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Chemistry

अनाज और फलियों की नि: शुल्क घुलनशील फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सामान्यीकृत विधि

Published: June 10, 2022 doi: 10.3791/62467
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Food and Human Nutritional Sciences, University of Manitoba, 2Richardson Centre for Functional Foods and Nutraceuticals, University of Manitoba

Summary

फेनोलिक एसिड महत्वपूर्ण फाइटोकेमिकल्स हैं जो साबुत अनाज में मौजूद होते हैं। उनके पास एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षात्मक कार्यों जैसे बायोएक्टिव गुण होते हैं। इस काम का उद्देश्य एचपीएलसी पहचान, कुल फेनोलिक सामग्री अनुमान, और अनाज और फलियों में फेनोलिक एसिड की एंटीऑक्सिडेंट क्षमता के निर्धारण के लिए एक सामान्यीकृत विधि पर रिपोर्ट करना है।

Abstract

फेनोलिक एसिड कार्बनिक यौगिकों का एक वर्ग है जो एक फेनोलिक समूह और एक कार्बोक्जिलिक समूह दोनों को सहन करता है। वे अनाज में पाए जाते हैं और अनाज के चोकर या फलियों के बीज कोट में ध्यान केंद्रित करते हैं। उनके पास एंटीऑक्सिडेंट गुण हैं जिन्होंने हाल के वर्षों में अपने संभावित एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षात्मक स्वास्थ्य कार्यों के बारे में बहुत शोध रुचि उत्पन्न की है। यह काम साबुत अनाज से मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड के निष्कर्षण और उनकी एंटीऑक्सिडेंट क्षमता के विश्लेषण के लिए एक सामान्यीकृत विधि प्रस्तुत करता है। दो अनाज (गेहूं और पीले मकई) और तीन फलियों (काउपी बीन, किडनी बीन और सोयाबीन) सहित पांच साबुत अनाज के नमूनों का उपयोग किया गया था। अनाज को आटे में मिलाया गया था और उनके मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड को जलीय मेथनॉल का उपयोग करके निकाला गया था। यौगिकों को तब एक उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफ (एचपीएलसी) का उपयोग करके पहचाना गया था। फोलिन-Ciocalteu विधि का उपयोग उनकी कुल फेनोलिक सामग्री को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जबकि उनकी एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं को DPPH कट्टरपंथी स्कैवेंजिंग क्षमता, ट्रोलॉक्स समकक्ष एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (टीईएसी) और ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता (ORAC) assays का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। जिन फेनोलिक एसिड की पहचान की गई है, उनमें वैनिलिक, कैफिक, पी-कौमेरिक और फेरुलिक एसिड शामिल हैं। वैनिलिक एसिड की पहचान केवल काउपीया में की गई थी जबकि कैफेइक एसिड की पहचान केवल किडनी बीन में की गई थी। पी-कौमेरिक एसिड की पहचान पीले मकई, काउपीया और सोयाबीन में की गई थी, जबकि सभी नमूनों में फेरुलिक एसिड की पहचान की गई थी। फेरुलिक एसिड प्रमुख फेनोलिक एसिड की पहचान की गई थी। नमूनों में फेनोलिक एसिड की कुल सांद्रता निम्नलिखित क्रम में कम हो गई: सोयाबीन > काउपी बीन > पीला मकई = किडनी बीन > गेहूं। कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (DPPH, TEAC और ORAC assays के मूल्यों का योग) निम्नानुसार कम हो गई: सोयाबीन > किडनी बीन > पीला मकई = cowpea बीन > गेहूं। इस अध्ययन ने निष्कर्ष निकाला कि एचपीएलसी विश्लेषण के साथ-साथ डीपीपीएच, टीईएसी और ओआरएसी एसेस पूरे अनाज के फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट गुणों के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं।

Introduction

फेनोलिक एसिड पौधों में अध्ययन किए जाने वाले सबसे महत्वपूर्ण फाइटोकेमिकल्स में से एक हैं, क्योंकि वे जड़ी-बूटी और फंगल संक्रमण के खिलाफ पौधे की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही साथ पौधे के ऊतकों में संरचनात्मक समर्थन और अखंडता को बनाए रखते हैं। वे अनाज के चोकर और फलियों के बीज कोट3 में प्रचुर मात्रा में हैं। संरचनात्मक रूप से, उन्हें दो समूहों में विभाजित किया गया है: hydroxybenzoic एसिड (चित्रा 1) और hydroxycinnamic एसिड (चित्रा 2)। अनाज और फलियां में आम hydroxybenzoic एसिड गैलिक, पी hydroxybenzoic, 2,4-dihydroxybenzoic, प्रोटोकेटेचुइक, वैनिलिक, और सिरिंजिक एसिड शामिल हैं, जबकि आम hydroxycinnamic एसिड कैफेइक, पी-coumaric, ferulic, और sinapic एसिड3 शामिल हैं। फेनोलिक एसिड में एंटीऑक्सिडेंट गुण भी होते हैं क्योंकि वे मुक्त कणों को साफ करने में सक्षम होते हैं, जो वसा में ऑक्सीडेटिव रैन्सिडिटी का कारण बनते हैं, और शारीरिक प्रणालियों में कट्टरपंथी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव शुरू और प्रचार करतेहैं 4,5। एंटीऑक्सिडेंट के रूप में इस महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका के कारण, वे हाल के शोध का विषय हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि जब पौधे के खाद्य पदार्थों के घटकों के रूप में सेवन किया जाता है, तो वे एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षा लागू कर सकते हैं।

