannetjes die in punt 6.3.2 voor elke opfokkooi is gegenereerd, wordt geregistreerd en gebruikt om het gemiddelde gewicht per mannetje uit die kooi te berekenen.
- Laad de lossingscontainers met gemarkeerde bestraalde volwassen mannetjes. Vouw de weegboot met verdoofde, gemerkte, bestraalde mannelijke muggen vanaf het einde van punt 6.3.3 licht op. om een kanaal te maken en vervolgens dit kanaal door de stockinette sleeve te leiden om de mannetjes in de release container over te brengen. Blijf muggen toevoegen tot ongeveer 2,0 g of 1500-3000 mannelijke muggen in de ontgrendelingscontainer zitten en bind de stockinette-hoes dicht. Markeer de labeling tape op de rand van de lossingscontainer met kleurstofkleur, containernummer en totaalgewicht muggen en kopieer deze gegevens naar het formulier uit stap 6.2.2.
OPMERKING: Het hanteren van muggen in elke levensfase veroorzaakt stress en kan de overleving of kracht verminderen. De reeks verdovingen die in dit protocol worden beschreven, kunnen van invloed zijn op de muggen; pogingen om niet-verdoofde muggen bij elke stap te achtervolgen en aan te zuigen, zouden echter meer stress en een niet-duurzaam protocol veroorzaken. Deel het totale gewicht van muggen in elke lossingscontainer door het gemiddelde gewicht per mannelijke mug gegenereerd in punt 6.3.3 om een schatting af te leiden van het aantal mannetjes in die vrijgavecontainer; elke loslaatcontainer mag niet meer dan 2 g mannetjes bevatten, wat overeenkomt met ongeveer 1 grote opfokkooi.
- Breng volwassen muggen (2,5-3,5 dagen oud) van elke opfokkooi over in injectieflacons met aspirator. Verwijder voedingsbronnen uit de opfokkooi vanaf stap 5.2 en plaats de hele kooi gedurende 5-7 minuten in een grote CO2-kamer , waarbij u de zijkanten van de container klopt om muggen te verjagen die zich mogelijk aan de opfokkooi vastklampen. Nadat de blootstellingstijd is verstreken, verwijdert u de opfokkooi uit de kamer en zuigt u alle volwassen muggen op in een reeks plastic aspiratieflacons.
- Wijzigingen in het markeringsprotocol voor één operator
- Voer eerst sekssortering uit voor alle grote kooien. Stel elke grote kooi gedurende 4-5 minuten bloot aan CO2 en zuig alle muggen op in 4-5 injectieflacons. Stel elke injectieflacon gedurende2-3 minuten bloot aan CO 2, tip alle muggen op het witte papieren werkoppervlak, verwijder de vrouwtjes en tel, en breng de mannetjes terug naar hun grote populatiekooi.
- Wegen en markeren
- Begin met de eerste mannelijke kooi die in stap 6.4.1 is geproduceerd: verwijder de voedingsbron en verdoof de mannetjes gedurende 5-7 minuten in een grote CO2-kamer . Aspirateer de verdoofde mannetjes gelijkmatig in afzonderlijke injectieflacons. Herhaal deze stap met elke kooi in de volgorde waarin ze zijn geproduceerd.
OPMERKING: Er worden ongeveer 2-3 overvolle injectieflacons geproduceerd per kooi. Het verwerken van mannelijke kooien in de volgorde waarin ze zijn geproduceerd, maximaliseert de hersteltijd voor elke kooi van mannetjes. - Verdoof de eerste injectieflacon die in stap 6.4.2.1 is geproduceerd. gedurende 1-2 minuten in een kleine CO2-kamer . Giet een klein aantal muggen uit op het witte papieren werkoppervlak, zuig 25 mannelijke muggen op in een nieuwe injectieflacon en verwerk zoals in 6.3.2 om het gemiddelde gewicht per mannetje voor die kooi te bepalen. Breng eventuele extra mannetjes terug naar de bronflacon of aspirateer in een nieuwe afzonderlijke injectieflacon die later moet worden verwerkt; ga verder met het wegen, markeren en overbrengen naar de lossingscontainers voor de rest van de mannetjes in de eerste injectieflacon zoals beschreven in de rest van stap 6.3. Herhaal stap 6.4.2.2. (met uitzondering van het isoleren van 25 mannetjes in een afzonderlijke injectieflacon) voor de rest van de injectieflacons geproduceerd in stap 6.4.2.1. in de volgorde waarin ze zijn geproduceerd, en ga dan verder met de volgende geslachtsgesorteerd opfokkooi geproduceerd in 6.4.1.
