Summary
Мы разработали новый подход к потере функции, который включает в себя введение и геномную интеграцию искусственных последовательностей микро-РНК в эмбрионы цыплят с использованием внутрияйцевой электропорации и транспозонной системы Tol2. Этот метод обеспечивает надежную и стабильную методологию нокдауна генов для изучения функции генов во время развития.
Abstract
Сетчатка цыпленка долгое время была важной модельной системой в нейробиологии развития, обладая такими преимуществами, как ее большой размер, быстрое развитие и доступность для визуализации и экспериментальных манипуляций. Тем не менее, его основным техническим ограничением было отсутствие надежных подходов к анализу функций генов. Этот протокол описывает методологию подавления экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка, которая включает трансгенную экспрессию искусственных микроРНК (микроРНК) с использованием системы транспозонов Tol2. В этом подходе плазмида транспозона Tol2, содержащая кассету для экспрессии маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственные последовательности пре-микроРНК против гена-мишени, вводится в сетчатку эмбриона цыпленка с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2 путем электропорации in ovo . В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что экспрессия Nel, гликопротеина, который выполняет несколько функций в развитии нервной системы, может быть значительно подавлена в развивающейся сетчатке цыпленка с помощью этого метода. Наши результаты показывают, что эта методология индуцирует стабильное и надежное подавление экспрессии генов и, таким образом, обеспечивает эффективный подход к потере функции для исследований развития сетчатки.
Introduction
Сетчатка позвоночных является важной модельной системой для изучения развития нервной системы. Несмотря на периферическое расположение, сетчатка анатомически и эволюционно является продолжением центральной нервной системы, а зрительный нерв, состоящий из аксонов ганглиозных клеток сетчатки, представляет собой тракт в центральной нервной системе. Сетчатка цыпленка имеет существенные преимущества в качестве модельной системы для изучения молекулярного механизма развития нервов: она крупная и быстро развивается; она имеет структурное и функциональное сходство с сетчаткой человека; Он легко доступен для визуализации и экспериментальных манипуляций. Молекулярные механизмы пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза и управления аксонами во время развития нейронов были широко изучены с использованием сетчатки курицы.
Электропорация in ovo успешно используется в течение последних двух десятилетий для введения эктопических генов в клетки развивающегося эмбриона цыпленка. Этот метод позволяет мечить развивающиеся клетки, отслеживать судьбу клеток, отслеживать миграцию клеток и тракты аксонов, а также экспрессию эктопических генов для анализа функции генов in vivo. Хорошо установлены условия in ovo электропорации для эффективной экспрессии эктопических генов в куриных эмбрионах 1,2,3.
Несмотря на эти преимущества, отсутствие стабильного метода потери функции для изучения функции генов было основным техническим ограничением эмбриона цыпленка. В то время как эмбрионы цыплят, электропорированные малыми интерферирующими РНК (миРНК)4 или векторами экспрессии для коротких шпильчатых РНК (шРНК)5, демонстрируют нокдаун гена-мишени, подавление генов в этих подходах является временным, поскольку эффекты исчезают, как только клетки теряют введенные РНК или ДНК. Более стабильная подавление генов может быть достигнута путем доставки миРНК в эмбрионы цыплят с помощью ретровируснойсистемы RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) с длинным терминальным повтором (LTR) с акцептором S-plice). Вирусный вектор встраивается в геном хозяина, и эктопические гены стабильно экспрессируются. Тем не менее, ретровирус может интегрироваться в геном делящихся клеток только во время митотической (М) фазы клеточного цикла, что может наложить ограничения на стадии развития и/или типы клеток, для которых может быть применен этот подход с потерей функции. Кроме того, экспрессия трансгенов RCAS оказывается более медленной и менее устойчивой, чем экспрессия, индуцированная in ovo electroporation7.
Транспозоны — это генетические элементы, которые перемещаются из одного места генома в другое. Элемент Tol2 является членом семейства транспозируемых элементов hAT и содержит внутренний ген, кодирующий транспозазу, которая катализирует транспозонную реакцию элемента Tol28. Когда плазмидный вектор, несущий кассету экспрессии гена, окруженную последовательностями левого и правого концов элементов Tol2 (200.н. и 150.н., соответственно), вводится в клетки позвоночных с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2, экспрессионная кассета вырезается из плазмиды и интегрируется в геном хозяина, что поддерживает стабильную экспрессию эктопического гена (рис.). Было показано, что транспозируемый элемент Tol2 может очень эффективно индуцировать транспозицию генов у различных видов позвоночных, включая рыбок данио-рерио9,10, лягушек 11, цыплят 12 и мышей 13, и, таким образом, является полезным методом трансгенеза и инсерционного мутагенеза. Транспозонная система Tol2 была успешно использована для условного нокдауна гена-мишени путем геномной интеграции миРНК, обработанной из длинной двухцепочечной РНК14.