अनाज और अनाजउत्पाद दुनिया भर में मनुष्यों और जानवरों के लिए प्रमुख कार्बोहाइड्रेट खाद्य स्रोत हैं। अनाज में गेहूं, चावल, मकई (मक्का), जौ, ट्राइटिकेल, बाजरा और ज्वार शामिल हैं। उनमें से, मकई का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, 2019/2020 में 1,135.7 मिलियन टन के अनुमानित वैश्विक उपयोग के साथ, इसके बाद इसी अवधि के दौरान 757.5 मिलियन टन के अनुमानित वैश्विक उपयोग के साथ गेहूं का स्थानहै। अनाज खाद्य पदार्थ उपभोक्ताओं के लिए ऊर्जा के महान स्रोत हैं क्योंकि वे कार्बोहाइड्रेट के समृद्ध स्रोत हैं। वे कुछ प्रोटीन, वसा, फाइबर, विटामिन और खनिज भीप्रदान करते हैं। उनके पोषण मूल्य के अलावा, अनाज फाइटोकेमिकल एंटीऑक्सिडेंट के अच्छे स्रोत हैं, विशेष रूप से फेनोलिक एसिड, जिनमें कट्टरपंथी-प्रेरित ऑक्सीडेटिव क्षति से शारीरिक प्रणाली की रक्षा करने की क्षमताहै। फलियां भी पोषक तत्वों के अच्छे स्रोत हैं और आमतौर पर अनाज की तुलना में प्रोटीन में अधिक होती हैं। उनमें विटामिन और खनिज भी होते हैं औरविभिन्न खाद्य पदार्थों की तैयारी में उपयोग किए जाते हैं। इसके अतिरिक्त, फलियां विभिन्न प्रकार के फाइटोकेमिकल एंटीऑक्सिडेंट के अच्छे स्रोत हैं, जिनमें फेनोलिक एसिड, फ्लेवोनोइड्स, एंथोसायनिन और प्रोएंथोसायनिडिन 9,10 शामिल हैं। अनाज और फलियों की विभिन्न किस्मों में एक अलग फेनोलिक एसिड संरचना हो सकती है। इसलिए अनाज और फलियों और उनकी किस्मों की फेनोलिक एसिड संरचना का अध्ययन करने की आवश्यकता है, ताकि फेनोलिक एंटीऑक्सिडेंट के संबंध में उनके संभावित स्वास्थ्य लाभों को जानना हो सके।

अनाज और फलियां अनाज में फेनोलिक एसिड की मात्रा को मापने और उनकी एंटीऑक्सिडेंट गतिविधियों को निर्धारित करने के लिए कई assays की सूचना दी गई है। पूरे अनाज फेनोलिक एसिड के लिए विश्लेषण के सबसे आम तरीके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री और तरल क्रोमैटोग्राफी11 हैं। इस काम का उद्देश्य मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड संरचना का निर्धारण करने के लिए एक सामान्यीकृत उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफिक विधि का प्रदर्शन करना था, और कुछ पूरे अनाज अनाज और फलियों की कुल फेनोलिक सामग्री और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का निर्धारण करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विधियों का प्रदर्शन करना था।

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Protocol

1. नमूनों के प्रकार

  1. इस अध्ययन के लिए दो अनाज (जैसे, ड्यूरम गेहूं और पीले मकई) और तीन फलियों (जैसे, ब्लैकआई काउपी बीन, सोयाबीन और लाल गुर्दे की बीन) सहित पांच साबुत अनाज के नमूनों का उपयोग करें।
  2. आटे में तीन प्रतियों में प्रत्येक अनाज का 50 ग्राम मिल, एक कॉफी चक्की का उपयोग करके, और उन्हें 500 μm छलनी के माध्यम से पारित करें।
  3. उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. नमूना तैयारी