OPMERKING: Workflows met één persoon zijn langzamer en sommige mannelijke muggen moeten meerdere keren worden verdoofd. Zoek en verwijder voortdurend vrouwelijke muggen.
- Begin met de eerste mannelijke kooi die in stap 6.4.1 is geproduceerd: verwijder de voedingsbron en verdoof de mannetjes gedurende 5-7 minuten in een grote CO2-kamer . Aspirateer de verdoofde mannetjes gelijkmatig in afzonderlijke injectieflacons. Herhaal deze stap met elke kooi in de volgorde waarin ze zijn geproduceerd.
7. Verpakkings- en verzendcontainers van gemerkte, doorstraalde, volwassen mannelijke Aedes aegypti
- Bereid de lossingscontainers voor op verzending. Zodra een ontgrendelingscontainer is gevuld met gemarkeerde mannetjes, plaatst u 4 wattenbollen bevochtigd met 10% sucrose-oplossing op het gaasdeksel en bedekt u met een omgekeerde bodem van een petrischaal die op zijn plaats wordt gehouden door twee elastiekjes die rond de hele container en over de petrischaal zijn gespannen om een kruis te vormen. Plaats een stuk afplaktape over de X van de twee elastiekjes om ze op hun plaats te houden bovenop de omgekeerde petrischaal.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de wattenbollen met 10% sucrose-oplossing niet verzadigd zijn tot het punt van druppelen, wat de container zal beschadigen en muggen zal vangen en doden. - Verpak cardstock release containers in een geëxtrudeerde polystyreen schuim verzendkoeler. Prik 4 ventilatiegaten door het deksel van de koeler en sluit af met katoen om mieren buiten te houden en ontsnapte muggen binnen te houden. Plaats 4 losgelaten containers rechtop in de verzendkoeler met de stockinette van elke container naar het midden gericht (figuur 6C). Stop noppenfolie tussen elke container en in het midden om ze te stabiliseren. Vul de rest van de ruimte in de verzendkoeler in met luchtkussens of stapel een tweede laag van 4 lossingscontainers direct op de eerste laag en stabiliseer op dezelfde manier met luchtkussens.
OPMERKING: De lossingscontainers moeten voldoende gestabiliseerd zijn om niet te bewegen wanneer ze worden geschud. De temperatuur in de verpakking is omgevingstemperatuur. - Bereid de verzendkoeler voor op levering. Sluit de verzendkoeler af met het geventileerde deksel en plaats deze in de kartonnen oververpakking, tape dicht en verzend deze via overnight express naar de releaselocatie.
Representative Results
Waakzame en adequate muggenopfok bestaat uit een evenwichtige beschikbaarheid van mannetjes en vrouwtjes in koloniekooien, onderhoud van verse sucrose-oplossing en honing en consistente bloedvoeding van hoge kwaliteit. Deze omstandigheden zullen zorgen voor dicht opeengepakte eiervellen die optimaal zijn voor gebruik in SIT-opfokpannen. Een goede opslag en gebruik van gedroogde eiervellen, zoals systematische etikettering om het gebruik van oudste naar nieuwste te vergemakkelijken, ondersteunt uniform uitkomen in alle pannen. Het vullen van alle larvale opfokpannen met water voorafgaand aan het uitkomen kan de tijd verkorten waarvoor de eiervellen in broedcontainers zitten en een gezonde ontwikkeling bevorderen. Onderhoud van larvale pannen van luik tot verpopping vereist zorgvuldige betrokkenheid van koloniepersoneel, omdat sommige pannen meer of minder voedsel of extra water nodig hebben, afhankelijk van ontwikkelingsstadia en omgevingsvariabelen. Als er problemen zijn met het stadium van ontwikkeling op de geplande dag van de scheiding van het popgeslacht, moeten aanpassingen eerder in het proces worden aangebracht, zoals eerder of later uitkomen, voedsel aanpassen of de couveusetemperatuur wijzigen.