Этот протокол описывает подход с потерей функции у эмбриона цыпленка, который включает введение искусственных микроРНК (микроРНК) с помощью транспозонной системы Tol215,16. В этом подходе экспрессионная кассета для маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственных микроРНК против гена-мишени клонируется в транспозонный вектор Tol2. Затем транспозонная конструкция Tol2 вводится в эмбриональную сетчатку цыпленка с конструкцией экспрессии Tol2 транспозазы путем электропорации in ovo. В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В наших предыдущих исследованиях мы успешно сбивали экспрессию Nel, внеклеточного гликопротеина, преимущественно экспрессируемого в нервной системе, в развивающейся сетчатке цыпленка (см. Репрезентативные результаты). Наши результаты показывают, что стабильная и эффективная подавление генов может быть достигнута in ovo с помощью этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Построение векторов экспрессии микроРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры конструирования векторов экспрессии микроРНК (шаги 1.1-1.3, 1.5-1.6.) оптимизированы для набора экспрессии микроРНК, набора экспрессии miРНК Block-iT Pol II miR с EmGFP, как описано ранее15,16. Набор содержит вектор экспрессии, предназначенный для экспрессии микроРНК (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), контрольный вектор (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-отрицательная контрольная плазмида), вспомогательные реагенты и инструкции для получения векторов экспрессии микроРНК (см. таблицу материалов)17.
- Проектирование одноцепочечных ДНК-олиго, кодирующих пре-микроРНК по отношению к гену-мишени: Проектирование одноцепочечных ДНК-олиго («верхнецепочечные» олиго (целевые пре-микроРНК) и «нижнецепочечные» олиго (дополнения верхнецепочечных олиго)) с помощью онлайн-инструмента RNAi Designer (см. таблицу материалов). На рисунке 2 приведены требуемые характеристики одноцепочечных олигов (рисунок 2A) и примеры целевых последовательностей (рисунок 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется сгенерировать 5-10 последовательностей пре-микроРНК для данного гена-мишени и провести скрининг на нокдаунную активность in vitro (шаг 1.4). - Отжиг верхне- и нижнецепочечных олигопластов с получением двухцепочечного олиго
- Установите следующую реакцию отжига (табл. 1) в стерильной пробирке для микроцентрифуги объемом 0,5 мл.
- Инкубируют реакционную смесь при 95 °C в течение 4 мин. Отожгите верхне- и нижнецепочечные олигопласты для получения двухцепочечного олиго, дав реакционной смеси остыть до комнатной температуры (RT) в течение 5-10 минут. Кратковременно центрифугируют образец (~5 с).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отожженные олигопласты можно хранить при температуре -20 °C без разложения не менее года.
- Клонирование двухцепочечных олигов в вектор экспрессии микроРНК (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (входит в набор для экспрессии микроРНК)): клонирование отдельных двухцепочечных олигов в линеаризованный вектор экспрессии микроРНК в соответствии с руководством производителя17.
- Оценка нокдаун-эффектов
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тестировать отдельные последовательности микроРНК на эффективность подавления генов in vitro перед их применением in ovo. Эффективность нокдауна может быть проверена путем трансфекции плазмид экспрессии микроРНК в клеточную линию, которая экспрессирует ген-мишень. В качестве альтернативы, отдельные плазмиды экспрессии микроРНК могут быть котрансфицированы в клеточные линии с конструкцией экспрессии для гена-мишени. Для генов-мишеней, кодирующих белки, которые не привязаны к мембране в их нативном состоянии (например, растворимые белки), для мониторинга экспрессии белка-мишени можно использовать белок слияния щелочной фосфатазы (АР). Последовательность кДНК, кодирующая белок-мишень, может быть слита в рамке с плацентарной щелочной фосфатазой человека в векторах AP-tag (APtag-1-APtag-5; см. таблицу материалов) и введена в клетки18. При экспрессии в культуральных клетках (например, HEK293T клетках) меченый AP белок-мишень секретируется на высоких уровнях в питательные среды, и, таким образом, нокдаунные эффекты последовательностей микроРНК могут быть оценены путем измерения снижения активности AP в питательных средах клеток, трансфицированных микроРНК (подшаги 1.4.1-1.4.4).- Культивирование HEK293T клеток в 24-луночном планшете (8 x 10,4 клетки/лунка) в течение ночи. Транзиторная трансфектация клеток с индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК плазмидой экспрессии белка-мишени, меченного AP. В качестве контроля используют контрольную плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (входит в набор для экспрессии микроРНК). (Если используются клеточные линии, которые стабильно экспрессируют белок-мишень, помеченный AP, трансфицируйте клетки только индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК.)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансфекции используется обычный реагент для липофектирования (см. Таблицу материалов). - Кондиционированную среду собирают через 48-72 ч после трансфекции и тепло инактивируют эндогенную активность ЩФ на водяной бане с 65 °С в течение 5 мин. Отжим мусор в настольной микроцентрифуге на максимальной скорости в течение 5 мин.
- Буферизуйте надосадочную жидкость 10 мМ HEPES, pH 7,0 и пропустите через фильтр 0,45 мкм.