  1. शुष्क पदार्थ सामग्री का निर्धारण और शुष्क वजन के आधार की अभिव्यक्ति
    नोट:: AOAC (2000)12 की विधि के अनुसार प्रत्येक पाउडर नमूने की सूखी पदार्थ सामग्री निर्धारित करें।
    1. एक मजबूर संवहन ओवन चालू करें और तापमान को 130 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. 30 मिनट से 1 घंटे के लिए ओवन में सूखी desiccant (सिलिका जेल) और सूखे सिलिका जेल को एक desiccator करने के लिए स्थानांतरित।
    3. सटीक रूप से एक साफ, पूर्व-सूखे, और वजन वाले एल्यूमीनियम कैन में प्रत्येक नमूने के 2 ग्राम का वजन करें।
    4. एक मजबूर संवहन ओवन में 1 ज के लिए 130 डिग्री सेल्सियस पर तौले गए नमूनों को सूखाएं।
    5. सूखे नमूने को desiccator को स्थानांतरित करें और परिवेश के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें।
    6. सूखे, ठंडे नमूने का वजन करें और इसका वजन रिकॉर्ड करें।
    7. प्रत्येक नमूने की शुष्क पदार्थ सामग्री की गणना निम्नानुसार करें:
      Equation 1
    8. निम्न सूत्र का उपयोग करके सूखे वजन के आधार पर मापा गया प्रत्येक पैरामीटर व्यक्त करें:
      Equation 2
  2. फेनोलिक एसिड निष्कर्षण
    नोट: Y. Qiu et al.5 की विधि के एक संशोधन का उपयोग करके अनाज के नमूनों में घुलनशील मुक्त फेनोलिक यौगिकों को निकालें जो पूरे अनाज की मिलीग्राम मात्रा से फेनोलिक निष्कर्षण को सक्षम बनाता है।
    1. सही पूरे अनाज के आटे के नमूने के 100 मिलीग्राम सीधे एक एम्बर रंग 2 एमएल क्षमता microcentrifuge ट्यूब में वजन. ट्यूब का गहरा रंग प्रकाश के लिए मिश्रण के संपर्क को रोकने में मदद करता है।
    2. नमूनों वाले ट्यूबों में से प्रत्येक में 80% जलीय एचपीएलसी-ग्रेड मेथनॉल का 1 एमएल जोड़ें।
    3. मेथनॉल समाधान और नमूनों को मिश्रण करने के लिए भंवर संक्षेप में।
    4. मुक्त घुलनशील phenolic यौगिकों को निकालने के लिए 60 मिनट के लिए नमूनों sonicate. प्रकाश से अतिरिक्त सुरक्षा के लिए sonication की अवधि के लिए नमूनों पर एक कवर रखो.
    5. sonication के बाद, 5 मिनट के लिए 20,000 × जी पर मिश्रण centrifuge ठोस अवशेषों तलछट शीर्ष पर supernatant छोड़ने के लिए. मुक्त फेनोलिक यौगिक centrifugation के बाद supernatant में मौजूद हो जाएगा।
    6. supernatant एक साफ microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: supernatant HPLC उपकरण में इंजेक्ट करने से पहले फ़िल्टर किया जा करने की जरूरत है। supernatant फ़िल्टर करने के लिए, एक 3 mL सिरिंज के प्लंजर को हटा दें और एक सिरिंज फ़िल्टर संलग्न करें। फ़िल्टर में 0.22 μm से बड़ा नहीं का एक रंध्र आकार होना चाहिए।
    7. पिपेट सिरिंज के शीर्ष में supernatant के लगभग 0.4 mL. प्लंजर को फिर से डालें और एक शीशी डालने वाली एचपीएलसी शीशी में फिल्टर के माध्यम से तरल को धक्का दें।
    8. एक बार जब उपकरण को एचपीएलसी विश्लेषण के लिए पांडुलिपि में उल्लिखित विधि को चलाने के लिए स्थापित किया गया है, तो नमूना सूची के अनुरूप होने के लिए शीशियों को हिंडोला में लोड करें।
    9. 320 एनएम और 280 एनएम पर एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम प्राप्त करें जो विभिन्न फेनोलिक यौगिकों का प्रतिनिधित्व करने वाली अलग-अलग चोटियों को दिखाते हैं।
    10. उपयुक्त मानक वक्रों का उपयोग करते हुए, 320 एनएम पर हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड की मात्रा निर्धारित करें क्योंकि उनके पास इस तरंग दैर्ध्य पर अधिकतम अवशोषण होता है। उसी सिद्धांत से, हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड को 280 एनएम पर निर्धारित करें।
    11. शेष अर्क को अन्य विश्लेषणों के लिए -20 °C पर संग्रहीत करें।