Het opfokproces in dit protocol zorgt er niet voor dat alle eieren op tijd zijn uitgekomen om zich te ontwikkelen tot poppen die kunnen worden bestraald en gebruikt voor controledoeleinden. Tussen de 20 en 50% van de in de kolonie gekweekte muggen zullen nog steeds larven zijn tegen de tijd dat de poppen moeten worden gescheiden. Deze larven worden echter niet verspild, maar mogen 24 uur rijpen om extra poppen te maken die kunnen worden gecombineerd met vrouwelijke poppen van de scheiding van de vorige dag en terug kunnen worden gerecycled in koloniekooien. In de koloniekooien mogen poppen rijpen tot volwassenen, paren, bloed voeden en eieren produceren die het SIT-project ondersteunen.
Het scheiden van poppen, het gieten van poppen in petrischalen, bestraling en plaatsing in kooien voor volwassenen na bestraling moeten in één dag gebeuren; daarom moet voldoende tijd worden toegewezen om alle stappen comfortabel te verwerken. De montage en voorbereiding van lossingscontainers moet voorafgaand aan het markeringsproces worden gedaan. Wanneer verzenddozen worden geretourneerd van de releaselocatie, moeten lossingscontainers worden geïnspecteerd en voorbereid voor hun volgende gebruik. Het weggooien van natte wattenbollen, het luchten van natte afgiftecontainers, het schoonmaken van petrischalen, het vervangen van gaas en het verwijderen van elastieken uit de container, terwijl ze niet in gebruik zijn, zal de levensduur van de lossingscontainers aanzienlijk verlengen.
Gezien de wereldwijde realiteit van de COVID-19 virale pandemie, is dit protocol dat typisch een operatie met meerdere personen is, aangepast om te worden behandeld door één persoon die alleen in een laboratorium werkt voor elke stap. De stappen in het proces die het meest worden belemmerd door een eenpersoonsscenario zijn de geslachts-, markerings-, weeg- en kolonie-opfokonderhoudsstappen. Het scheiden van poppen naar geslacht door één persoon zou voldoende moeten zijn als er meerdere separatoren tegelijkertijd in verschillende kamers werken. In een pandemische situatie waarin social distancing optreedt op de werkplek, is het uitrusten van meerdere stations vereist om stappen van seksen tot inpakken te voltooien. Afhankelijk van de snelheid van de operator, kost het één persoon ~ 4 uur om 15.000 muggen te seksen en vervolgens nog eens 1-2 uur om ze te markeren, te wegen en te verpakken. Een scenario voor twee personen vermindert de tijd waarin muggen worden verdoofd voor markering en vermindert de totale werktijd. Maar zelfs in een scenario voor twee personen kan het toewijzen van de volledige 2,0 g muggen per kooi een uitdaging zijn vanwege de beperkte werktijd terwijl de muggen worden verdoofd. Hoewel het proces van het reinigen en voorbereiden van larvale en volwassen opfokmaterialen extreem tijdrovend en arbeidsintensief is, kan het zodanig worden verdeeld dat individuele operators tijdens een pandemie onafhankelijk en veilig kunnen werken.
Het loslaten van volwassen, gemarkeerde, bestraalde Aedes aegypti mannetjes valt buiten het bestek van dit protocol maar wordt hier in het kort gepresenteerd. Het proces van het vrijgeven van gemerkte, bestraalde, mannelijke muggen begint met het bepalen van een uniforme afgifteverdeling van de lossingscontainers op basis van gewichten (en dus afgeleide aantallen steriele mannetjes), zoals gerapporteerd in tabel 3. Nadat de zendingen zijn afgeleverd bij het vectorcontroledistrict, worden de dozen geopend en worden de lossingscontainers beoordeeld op eventuele problemen met de mortaliteit of toestand van de lossingscontainers. Muggen in de afgiftecontainers mogen dan 1-2 uur wennen aan de omgevingstemperatuur en vochtigheid voorafgaand aan het transport naar het behandelingsgebied. Vrijlatingsplaatsen in het behandelingsgebied worden geïdentificeerd na intensieve bewaking van hotspots van wilde populaties van Aedes aegypti. De timing, frequentie en dichtheid van releases wordt gecompenseerd door de bionomica van de soort, evenals meteorologie, publieke steun en laboratoriumopfokmogelijkheden.