- Возьмите 100 мкл (для измерения в планшетном ридере) или 500 мкл (для спектрофотометра) надосадочной жидкости и добавьте равное количество 2-кратного буфера подложки AP (Таблица 2). Проверьте активность AP, измерив OD405 в планшетном ридере или спектрофотометре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если активность AP кондиционированной среды слишком высока для точного измерения, разбавьте ее буфером HBAH (сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 20 мМ HEPES (pH 7,0)) или другим буфером, содержащим белок-носитель. Не используйте фосфатсодержащие буферы (например, PBS), поскольку неорганический фосфат действует как конкурентный ингибитор AP.
- Культивирование HEK293T клеток в 24-луночном планшете (8 x 10,4 клетки/лунка) в течение ночи. Транзиторная трансфектация клеток с индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК плазмидой экспрессии белка-мишени, меченного AP. В качестве контроля используют контрольную плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (входит в набор для экспрессии микроРНК). (Если используются клеточные линии, которые стабильно экспрессируют белок-мишень, помеченный AP, трансфицируйте клетки только индивидуальными конструкциями экспрессии микроРНК.)
- Сцепление последовательностей микроРНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Нокдаун-эффекты могут быть усилены путем сцепления различных микроРНК с одним и тем же геном-мишенью или повторения одной и той же микроРНК. Вектор экспрессии микроРНК поддерживает сцепление нескольких последовательностей пре-микроРНК и их коцистронную экспрессию17.- В соответствии с инструкциями производителя 17 в цепочке две различные последовательности пре-микроРНК (против одного и того же гена-мишени), которые демонстрируют наибольшую нокдаунную активность в анализах in vitro (шаг1.4).
- Оцените эффективность подавления генов цепных конструкций с помощью анализов in vitro , как описано в шаге 1.4. Если три или более последовательностей пре-микроРНК демонстрируют одинаково высокую нокдаунную активность, протестируйте различные комбинации двух последовательностей и используйте комбинации, которые показывают наибольшую нокдаунную активность (см. Репрезентативные результаты).
- Перенос экспрессионной кассеты EmGFP-pre-miRNA на транспозонный вектор Tol2
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессионная кассета, содержащая кДНК EmGFP и две последовательности пре-микроРНК, переносится в транспозонный вектор Tol2 (вектор pT2K-CAGGS, см. таблицу материалов). С этой целью экспрессионную кассету (охватывающую от 3'-конца промотора ЦМВ до праймерного сайта обратного секвенирования микроРНК вектора экспрессии микроРНК) амплифицируют методом ПЦР с использованием праймеров с искусственным сайтом фермента рестрикции, а продукт ПЦР клонируют в транспозонный вектор Tol2. Транспозонный вектор Tol2 содержит вездесущий промотор CAGGS, который управляет экспрессией вставленной кассеты экспрессии. Промотор CAGGS и кассета экспрессии окружены последовательностями Tol2 (рис. 1).- ПЦР-амплификация кассеты экспрессии EmGFP-pre-miRNA: Соблюдайте схему реакции и условия термоциклирования, описанные в таблице 3.
- Лигируют очищенный гелем продукт ПЦР (около 1,3 kb) в транспозонный вектор Tol2, перевариваемый ферментом рестрикции. Электропоируют плазмиду в компетентные клетки E. coli (см. таблицу материалов) и отбирают рекомбинанты (конструкции микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x).
- Подготовьте плазмиду с помощью обычного набора maxiprep (см. таблицу материалов). Проверяют структуру и последовательность плазмиды с помощью рестрикционного картирования и с помощью праймеров, используемых для ПЦР, соответственно.
2. Хранение и инкубация яиц
- Покупайте оплодотворенные яйца белого леггорна (Gallus gallus) на местных фермах или у коммерческих продавцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца можно хранить при температуре 12-16 °C или 4 °C в течение 1 недели до инкубации без существенной потери жизнеспособности или задержки развития во время инкубации. - Пометьте яйца датой начала инкубации и отметьте верхнюю сторону яйца (где будет располагаться эмбрион). Инкубируйте оплодотворенные яйца в горизонтальном положении при температуре 38 °C до тех пор, пока эмбрионы не достигнут стадий Гамбургера и Гамильтона (HH) 10 (33-38 ч) -11 (40-45 ч)19.
3. Электропорация in ovo
- Подготовка к электропорации in ovo
- Приготовление 0,25% раствора Fast Green: Растворите 25 мг Fast Green FCF в 10 мл PBS. Отфильтруйте раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм. Решение может храниться в RT.