3. फेनोलिक संरचना

  1. J. Xiang, F. 1. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.B.C. Katundu, और T. Beta 4 की विधि के आधार पर नमूनों में निकाले गए फेनोलिक यौगिकों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफ (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें।
  2. अर्क में घटक फेनोलिक यौगिकों की पहचान करने और मापने के लिए फेनोलिक एसिड मानकों (वैनिलिक एसिड, कैफेइक एसिड, पी-कौमेरिक एसिड, फेरुलिक एसिड, और सिनापिक एसिड) तैयार करें।
  3. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक मानक के 1 मिलीग्राम का वजन करें और प्रत्येक मानक के 1,000 μg / mL का उत्पादन करने के लिए 50% जलीय मेथनॉल के 1 मिलीलीटर में भंग करें।
  4. मानकों के कॉकटेल का उत्पादन करने के लिए 2 एमएल एम्बर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी पांच मानकों के बराबर मात्रा को मिलाएं, जिनमें से प्रत्येक में 200 μg / mL की एकाग्रता होती है।
  5. एक नई ट्यूब में एक मात्रा लेने और जलीय मेथनॉल विलायक की समान मात्रा के साथ पतला करके मानक कॉकटेल के सीरियल dilutions तैयार करें।
  6. 3.125 μg/mL की सांद्रता के लिए नीचे सीरियल dilutions को दोहराएँ।
  7. इसके अलावा, प्रत्येक मानक की 25 μg / mL एकाग्रता प्राप्त करने के लिए विलायक के साथ प्रत्येक मानक को 40 बार अलग से पतला करें।
  8. स्तंभ तापमान को 35 °C और नमूना ओवन तापमान को 15 °C पर सेट करें.
  9. मोबाइल चरण ए (0.1% जलीय फॉर्मिक एसिड) तैयार करने के लिए, 1 लीटर क्षमता वाले वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में फॉर्मिक एसिड के 1 एमएल को स्थानांतरित करें और एचपीएलसी-ग्रेड पानी को 1 एल मार्क में जोड़ें। मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से हिलाएं।
  10. मोबाइल चरण बी (मेथनॉल में 0.1% फॉर्मिक एसिड) तैयार करने के लिए, फॉर्मिक एसिड के 1 मिलीलीटर को 1 एल क्षमता वाले वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और एचपीएलसी-ग्रेड मेथनॉल को 1 एल मार्क में जोड़ें। मिश्रण करने के लिए अच्छी तरह से हिलाएं।
  11. यदि आवश्यक हो तो वॉल्यूम को 1 L चिह्न में समायोजित करें.
  12. एक 0.45 μm हाइड्रोफिलिक फिल्टर पेपर के माध्यम से दोनों मोबाइल चरणों को फ़िल्टर करें।
  13. विश्लेषण के लिए, रिवर्स चरण कॉलम पर प्रत्येक अर्क या मानक (25 μg / mL मानकों और मानक कॉकटेल) के 10 μL इंजेक्ट करें।
  14. एक 25 मिनट के रन के लिए रैखिक ढाल कार्यक्रम के अनुसार मोबाइल चरणों के साथ elute निम्नानुसार: 0-3.81 मिनट, 9% -14% बी; 3.81-4.85 मिनट, 14%-15% बी; 4.85-5.89 मिनट, 15%-15% बी, 5.89-8.32 मिनट, 15%-17% बी; 8.32-9.71 मिनट, 17%-19% बी; 9.71-10.40 मिनट, 19%-19% बी; 10.40-12.48 मिनट, 19%-26% बी; 12.48-13.17 मिनट, 16%-28% बी; 13.17-14.21 मिनट, 28%-35% बी; 14.21-15.95 मिनट, 35%-40% बी; 15.95-16.64 मिनट, 40%-48% बी; 16.64-18.37 मिनट, 48%-53% बी; 18.37-22.53 मिनट, 53%-70% बी; 22.53-22.88 मिनट, 70%-90% बी; 22.88-25.00 मिनट, 90% बी।
  15. नमूनों में घटक फेनोलिक यौगिकों की पहचान करने के लिए, 280 एनएम और 320 एनएम पर सांद्रता 25 μg / mL के प्रामाणिक मानकों के लिए प्राप्त क्रोमैटोग्राफिक चोटियों के प्रतिधारण समय की तुलना करें, अर्क के उन लोगों के साथ।
  16. क्षैतिज अक्ष पर मानकों की एकाग्रता के साथ, फेनोलिक एसिड मानक कॉकटेल के लिए प्लॉट अंशांकन घटता है, और ऊर्ध्वाधर अक्ष पर शिखर क्षेत्र
  17. पहचाने गए फेनोलिक यौगिकों की सांद्रता का अनुमान लगाने के लिए अंशांकन वक्रों का उपयोग करें, प्लॉट पर चोटी के क्षेत्रों की तुलना 280 एनएम और 320 एनएम पर पहचाने गए यौगिकों के साथ करके जैसा कि पहले खंड में उल्लेख किया गया है।