Aangezien specifieke vrijgavecontainers worden afgestemd op bepaalde introductieplaatsen, moet het etiket worden gecontroleerd voordat de vrijgavecontainer wordt geopend door het gaas aan de bovenkant te snijden, zodat de exploitant het gaas kan vervormen zodat een deel van de mannetjes kan ontsnappen. Deze fractionele afgiftemethode wordt herhaald op elk toegewezen afgiftepunt voor de container totdat alle vrij rondvliegende mannetjes zijn vrijgelaten. Dit proces wordt vervolgens herhaald voor elke releasecontainer op de respectievelijke toegewezen releaselocatie totdat alle containers zijn verwerkt. Optioneel, nadat de muggen zijn vrijgelaten, kunnen dode of gehandicapte muggen die niet vrij zijn vertrokken, worden verzameld in petrischalen en worden geëtiketteerd om met de hand te worden geteld of gewogen om het geschatte aantal vrijgegeven te corrigeren. Doorlopende en alomtegenwoordige bewaking van volwassen, ei- en onrijpe stadia van wilde Aedes aegypti in het doelgebied, en mogelijk op niet-interventiecontrolelocaties, wordt uitgevoerd om de werkzaamheid van de SIT-operatie te beoordelen.
Discussion
Het initiëren van een controleprogramma met SIT dat straling gebruikt, vereist de oprichting van een lokale stam van Aedes aegypti. Deze stap is van cruciaal belang en kan SIT in staat stellen zich echt te onderscheiden van vergelijkbare besturingstechnologieën. Door het project te ontwikkelen op basis van een lokale muggenstam, zullen de gegenereerde mannetjes waarschijnlijk gedrag vertonen dat hen in staat stelt zich aan te passen aan veranderingen en signalen in de omgeving en om wilde vrouwtjes in de buurt te lokaliseren en ermee te paren. Bovendien kan het vrijkomen van bestraalde lokale mannetjes geen negatieve publieke opinie genereren in vergelijking met bijvoorbeeld de vrijlating van een niet-lokale stam van genetisch gemodificeerde muggen die bijvoorbeeld nieuwe allelen in de lokale muggenpopulatie kunnen introduceren.
Het besteden van aanzienlijke middelen om enorme hoeveelheden muggen te kweken om ongeveer de helft ervan te kunnen gebruiken voor controledoeleinden is een beperking van het Aedes aegypti SIT-programma. Er moeten verfijningen worden aangebracht in het opfokprotocol om de rijping van larven te condenseren tot meer gedefinieerde tijdsbestekken wanneer de poppen klaar zullen zijn. Hierdoor zouden meer poppen kunnen worden verzameld op het optimale moment van scheiding. Extra poppen om te verwerken verhoogt echter het risico dat meer vrouwtjes verpoppen wanneer de poppen worden verzameld en verhoogt daarom de kans dat vrouwtjes in petrischalen met mannetjes terechtkomen en mogelijk worden vrijgelaten. Hoewel de levensduur, het bloedtoevoergedrag en het ovipositiegedrag bij bestraalde vrouwelijke Aedes aegypti-poppen bij volwassenen worden verminderd, is het geen goede strategie om vrouwtjes incidenteel vrij te laten naast bestraalde mannetjes22. Daarom moet het een prioriteit blijven om het aantal vrouwtjes dat per ongeluk gescheiden, bestraald, gemarkeerd en vrijgelaten wordt met mannetjes te minimaliseren.
Het succes van een SIT-programma is uiteindelijk afhankelijk van succesvolle partnercompetitie door kolonie-gefokte, bestraalde mannetjes. Het behoud van het mannelijke concurrentievermogen is afhankelijk van een uitputtende experimenteel afgeleide selectie van de dosis en het maximaliseren van de geschatte verhouding steriele: wilde mannetjes in de populatie. Dosisselectie wordt bepaald door verschillende belangrijke factoren, waaronder levensduur, vruchtbaarheid, vruchtbaarheid en popsterfte. Er is waargenomen dat mannelijke muggen een asymptotische vruchtbaarheidscurve vertonen die nul nadert naarmate de straling toeneemt (KJL, RLA, SCB ongepubliceerde gegevens). Tegelijkertijd nemen de levensduur en activiteitsniveaus van mannelijke muggen exponentieel af naarmate de stralingsdosis toeneemt (KJL, RLA, SCB ongepubliceerde gegevens). Daarom, in plaats van een dosis te identificeren die 99,9% steriliteit bij mannen oplevert, is het beter om te focussen op een lager steriliteitspercentage en tegelijkertijd het overleven te ondersteunen. Zodra een dosisbereik is vastgesteld dat geen onderscheid maakt tussen de levensduur of de popsterfte van bestraalde mannetjes en die van niet-bestraalde mannetjes, moeten aanvullende beoordelingen van de vruchtbaarheid worden uitgevoerd om een dosis te identificeren die mannen overweldigend steriel maakt, maar toch concurrerend.