- Коктейль ДНК: Приготовьте раствор для инъекций, смешав отдельные плазмиды микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x (подэтап 1.6.3) с плазмидой экспрессии транспозазы Tol2 (вектор pCAGGS-T2TP; см. таблицу материалов) (5 мкг/мкл каждая) в соотношении 2:1. Добавьте 1/10 объема 0,25% раствора быстрого зеленого цвета, чтобы визуализировать область инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация ДНК может варьироваться в зависимости от конструктов. - Настройка аппарата для микроинъекций (Рисунок 3A, B): Аппарат для микроинъекций состоит из следующих компонентов (см. Таблицу материалов): шприц Гамильтона, игла 18 G (длина иглы = 2 дюйма), трубка из ПВХ (поливинилхлорида) (длина 2 см), игла для микропипетки (может быть изготовлена путем вытягивания капиллярных трубок с омега-точечным волокном (внутренний диаметр 1 мм X 0,75 мм) с помощью съемника микропипетки).
- Наполните шприц Hamilton тяжелым минеральным маслом. Присоедините иглу 18 G к шприцу и заполните внутреннее пространство иглы маслом, нажав на поршень шприца.
- Прикрепите к концу иглы кусок трубки из ПВХ длиной 2 см и наполните трубку маслом.
- Прикрепите к трубке вытянутую иглу для микропипетки. Отломите кончик иглы микропипетки до диаметра 10-20 мкм тонкими щипцами, чтобы сделать небольшое отверстие. Залейте всю иглу маслом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует следить за тем, чтобы в системе не попадали пузырьки воздуха, так как они будут препятствовать потоку раствора ДНК.
- Поместите 5 мкл цветного коктейля ДНК (подшаг 3.1.2) в стерильную чашку Петри. Под препарирующим микроскопом поместите кончик иглы микропипетки в раствор ДНК на стерильной чашке Петри и медленно втяните раствор в иглу.
- Подождите, пока давление внутри и снаружи иглы не уравновесится (чтобы избежать попадания воздуха в иглу), и выньте кончик иглы из раствора ДНК. Держите кончик иглы погруженным в стерильный PBS в небольшом стакане до инъекции.
- Настройка электропорационного аппарата (рис. 3А,В):
- Установите пару платиновых электродов с электрододержателем на микроманипулятор. Отрегулируйте расстояние между кончиками электродов до 2 мм (рис. 3C, E).
- Подключите электроды к генератору импульсов прямоугольной формы с помощью кабелей (см. Таблицу материалов).
- Микроинъекция раствора ДНК (рис. 3D)
- Достаньте куриное яйцо из инкубатора и протрите поверхность яйца папиросной бумагой, смоченной в 70% этаноле.
- Прикрепите иглу 18 G к шприцу объемом 10 мл. Введите иглу через тупой конец яйца под углом вниз (45°), чтобы не повредить желток.
- Из яйца вывести 2-3 мл альбумина. Заклейте отверстие куском скотча. Убедитесь, что эмбрион и вителлиновая оболочка отделены от скорлупы, «просвечивая» яйцо светом.
- Удалите кусочек яичной скорлупы (круг диаметром 2-3 см) с верхней части яйца с помощью ножниц и щипцов, чтобы обнажить эмбрион. Не выбрасывайте более пяти яйцеклеток одновременно, чтобы предотвратить высыхание эмбрионов во время электропорации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно открыть окно, не разбив яйцо, всю верхнюю часть яйца можно закрыть скотчем или скотчем, прежде чем удалять кусочек яичной скорлупы. - Введите кончик иглы в пузырь зрительного нерва с его проксимальной стороны под углом 45° и введите коктейль ДНК, медленно нажимая (или постукивая) на поршень до тех порций, пока раствор синего цвета не заполнит просвет (рис. 3D).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для инъекции растворов ДНК можно использовать систему микровпрыска под давлением (см. Таблицу материалов). - Извлеките иглу и поместите ее кончик обратно в PBS.
- Электропорация (Рисунок 3E)
- Установите параметры импульсов электропоратора следующим образом: Напряжение: 15 В, Длительность импульса: 50 мс, Интервал импульсов: 950 мс, Число импульсов: 5
- Добавьте несколько капель HBSS на вителлиновую мембрану над эмбрионом. Опустите электроды в HBSS с помощью микроманипулятора, перпендикулярно передне-задней оси эмбриона.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы эту процедуру можно выполнить без добавления HBSS, так как альбумин является хорошим электрическим проводником, обеспечивающим эффективную электропорацию. - Расположите электроды по обе стороны (передняя (носовая) и задняя (височная) сторона) от пузырька зрительного нерва (рисунок 3E). Следите за тем, чтобы электроды не касались эмбриона или кровеносных сосудов. Воздействуют на импульсные электрические поля.
- Снимите электроды и аккуратно очистите их смоченной в воде стерильной ватной палочкой, чтобы избежать скопления альбумина.
- Заклейте окно скотчем и повторно инкубируйте эмбрион до желаемой стадии развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Построение транспозонных конструкций Tol2 для экспрессии искусственных микроРНК против Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; также известен как Nell2) представляет собой внеклеточный гликопротеин. Он имеет структурное сходство с тромбоспондином-1 и преимущественно экспрессируется в нервной системе20,21. Ранее мы продемонстрировали, что Nel регулирует дифференцировку и выживание ганглиозных клеток сетчатки15 и действует как ингибирующий направляющий сигнал для аксонов сетчатки22,23,24. В развивающейся сетчатке цыпленка экспрессия Nel обнаруживается в предполагаемом пигментном эпителии на HH15 (эмбриональный день (E) 2,5). При HH20 (E3.5) экспрессия Nel также наблюдается во вновь дифференцированных ганглиозных клетках сетчатки. Сильная экспрессия Nel в пигментном эпителии и ганглиозных клетках сетчатки продолжается, по крайней мере, доE18 15.