4. कुल phenolic सामग्री

नोट:: F..B 13. Apea-Bah et al.13 द्वारा वर्णित Folin-Ciocalteu विधि का उपयोग करके अर्क की कुल phenolic सामग्री निर्धारित करें।

  1. कुल फेनोलिक सामग्री के अनुमान के लिए, तुलना में अंशांकन वक्रों को प्लॉट करने के लिए 0.025 से 0.150 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता सीमा के भीतर फेरुलिक एसिड और गैलिक एसिड मानकों को तैयार करें।
  2. ऐसा करने के लिए, सटीक रूप से 2 एमएल क्षमता सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में फेरुलिक एसिड और गैलिक एसिड मानकों में से प्रत्येक का 1 मिलीग्राम वजन करें।
  3. प्रत्येक मानक में 50% जलीय मेथनॉल का 1 मिलीलीटर जोड़ें और भंग करने के लिए भंवर, प्रत्येक मानक के 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक का उत्पादन करें।
  4. कुल 500 μL में प्रत्येक स्टॉक समाधान से dilutions की एक श्रृंखला तैयार करें।
  5. पिपेट 18.2 μL प्रत्येक निकालने या मानक के एक 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट पर एक अलग अच्छी तरह से में.
  6. प्रत्येक निकालने या मानक के लिए 10% (v / v) जलीय Folin-Ciocalteu अभिकर्मक के 36.4 μL जोड़ें।
  7. फिर, प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण में 700 mM सोडियम कार्बोनेट के 145.4 μL जोड़ें।
  8. कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर अंधेरे में प्रतिक्रिया मिश्रण को 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  9. 750 एनएम पर एक माइक्रोप्लेट रीडर पर absorbance पढ़ें।
  10. फेनोलिक एसिड मानकों की एकाग्रता के खिलाफ अवशोषण में परिवर्तन के प्लॉट अंशांकन घटता है और कुल फेनोलिक सामग्री का अनुमान लगाने के लिए उनका उपयोग करते हैं।
  11. सूखे वजन के आधार पर मिल्ड नमूने (मिलीग्राम एफएई / जी) के प्रति ग्राम मिलीग्राम फेरुलिक एसिड समकक्षों और मिलीग्राम गैलिक एसिड समकक्षों के रूप में परिणामों को व्यक्त करें।

5. एंटीऑक्सीडेंट assays

नोट: निम्नलिखित तीन assays का उपयोग कर अनाज के अर्क की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता का निर्धारण: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) कट्टरपंथी scavenging क्षमता; 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता, जिसे ट्रोलॉक्स समकक्ष एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (टीईएसी) भी कहा जाता है; और ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता (ORAC)।