Tegelijkertijd is het van cruciaal belang om het aantal mannelijke muggen in de populatie te vergelijken met dat van vrijgelaten bestraalde mannetjes. Dit kan worden bereikt door mannetjes van verschillende locaties in en rond het doelgebied herhaaldelijk van dezelfde locatie en voor, tijdens en na het starten van het SIT-programma te verzamelen. Een markerings-, vrijlatings- en heroveringsstudie moet worden uitgevoerd om de verhouding tussen wilde mannelijke muggen en vrijgelaten muggen te beoordelen. Een markerings-, vrijgave-, hervangststudie is gebaseerd op het vrijkomen van een bekend aantal gemarkeerde muggen vanaf een specifiek punt en hun latere herovering op punten in de nabijheid rond het oorspronkelijke releasepunt. Door het aantal heroverde mannetjes en wilde mannetjes op afstanden van het loslaatpunt te vergelijken, is het mogelijk om de algemene wilde populatie van mannetjes in het gebied te schatten, zodat concurrerende verhoudingen van steriele mannetjes kunnen worden vrijgelaten23. Het maximaliseren van de verhouding steriele: wilde mannetjes kan worden bereikt door meer steriele mannetjes vrij te laten en / of door de wilde populatie te verminderen door klassieke controlemiddelen zoals bronreductie, onvolwassen controle of adulticide-behandelingen.
Om de effectiviteit van steriele mannelijke releases te meten, kunnen volwassen collecties chronologisch worden vergeleken met een non-interventiegebied. Naarmate steriele mannetjes worden vrijgelaten en het aantal verzamelde mannetjes en vrouwtjes in een gebied afneemt in relatie tot een vergelijkbaar non-interventiegebied, kan worden verondersteld dat dit te wijten is aan de vrijgelaten steriele mannetjes die met succes lokale vruchtbare mannetjes overtreffen. Dit effect kan ook worden waargenomen in ovipositievalbekers die zowel op de interventie- als op de niet-interventielocatie worden ingezet. Eieren kunnen nog steeds op de interventieplaats worden geproduceerd, maar als er minder uitkomen dan die van de niet-interventieplaats, kan worden verondersteld dat ze niet worden bevrucht vanwege vrouwtjes die paren met steriele mannetjes. Meer en meer ovipositie van onbevruchte eieren kan uiteindelijk leiden tot verminderde ovipositie als gevolg van het niet vervangen van vrouwtjes op de interventieplaats 8,24.
Toekomstige richtingen van SIT-technologie en -programma's breiden zich natuurlijk uit naar extra medisch belangrijke muggensoorten. Deze technologie kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden aangepast om Aedes albopictus te beheersen, gezien de zeer vergelijkbare bionomica van Aedes aegypti en Aedes albopictus. Andere ziektevectormuggensoorten van belang zijn Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis en verschillende Anopheles-soorten . Het verbeteren van de werkzaamheid van deze technologie hangt af van het verhogen van de capaciteit van mannelijke poppen die op een bepaald moment worden geproduceerd, wat kan worden bereikt door genetische manipulatie of kunstmatige selectie, en het verbeteren van het mannelijke concurrentievermogen, wat kan worden bereikt door de viriliteit, vruchtbaarheid of levensduur te verhogen.
Uiteindelijk zijn SIT-programma's geen wondermiddel voor het bestrijden van muggen. Ze zijn in plaats daarvan een hulpmiddel in een reeks andere besturingstechnieken, zoals IVM-programma's, die kruiscompenseren voor zwakke punten tussen technieken. Terwijl chemische bestrijding bijvoorbeeld een snelle en goedkope bestrijding biedt, bevordert het ook de ontwikkeling van resistentie en niet-doelsterfte; en terwijl SIT soortspecifiek is en waarschijnlijk geen resistentie zal genereren, moeten SIT-mannetjes voor altijd worden geproduceerd en vrijgelaten om immigrerende populaties van buiten het vectorcontroledistrict te beheersen.