Для изучения роли Nel в развитии ганглиозных клеток сетчатки экспрессию гена Nel сбивали путем введения искусственных микроРНК в развивающуюся сетчатку с использованием внутрияйцевой электропорации и транспозонной системы Tol215,16. Во-первых, пары одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов были разработаны для 10 потенциальных целевых последовательностей в белок-кодирующей области кДНК курицы Nel (регистрационный номер GenBank: NM_001030740.1) с помощью онлайн-инструмента проектирования РНК-интерференции (см. таблицу материалов). Олигонуклеотидные пары отжигали и индивидуально клонировали в вектор экспрессии микроРНК. Затем отдельные конструкции трансфицировали в HEK293T клетки, которые стабильно экспрессируют Nel-AP, и оценивали их эффективность нокдауна путем измерения активности AP в питательных средах. В качестве контроля использовали контрольную плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative (рис. 4A).
Были отобраны три последовательности пре-микроРНК Nel, которые показали наибольший эффект нокдауна (против нуклеотидов 482-502, 910-930 и 2461-2481 куриной кДНК Nel соответственно), и две последовательности пре-миРНК были тандемно клонированы в вектор экспрессии микроРНК (pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x Nel pre-miRNA) в соответствии с инструкциями производителя17. Экспрессионные кассеты, кодирующие две пре-микроРНК и EmGFP, амплифицировали методом ПЦР с искусственным сайтом EcoRI на обоих концах (5′-GGGAATTCTCTGGCTAACTAGAGAAC-3′ и 5′-CCGAATTCCCTCTAGATCAACCACT-3′) и клонировали в вектор pT2K-CAGGS (pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel pre-miRNA). Последовательность экспресс-кассеты подтверждали с помощью праймеров, используемых для ПЦР. Конструкции пре-микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel были индивидуально котрансфицированы вектором экспрессии транспозазы Tol2 (pCAGGS-T2TP) в HEK293T клетки, которые стабильно экспрессируют Nel-AP, и ингибирующее влияние на экспрессию Nel-AP оценивали путем измерения активности AP в питательных средах. Как показано на рисунке 4B, эффективность нокдауна была значительно повышена за счет сцепления двух последовательностей микроРНК. Стойкое подавление экспрессии Nel-AP (более 90%) наблюдалось, по крайней мере, в течение 13 дней после трансфекции (рис. 4B).
Стойкое подавление экспрессии Nel в развивающейся сетчатке цыпленка
Конструкцию пре-микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel (содержащую целевые последовательности для нуклеотидов 482-502 и 2461-2481 кДНК курицы Nel) совместно трансфицировали с вектором экспрессии транспозазы (pCAGGS-T2TP) в височную или носовую сторону сетчатки цыпленка путем электропорации in ovo при HH9-11 (рис. 3, рис. 5A). Срезы готовили из сетчатки Е4.5 или Е8, а влияние на экспрессию Nel оценивали методом иммуногистохимии с использованием антителNel 22. При E4.5 экспрессия Nel в пигментном эпителии сетчатки была значительно снижена в клетках, экспрессирующих EmGFP (рис. 5B-D). На E8 снижение экспрессии Nel также отчетливо наблюдалось в ганглиозных клетках сетчатки (рис. 5E-I). Значительное подавление экспрессии Nel продолжалось, по крайней мере, до E18 (данные не показаны). Введение контрольной микроРНК не влияло на экспрессию Nel в сетчатке (рис. 5J-O).