  1. मानक वक्रों के लिए Trolox मानकों की तैयारी
    1. पूरे अनाज के अर्क की इन विट्रो एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का अनुमान लगाने के लिए एक मानक के रूप में विटामिन ई का एक पानी में घुलनशील एनालॉग, ट्रोलॉक्स का उपयोग करें।
    2. सटीक रूप से एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ट्रॉलोक्स के 1 मिलीग्राम वजन। 50% जलीय मेथनॉल के 4 मिलीलीटर में भंग करें। भंवर 1 mM (1000 μM) का एक स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए भंग करने के लिए।
    3. डीपीपीएच कट्टरपंथी स्कैवेंजिंग क्षमता और ट्रोलॉक्स समकक्ष एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (टीईएसी) के अनुमान के लिए मानक वक्रों को प्लॉट करने के लिए 50, 100, 200, 400, 600, और 800 μM के छह सांद्रता तैयार करें। इसी तरह, ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता (ORAC) का अनुमान लगाने के लिए ट्रॉलोक्स की 6.25, 12.5, 25, और 50 μM सांद्रता तैयार करें। प्रत्येक सांद्रता की कुल मात्रा को 500 μL तक बनाएँ जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है।
  2. नमूना अर्क का तनुकरण
    1. विश्लेषण से पहले मेथनॉल के साथ नमूना अर्क को पतला करें। यहां, पीले मकई और काउपी के अर्क को दो बार पतला किया गया था, गेहूं और गुर्दे की बीन को पांच बार पतला किया गया था जबकि सोयाबीन के अर्क को मेथनॉल के साथ 10 बार पतला किया गया था।
  3. Trolox समतुल्य एंटीऑक्सीडेंट क्षमता (TEAC) परख
    1. F.B. Apea-Bah et al.14 द्वारा पहले वर्णित विधि का उपयोग करके नमूनों की Trolox समतुल्य एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (TEAC) को मापें।
    2. एक साफ 2 एमएल क्षमता एम्बर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ABTS के 8.23 मिलीग्राम वजन.
    3. अगला, पोटेशियम परसल्फेट के 1.62 मिलीग्राम का वजन एक और साफ 2 मिलीलीटर क्षमता एम्बर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में करें।
    4. उनमें से प्रत्येक में 1 एमएल आसुत पानी जोड़ें और उन्हें भंग करने के लिए भंवर।
      नोट: यह 6 mM जलीय पोटेशियम परसल्फेट समाधान के साथ 16 mM ABTS स्टॉक समाधान में परिणाम है।
    5. ABTS और पोटेशियम persulfate समाधान बराबर मात्रा में मिश्रण द्वारा ABTS स्टॉक समाधान तैयार करें। समाधान तुरंत एक गहरे रंग में बदल जाएगा।
    6. 12-16 घंटे के लिए अंधेरे में अभिकर्मक मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    7. ABTS काम समाधान बनाने के लिए 200 mM फॉस्फेट buffered खारा (PBS) के साथ ABTS स्टॉक समाधान 30 बार पतला। ऐसा करने के लिए, ABTS स्टॉक समाधान के 2 mL करने के लिए 200 mM PBS के 58 mL जोड़ें। काम करने वाले समाधान में 0.27 mM ABTS और 0.1 mM पोटेशियम परसल्फेट होगा।
    8. विश्लेषण के लिए, प्रत्येक पतला निकालने या Trolox के 10 μL को 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में रखें।
    9. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ABTS काम समाधान के 190 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण incubate।
    10. एक माइक्रोप्लेट रीडर में 750 एनएम पर प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण को मापें।
    11. अंशांकन वक्र को प्लॉट करने के लिए 100 से 800 μmol / L तक की एकाग्रता में ट्रोलॉक्स मानकों का उपयोग करें।
    12. अंशांकन वक्र से ABTS कट्टरपंथी scavenging क्षमता का अनुमान लगाएं।
    13. सूखे वजन के आधार पर माइक्रोमोल ट्रॉलॉक्स प्रति ग्राम (μmol TE / g) नमूने के बराबर के रूप में परिणामों को व्यक्त करें।
  4. DPPH परख
    नोट:: F.B. Apea-Bah et al.13 द्वारा पहले वर्णित विधि का उपयोग कर नमूनों की DPPH कट्टरपंथी scavenging क्षमता निर्धारित करें। DPPH एंटीऑक्सिडेंट परख एक कट्टरपंथी पैदा यौगिक, DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) की आवश्यकता है.
    1. सटीक रूप से एक खाली 50 मिलीलीटर क्षमता सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डीपीपीएच के 1.2 मिलीग्राम वजन। एक 60 μmol / L मेथनॉलिक समाधान तैयार करने के लिए मेथनॉल के 30 मिलीलीटर में DPPH को भंग करें।
      नोट: DPPH परख नमूना अर्क की क्षमता का परीक्षण करने के लिए DPPH द्वारा उत्पादित मुक्त कणों scavenge.
    2. विश्लेषण के लिए, माइक्रोप्लेट कुओं में नमूना अर्क या ट्रॉलोक्स समाधान के 5 μL जोड़ें।
    3. इसके बाद, 60 μmol / L DPPH मेथनॉलिक समाधान के 195 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. 515 एनएम पर प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण को मापें।
    5. ऊर्ध्वाधर अक्ष पर अवशोषण में परिवर्तन और क्षैतिज अक्ष पर ट्रॉलोक्स सांद्रता के साथ, एक अंशांकन वक्र को प्लॉट करने के लिए ट्रोलॉक्स मानकों (50-800 μmol / L) का उपयोग करें।
    6. अंशांकन वक्र से DPPH scavenging क्षमता का अनुमान लगाएं।
    7. सूखे वजन के आधार पर माइक्रोमोल ट्रॉलॉक्स प्रति ग्राम (μmol TE / g) नमूने के बराबर के रूप में परिणामों को व्यक्त करें।
  5. ऑक्सीजन रेडिकल अवशोषण क्षमता
    1. F.B. Apea-Bah et al.13 की विधि के आधार पर नमूनों की ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता (ORAC) ज्ञात कीजिये।
    2. शुरू करने के लिए, 75 mM पोटेशियम फॉस्फेट (K 2 HPO4/ KH 2 PO4) बफर में 1,000 μM Trolox मानक स्टॉक समाधान से सांद्रता6.25, 12.5,25, और 50 μM के ट्रॉलोक्स मानक तैयार करें।
    3. ऐसा करने के लिए, 1 मिलीग्राम ट्रॉलोक्स पाउडर का वजन करें और 1,000 μM स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए sonication के तहत बफर समाधान के 4 मिलीलीटर में भंग करें।
    4. फिर, स्टॉक समाधान के 50 μL को 2 mL क्षमता सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लें और 50 μM Trolox समाधान के 1,000 μL प्राप्त करने के लिए बफर समाधान के 950 μL के साथ पतला करें।
    5. पिपेट 500 μL एक नई ट्यूब में 50 μM समाधान के और एक 25 μM Trolox समाधान प्राप्त करने के लिए बफर की समान मात्रा के साथ पतला।
    6. 12.5 μM प्राप्त करने के लिए 25 μM के सीरियल कमजोर पड़ने को दोहराएं, और फिर इसी तरह 6.25 μM प्राप्त करने के लिए 12.5 μM के कमजोर पड़ने को दोहराएं।
    7. नमूना अर्क के उपयुक्त dilutions तैयार करें।
    8. पीले मकई और cowpea अर्क 20 बार पतला, गेहूं और गुर्दे बीन 50 बार निकालता है, और सोयाबीन निकालने बफर समाधान के साथ 100 बार.
    9. स्वचालित पिपेटिंग के लिए एक काले 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुओं में प्रत्येक नमूने या ट्रॉलोक्स मानक के 200 μL स्थानांतरित करें।
    10. फिर, ओआरएसी उपकरण के साथ प्रदान किए गए तीन अभिकर्मक टैंकों को निम्न के साथ भरें: (1) बफर समाधान; (2) बफर में 0.816 nM फ्लोरोसीन; और (3) बफर में 2,2'-azobis (2-amidinopropane) डाइहाइड्रोक्लोराइड (AAPH) के 153 mM.
    11. स्वचालित pipetting के लिए उन्हें अपने receptacles में जगह है.
    12. मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया के आधार पर विश्लेषण के लिए ORAC मशीन और स्वचालित pipetting प्रणाली स्थापित करें।
    13. विश्लेषण के लिए, एक स्पष्ट नीचे काले 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट के कुओं के लिए प्रत्येक पतला निकालने या मानक के 25 μL हस्तांतरण के लिए स्वचालित pipetting प्रणाली की स्थापना।
    14. फिर, स्वचालित रूप से बफर में 0.816 nM fluorescein के 150 μL जोड़ें।
    15. ORAC मशीन में 15 मिनट के लिए 37 °C पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करें।
    16. बाद में, स्वचालित रूप से प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण में AAPH के 25 μL जोड़ें।
    17. उन्हें ORAC मशीन में 50 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    18. प्रतिदीप्ति क्षय को मापने के लिए ORAC मशीन स्थापित करें, इनक्यूबेशन अवधि में, क्रमशः 485 एनएम और 520 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य पर।
    19. माप के बाद, क्षैतिज अक्ष पर ट्रोलॉक्स (6.25-50 μM) और ऊर्ध्वाधर अक्ष पर प्रतिदीप्ति क्षय के साथ एक ट्रोलॉक्स मानक वक्र प्लॉट करें।
    20. Trolox मानक वक्र से अर्क की ऑक्सीजन कट्टरपंथी absorbance क्षमता का अनुमान लगाएं।
    21. सूखे वजन के आधार पर μmol TE / g नमूने के रूप में परिणामों को व्यक्त करें।
  6. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. सभी परिणामों को कम से कम तीन प्रतियों के मानक विचलन ± साधन के रूप में प्रस्तुत करें।
    2. प्रतिक्रिया चर पर अनाज के प्रकार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रसरण (एनोवा) का विश्लेषण करें।
    3. जहां पी < 0.05 पर महत्वपूर्ण अंतर मौजूद हैं, साधनों की तुलना करने के लिए कम से कम महत्वपूर्ण अंतर (एलएसडी) का उपयोग करें।
    4. फेनोलिक सामग्री और एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं के बीच संबंधों का अनुमान लगाने के लिए पियर्सन सहसंबंध विश्लेषण करें।