Disclosures
Alle auteurs hebben verklaard geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
Wij danken Drs. R.-D. Xue, C. Bibbs, W. Qualls en V. Aryaprema van het Anastasia Mosquito Control District, St. Augustine, Florida, voor samenwerking bij het ontwikkelen van het SIT-programma en deskundig inzicht in effectieve operationele vrijlating van steriele mannelijke Aedes aegypti. Dit onderzoek werd ondersteund door de USDA-ARS en het Florida Department of Agriculture and Consumer Services (FDACS). Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in deze publicatie is uitsluitend bedoeld om specifieke informatie te verstrekken en impliceert geen aanbeveling of goedkeuring door USDA of FDACS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm) | Craftsman | CMMT44707 | |
| 1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL) | Science Supplies WLE corp | 1/2 pint | |
| 1/4" tubing - tygon | Hudson Extrusions | LLDPE1/8 X 1/4 BLK | to attach to CO2 gas regulator |
| 1/8" brass barb w/ MIP connection | B&K | BHB-85NLB | to attach to CO2 gas regulator |
| 1000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-1000 | |
| 3000 mL graduated plastic beakers with handle | Thermo Scientific | 1223-3000 | |
| Adult large cage | Bioquip | 1450D | |
| Aspirator vials | Bioquip | 2809V | |
| Bovine liver powder | MP Biomedicals | 290039601 | |
| Brewers yeast | MP Biomericals | 02903312-CF | |
| CO2 regulator | Randor | 64003038 | |
| CO2 tank (20# canister) | Praxair | CDBEVCARB20 | |
| Collection basin | Treasure Gurus | KI-ENAMELBOWL | for separator |
| Cotton balls - large | Fisher Scientific | 22-456-883 | |
| Deli cups w/lids - 470 mL | Pactiv DELItainer | PCTYSD2516 | |
| Deli cups w/lids - 1900 mL | Berry Global | T60764 | |
| DoseReader 4 | ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards | ||
| Dosimetry film | Far West Technology, Inc. | ||
| Filter paper | Millipore | AP10045S0 | |
| Flashlight aspirator | Bioquip | 2809D | |
| Forceps - fine featherweight | Bioquip | 4748 or 4750 | featherweight |
| GAFchromic | radiochromic film | ||
| Gammator M | Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ | Cesium-137 irradiator | |
| Hand held mechanical aspirator | Clarke Mosquito | 13500 | |
| Lambskin condoms | Trojan | Naturalamb | |
| Large CO2 chamber | Sterilite | Walmart # 568789514 | |
| Larval rearing pans | Blue Ridge Thermoforming | 01-FG-400-3N-ABS | Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches) |
| Magnets - 20# pull | Master magnetics | MHHH20BX | |
| Marking dye | Dayglo | ECO-11 | Aurora Pink |
| Marking dye | Dayglo | ECO-17 | Saturn Yellow |
| Mesh | Falk | T301 | |
| Pasture pipettes | Thermo Scientific | 02-708-006 | |
| Petri dishes - large | VWR International | 25384-090 CS | |
| Petri dishes - small (60 mm x 15 mm) | Fisher Brand | FB0875713A | |
| Pupa separator | J.W. Hock | 1512 | |
| Red rubber hose | Welch | 331040-5 | |
| Release containers | Science Supplies WLE corp | 1 gallon | |
| Rubber bands - cross #19 | Alliance | ALL37196 | |
| Rubber bands - latitude #64 | Skillcraft | NSN0589974 | |
| Scale | Ohaus | H-4737 | |
| Seed germination paper - Heavy stock 76# | Anchor Paper | #76 | |
| Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5" | MrBoxonline.com | Husky Foam Cooler kit | |
| Sieve #20 | Advantech | 20BS8F | |
| Sieve #30 | Advantech | 30BS8F | |
| Small cage - Bug Dorm | MegaView | Bug Dorm-1 | |
| Small CO2 chamber | Mainstays | Walmart # 562922221 | |
| Souffle cup lid | SOLO | 41165277456 | |
| Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL) | SOLO | 41165024104 | |
| Sponge | ocelo | MMM7274FD | |
| Squeeze bottle | Dynalon | 3UUP6 | |
| Stereoscope | Meiji Techno | EMZ-5 | |
| Stockinette | BSN Medical | 30-1006 | |
| Styrofoam | extruded polystyrene foam | ||
| Tropical fish flake food | Tetra | 4.52 pound | |
| Vaccum chamber - desiccator | BelArt | T9FB892757 | |
| Weigh boats | Globe Scientific | 3621 |
References
- Moyes, C. L., et al. Contemporary status of insecticide resistance in the major Aedes vectors of arboviruses infecting humans. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (7), 0005625 (2017).