Рисунок 1: Транспозиция кДНК с стороны Tol2 транспозазой. Схема, показывающая транспозицию кассеты экспрессии для EmGFP с боковой стороны Tol2 и двумя последовательностями пре-микроРНК (2x пре-миРНК) с помощью транспозазы. Когда транспозонный вектор Tol2, содержащий кассету для экспрессии (конструкция микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x), вводится в клетки с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2 (pCAGGS-T2TP), кассета с фланкированной экспрессией Tol2 вырезается из вектора и интегрируется в геном хозяина за счет активности транспозазы. Экспрессия EmGFP и микроРНК управляется вездесущим промотором CAGGS. Эта цифра была изменена по данным Nakamoto et al.15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Структура сконструированной пре-микроРНК. (A) Разработанная последовательность пре-микроРНК основана на мышиной последовательности miR-15517. Олиго верхней цепи содержит (от 5'-конца до 3'-конца) четырехнуклеотидный выступ (TGCT (синий)), антисмысловую целевую последовательность (21 нуклеотид), последовательность терминальной петли (красный) и смысловую целевую последовательность (19 нуклеотидов). Антисмысловая целевая последовательность представляет собой зрелую последовательность микроРНК. Нижнецепочечный олиго содержит четырехнуклеотидный 5'-выступ (CCTG (синий)) и обратную последовательность комплемента верхнецепочечного олиго, но отсутствует четырехнуклеотидный выступ на 3'-конце (AGCA-3': обратное дополнение 5'-TGCT верхнецепочечного олиго). В смысловой целевой последовательности отсутствуют нуклеотиды 9 и 10 целевой последовательности. «Лишние» два нуклеотида в антисмысловой последовательности мишени образуют внутреннюю петлю в структуре ствол-петля зрелой молекулы микроРНК, что приводит к более высокой скорости нокдауна17. (Б) Пример последовательности мишеней против курицы Нел. Показаны смысловые и антисмысловые последовательности в верхней и нижней нитях для целевой последовательности куриного гена Nel (регистрационный номер GenBank NM_001030740.1, нуклеотиды 482-502). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Микроинъекция и электропорация in ovo. (A) Рабочая станция для микровпрыска и электропорации in ovo. (1) Препарирующий микроскоп. (2) Инжекционный аппарат. (3) Аппарат для электропорации. (4) Двойной осветитель микроскопа на гибкой стойке. (5) Электропоратор. (Б) Инъекционные аппараты. Шприц Гамильтона (6) с иглой 18 G (7) соединен с трубкой из ПВХ (8) и с вытянутой иглой микропипетки (9) и установлен на микроманипуляторе (10). Внутреннее пространство аппарата заполнено тяжелым минеральным маслом. (C) Аппарат для электропорации. Комплект платиновых электродов (11) с электрододержателем (12) установлен на микроманипуляторе (13). Электроды соединены с электропоратором кабелями (14). (D) Микроинъекция раствора коктейля ДНК в везикулу зрительного нерва при HH 10-11. Вытянутая игла микропипетки вводится в пузырьку зрительного нерва с проксимальной ее стороны. Раствор коктейля ДНК с быстрым зеленым (синим) цветом вводится в пузырьку зрительного нерва до тех пор, пока краситель не заполнит весь просвет. (E) Электропорация в глазной пузырь. Электроды размещают параллельно (расстояние между электродами 2 мм) и таким образом, чтобы введенный пузырь зрительного нерва располагался между электродами: один электрод располагается возле передней (носовой) поверхности зрительного пузырька, а другой – в задней части эмбриона на уровне заднего мозга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка in vitro отдельных или цепных последовательностей пре-микроРНК на эффективность подавления гена Nel. (А) Нокдаунные эффекты отдельных последовательностей пре-микроРНК. Приведены результаты пяти репрезентативных конструкций (антисмысловые целевые последовательности, соответствующие нуклеотидным номерам 482-502, 910-930, 1106-1126, 1663-1683 и 2461-2481 кДНК куриного Nel (регистрационный номер GenBank: NM_001030740.1)). Индивидуальные конструкции экспрессии микроРНК (пре-микроРНК pcDNA6.2-GW/EmGFP-Nel) трансфицировали в HEK293T клетки, стабильно экспрессирующие Nel-AP. В качестве контроля использовали контрольную плазмиду pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-отрицательную. Экспрессию Nel-AP оценивали путем измерения активности ЩФ в питательных средах через 48-96 ч после трансфекции. Три конструкции экспрессии пре-микроРНК Nel (против нуклеотидов 482-502, 910-930 и 2461-2481 соответственно) показали значительное подавление экспрессии Nel. (B) Нокдаунные эффекты цепных последовательностей пре-микроРНК. Две из трех наиболее мощных последовательностей пре-микроРНК (против нуклеотидов 482-502, 910-930 и 2461-2481) были тандемно клонированы в вектор pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR, а экспрессионная кассета (содержащая две последовательности пре-микроРНК и кДНК EmGFP) была перенесена в вектор pT2K-CAGGS (пре-микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel). Конструкции пре-микроРНК pT2K-CAGGS-EmGFP-2x Nel были индивидуально трансфицированы векторами экспрессии тол2-транспозазы (pCAGGS-T2TP) в HEK293T клетки, стабильно экспрессирующие Nel-AP, и экспрессию Nel-AP оценивали путем измерения активности AP в питательных средах от 2 до 13 дней после трансфекции. Все три комбинации (482-502/910-930, 482-502/2461-2481, 910-930/2461-2481) показали повышенную супрессивную активность по сравнению с отдельными последовательностями пре-микроРНК. Значительное подавление экспрессии Nel-AP наблюдалось со 2-го по 13-е сутки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Стабильный нокдаун экспрессии Nel в развивающейся сетчатке цыпленка тол2-транспозон-опосредованной интеграцией трансгена микроРНК. Транспозонную конструкцию Tol2, содержащую кассету экспрессии из двух последовательностей пре-микроРНК Nel и EmGFP (pT2K-CAGGS-EmGFP-Nel pre-miRNA (482-502)-Nel pre-miRNA (2461-2481)) (A-I) или контрольную конструкцию, экспрессирующую неродственную микроРНК и EmGFP (J-O), котрансфицировали вектором экспрессии транспозазы (pCAGGS-T2TP) в височную или носовую половину пузырька зрительного нерва in ovo электропорация на HH9-HH11 (E1.5). Срезы сетчатки готовили при E4.5 (B-D, J-L) или E8 (E-I, M-O), а эффективность супрессии гена Nel изучали методом иммуногистохимии с использованием антител к Nel (красный). Поскольку ДНК заряжена отрицательно, трансгены электропорируются в ткани со стороны анода; таким образом, только половина сетчатки была помечена EmGFP (сторона трансфекции (TF), зеленая). (А) Экспрессия гена маркера EmGFP в височной половине сетчатки при E4.5. Зрительная щель (белая стрелка) представляет собой границу между трансфицированной и нетрансфицированной (контрольной) сторонами. (Б-И) РНК-интерференционный нокдаун экспрессии Nel в развивающейся сетчатке цыпленка. (Б-Д) При E4.5 экспрессия Nel значительно снижена (B,D) в клетках пигментного эпителия сетчатки (ПЭ), экспрессирующих EmGFP (C,D). Обратите внимание на комплементарный паттерн иммуноокрашивания Nel и экспрессии EmGFP в D. NR, нервная сетчатка. (Д-Я) При E8 экспрессия Nel (E,G) в пигментном эпителии сетчатки и слое ганглиозных клеток (GCL) снижается на стороне трансфекции (F,G). (Н, И) Более высокое увеличение области трансфекции и соответствующей контрольной области в E (обозначено маленькими прямоугольниками) соответственно. (Д,Г) Объединены изображения из двух левых изображений. (Ж-О) Экспрессия контрольной микроРНК. Введение отрицательной контрольной конструкции не влияет на экспрессию Nel в сетчатке E4.5 (J-L) или E8 (M-O). (Л,О) Объединены изображения из двух левых изображений. Граница между трансфекционной и контрольной сторонами обозначена пунктирной линией в буквах C, F, K и N. Масштабные линейки, 50 мкм. (A) и (B-I) были изменены по сравнению с Nakamoto, M. & Nakamoto, C 16 и Nakamoto etal.15, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Настройка реакции отжига | |
| Верхнецепочечный олиго (200 мкМ в TE-буфере) | 5 мкл (конечная концентрация 50 мкМ) |
| Нижнецепочечный олиго (200 мкМ в TE буфере) | 5 мкл (конечная концентрация 50 мкМ) |
| 10-кратный буфер олигоотжига* | 2 мкл |
| Вода, не содержащая ДНКазы/РНКазы* | 8 мкл |
| Итог | 20 мкл |
| * Входит в состав набора для экспрессии микроРНК (см. таблицу материалов) | |
Таблица 1: Настройка реакции отжига
| 2x буфер подложки AP | |
| 10 М диэтаноламин (рН 9,8) | 4 мл |
| 1 М MgCl2 | 10 мкл |
| L-гомоаргинин | 45 мг |
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | 10 мг |
| -нитрофенилфосфат | 63 мг |
| H2O | Добавьте, чтобы общий объем составил 20 мл |
Таблица 2: 2x буфер подложки AP. Раствор следует хранить в аликвотах при температуре -20 °C и защищать от света, так как-нитрофенилфосфат светочувствителен.
| Настройка реакции | |||
| Плазмида пре-микроРНК pcDNA6.2-GW/EmGFP-2x (из раздела 1.5) или контрольная плазмида pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-отрицательная* (0,1 мкг/мкл) |
1 мкл | ||
| 10-кратный буфер Pfu | 5 мкл | ||
| Смесь dNTP (по 10 мМ dATP, dCTP, dGTP и dTTP) | 1 мкл | ||
| Прямой праймер EmGFP* (5'-GGCATGGACGAGCTGTACAA-3'; 10 мкМ) | 1 мкл | ||
| Обратный праймер микроРНК* (5'-CTCTAGATCAACCACTTTGT-3'; 10 мкМ) | 1 мкл | ||
| ДНК-полимераза Pfu (5 ед/мкл) | 0,5 мкл | ||
| H2O | 40,5 мкл | ||
| Общий объем | 50 мкл | ||
| * Входит в состав набора для экспрессии микроРНК. | |||
| Условия термоциклирования | |||
| 94 °С | 5 мин | ||
| 30 циклов из следующего: | |||
| 94 °С | 45 с | ||
| 58 °С | 1 мин. | ||
| 72 °С | 2 мин. | ||
| 72 °С | 10 мин | ||
Таблица 3: Организация реакции и условия термоциклирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол представляет собой подробное руководство по подавлению экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка путем трансгенной экспрессии искусственных микроРНК с использованием овоэлектропорации и системы транспозонов Tol2.