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Representative Results

तालिका 2 फेनोलिक एसिड को दर्शाती है जो अनाज और फलियों के अनाज में पहचाने गए थे। उपलब्ध प्रामाणिक मानकों के आधार पर, नमूनों में चार फेनोलिक एसिड की पहचान की गई थी और वे हैं: वैनिलिक, कैफिक, पी-कौमेरिक, और फेरुलिक एसिड। वैनिलिक एसिड एक हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड है जबकि अन्य तीन हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड हैं। वैनिलिक एसिड की पहचान केवल ब्लैकआई काउपी बीन में की गई थी, जबकि कैफेइक एसिड की पहचान केवल किडनी बीन में की गई थी। पी-कौमेरिक एसिड की पहचान पीले मकई, काउपी बीन और सोयाबीन में की गई थी। इसकी एकाग्रता सूखे वजन के आधार पर 7.57 और 12.48 μg / g आटे के बीच थी, जिसमें पीले मकई का मूल्य सबसे कम था जबकि सोयाबीन का उच्चतम मूल्य था। फेरुलिक एसिड एकमात्र फेनोलिक एसिड था जिसे सभी नमूनों में पहचाना गया था। इसकी सांद्रता शुष्क वजन के आधार पर 5.69 और 41.76 μg / g आटे के बीच थी। नमूनों में, फेरुलिक एसिड एकाग्रता सोयाबीन में सबसे अधिक थी, इसके बाद काउपी बीन था, जबकि गेहूं, पीले मकई और गुर्दे की बीन के तुलनीय मूल्य थे (तालिका 2)। जब सभी फेनोलिक एसिड सांद्रता को प्रत्येक नमूने के लिए अभिव्यक्त किया गया था, तो उनके मूल्यों में निम्नलिखित क्रम में कमी आई: सोयाबीन > काउपी बीन > पीला मकई = गुर्दे की बीन > गेहूं।