- Baldacchino, F., et al. Control methods against invasive Aedes mosquitoes in Europe: a review. Pest Management Science. 71 (11), 1471-1485 (2015).
- Burkett, D. A., Cope, S. E., Strickman, D. A., White, G. B. The Deployed Warfighter Protection (DWFP) Research Program: Developing new public health pesticides, application technologies, and repellent systems. Journal of Integrated Pest Management. 4 (2), 1-7 (2013).
- Harwood, J. F., et al. Controlling Aedes aegypti in cryptic environments with manually carried ultra-low volume and mist blower pesticide applications. Journal of the American Mosquito Control Association. 32 (3), 217-223 (2016).
- Morrison, A. C., Zielinski-Gutierrez, E., Scott, T. W., Rosenberg, R. Defining challenges and proposing solutions for control of the virus vector Aedes aegypti. PLoS Medicine. 5 (3), 68 (2008).
- Klassen, W., Curtis, C. F. History of the sterile insect technique. Sterile insect technique: principles and practice in area-wide integrated pest management. InDyck, V. A., Hendrichs, J., Robinson, A. S. , Springer. Netherlands, Dordrecht. 3-36 (2005).
- Alphey, L., et al. Sterile-insect methods for control of mosquito-borne diseases: an analysis. Vector Borne and Zoonotic Diseases. 10 (3), 295-311 (2010).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 (2009).
- FAO IAEA. Guidelines for colonization of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www.naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-colonisation-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.final.pdf (2018).
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PloS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. B. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta Tropica. 157, 115-130 (2016).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e3579 (2014).
- Carvalho, D. O., et al. Aedes aegypti lines for combined sterile insect technique and incompatible insect technique applications: the importance of host genomic background. Entomologia experimentalis et applicata. 168 (6-7), 560-572 (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mass-rearing of Aedes mosquito species. Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-mass-rearingofAedes-mosquitoes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for mark-release-recapture procedures of Aedes mosquitoes. Bouyer, J., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/Guidelines-for-MRR-Aedes_v1.0.pdf (2020).
- FAO/IAEA. Guidelines for Routine Colony Maintenance of Aedes Mosquito Species, Version 1.0. Maiga, H., et al. , Vienna, Austria. Available from: http://www-naweb.iaea.org/nafa/ipc/public/guidelines-for-routine-colony-maintenance-of-Aedes-mosquito-species-v1.0.pdf (2017).
- Mamai, W., et al. Aedes aegypti larval development and pupal production in the FAO/IAEA mass-rearing rack and factors influencing sex sorting efficiency. Parasite. 27, 43 (2020).
- Zheng, X., et al. Incompatible and sterile insect techniques combined eliminate mosquitoes. Nature. 572 (7767), 56-61 (2019).
- BEI Resources. Methods in Aedes Research. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods%20in%20Aedes%20Research%202016.pdf (2016).
- Focks, D. A. An improved separator for the developmental stages, sexes, and species of mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 17 (6), 567-568 (1980).
- International Atomic Energy Agency. Manual of Dosimetry in Radiotherapy. Technical Reports Series No. 110. , Vienna. (1970).
- Aldridge, R. L., et al. Gamma-irradiation reduces survivorship, feeding behavior, and oviposition of female Aedes aegypti. Journal of the American Mosquito Control Association. 36 (3), 152-160 (2020).
- Cianci, D., et al. Estimating mosquito population size from mark-release-recapture data. Journal of Medical Entomology. 50 (3), 533-542 (2013).
- Knipling, E. F. The basic principles of insect population suppression and management. , United States Department of Agriculture. Washington, DC. (1979).