Следующие факторы имеют решающее значение для успешного выполнения этой техники. Во-первых, крайне важно использовать последовательности микроРНК, которые, как подтверждено, оказывают сильное нокдаун-действие. Прежде чем применять их для электропорации in ovo , протестируйте отдельные последовательности пре-микроРНК на эффективность подавления генов в анализах in vitro (шаг 1.4) и цепочку из двух последовательностей пре-микроРНК, которые демонстрируют наибольшую нокдаунную активность (шаг 1.5). Во-вторых, важно не повредить везикулу зрительного нерва и окружающие нервные ткани при введении иглы микропипетки для введения раствора ДНК. Чрезмерное повреждение эмбрионов может привести к порокам развития и гибели эмбрионов. Чтобы избежать повреждения тканей, вводите микропипетку в пузырьку зрительного нерва в правильной ориентации. Меньшие и более острые кончики иглы микропипетки сделают проникновение в пузырь зрительного нерва более плавным и приведут к меньшему повреждению тканей. Однако иглы с очень маленькими кончиками испытывают трудности с загрузкой и высвобождением раствора ДНК. В описанном здесь исследовании использовались иглы с отверстием кончика диаметром 10-20 мкм. В-третьих, убедитесь, что весь пузырь зрительного нерва заполнен раствором ДНК (как видно по распространению быстрого зеленого цвета). В-четвертых, разместите электроды в оптимальных положениях, чтобы нацелить ДНК на желаемую область зрительного пузырька (например, височную сторону, носовую сторону). Отрицательно заряженные молекулы ДНК будут двигаться в сторону анода; Поэтому точное размещение и ориентация электродов критически влияют на конечные результаты. Наконец, используйте оптимальные концентрации ДНК и параметры электропорации.
Если флуоресцентный сигнал не наблюдается после 24 ч электропорации, следует рассмотреть следующее: (1) Убедитесь, что электропорированные плазмиды имеют правильные последовательности. (2) Повторно проверьте концентрацию и чистоту отдельных плазмид. (3) Убедитесь, что раствор ДНК заполняет просвет зрительного пузырька и не диффундирует в нервную трубку. (4) Проверьте правильность используемых параметров электропорации. (5) Убедитесь, что электроды находятся в контакте с мембраной вителлина во время подачи электрических импульсов.
Комбинация внутрияйцевой электропорации и транспозон-опосредованного метода интеграции генов в этом протоколе дает несколько явных преимуществ. Во-первых, он поддерживает стабильную продукцию микроРНК и, таким образом, стойкое подавление генов-мишеней. Развитие сетчатки цыпленка начинается с Е1,5 и продолжается до вылупления (ганглиозные клетки сетчатки вырабатываются в период от Е2 до Е9). Для функционального анализа функции генов экспрессия искусственных микроРНК должна стабильно поддерживаться в течение этого периода. Экспрессия последовательностей РНК-интерференции с использованием обычных векторов экспрессии, как правило, является преходящей, поскольку конструкция экспрессии не может быть эффективно интегрирована в хромосомы. Однако в описанном здесь методе хромосомная интеграция экспрессионной кассеты опосредована активностью ко-электропорированной транспозазы, что приводит к стабильной экспрессии трансгенов.
Во-вторых, в этом методе один и тот же промотор CAGGS индуцирует коцистронную экспрессию нескольких последовательностей микроРНК и маркера EmGFP в трансфицированных клетках, тем самым обходя риск интерференции промотора, которая является одним из распространенных осложнений при использовании ретровирусных векторов, содержащих два промотора, для достижения двойной экспрессии генов25.
Наконец, в отличие от репликационно-компетентных ретровирусных векторов, трансген, который электропорируется этим методом, не переносится в соседние клетки. Таким образом, область трансфекции можно более точно контролировать, используя соответствующие типы электродов и размещая их в правильных положениях.
Несмотря на описанные выше преимущества, данный метод также имеет ограничения, присущие овоэлектропорации . Например, частота трансфекции и подавления генов может варьироваться у разных эмбрионов, и для анализа может потребоваться трансфекция относительно большого количества эмбрионов. Кроме того, электропорация в эмбриональную сетчатку in ovo на более поздних стадиях развития (например, Е4-Е5) имеет экспериментальные трудности, поскольку на этих стадиях глаза расположены в непосредственной близости от сердца, что увеличивает риск остановки сердца после электропорации.
Система, описанная здесь, обеспечивает быстрое и надежное подавление генов в развивающейся сетчатке цыпленка. Этот подход может быть применен и к другим частям эмбриона цыпленка, включая нервные и ненервные ткани. Поэтому мы ожидаем, что эта система может способствовать выяснению молекулярных механизмов развития цыплят.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Векторы pT2K-CAGGS и pCAGGS-T2TP были любезно предоставлены Йошико Такахаси (Киотский университет, Киото, Япония) и Коити Каваками (Национальный институт генетики, Мисима, Япония) соответственно. Мы благодарим Михаэля Бербероглу за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами Королевского общества и Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BBSRC) (Великобритания).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