तालिका 3 ने अनाज और फलियों के अनाज की कुल फेनोलिक सामग्री (टीपीसी) और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता को दिखाया। एंटीऑक्सिडेंट क्षमता में DPPH कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता, TEAC और ORAC शामिल थे। इन तीन मूल्यों के योग ने इसलिए नमूनों की कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता दी। टीपीसी को तुलना के उद्देश्य से फेरुलिक एसिड समकक्ष और गैलिक एसिड समकक्ष दोनों में मापा गया था। टीपीसी सूखे वजन के आधार पर 1.16 और 2.78 मिलीग्राम एफएई / जी आटा और 0.63 से 1.48 मिलीग्राम जीएई / जी आटा के बीच था। समतुल्य इकाई के बावजूद, नमूनों के टीपीसी में निम्नलिखित क्रम में कमी आई: सोयाबीन > गेहूं = पीला मकई = किडनी बीन > काउपी बीन।

नमूनों की डीपीपीएच कट्टरपंथी स्कैवेंजिंग क्षमता शुष्क वजन के आधार पर 4.48 और 14.87 μmol TE / g आटा के बीच थी। सोयाबीन में उच्चतम डीपीपीएच स्कैवेंजिंग क्षमता थी, इसके बाद किडनी बीन, जबकि पीले मकई और काउपी बीन के तुलनीय मूल्य थे। गेहूं में डीपीपीएच कट्टरपंथी को साफ करने की सबसे कम क्षमता थी। नमूनों की ट्रोलॉक्स समतुल्य एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (टीईएसी) शुष्क वजन के आधार पर 12.82 और 57.24 μmol TE / g आटा के बीच थी। फिर से, सोयाबीन में उच्चतम टीईएसी मूल्य था, इसके बाद गुर्दे की बीन, और फिर गेहूं, जबकि पीले मकई और काउपीया बीन में तुलनात्मक रूप से कम टीईएसी मूल्य थे। नमूनों की ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता शुष्क वजन के आधार पर 0.35 और 1.67 μmol TE / g आटे के बीच थी, जिसमें अनाज के अनाज का मूल्य सबसे कम था जबकि सोयाबीन का उच्चतम मूल्य था। जब सभी एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं को अभिव्यक्त किया गया था, तो नमूनों में उनके मूल्य निम्नलिखित क्रम में कम हो गए: सोयाबीन > किडनी बीन > पीला मकई = काउपी बीन > गेहूं।

दो टीपीसी मूल्यों के बीच एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध था, और टीईएसी, ओआरएसी और कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता (टीएसी) (तालिका 4) के लिए मूल्य। हालांकि, TPC मान और DPPH के बीच कमजोर सहसंबंध था।

Figure 1
चित्र 1: अनाज और फलियों में पहचाने जाने वाले हाइड्रोक्सीबेंजोइक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: अनाज और फलियों में पहचाने जाने वाले हाइड्रोक्सीसिनमिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1: DPPH और ABTS मानक घटता के लिए Trolox सांद्रता की तैयारी. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: कुछ साबुत अनाज अनाज और फलियों की फेनोलिक एसिड सामग्री। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: कुल फेनोलिक सामग्री (टीपीसी) और कुछ साबुत अनाज अनाज और फलियों की एंटीऑक्सिडेंट क्षमता। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: कुल फेनोलिक सामग्री और कुछ अनाज और फलियां अनाज की एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं के लिए पियर्सन सहसंबंध मैट्रिक्स। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

साबुत अनाज को प्रतिनिधि अनाज अनाज और फलियां के रूप में चुना गया था जो दुनिया भर में व्यापक खाद्य अनुप्रयोगों को पाते हैं। जबकि प्रत्येक अनाज की किस्मों के बीच विविधताएं मौजूद हो सकती हैं, इस अध्ययन का ध्यान पूरे अनाज के लिए मुफ्त फेनोलिक एसिड निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक सामान्यीकृत विधि का प्रदर्शन करना था। निष्कर्षण विधि को नमूनों और सॉल्वैंट्स की मात्रा को काफी हद तक कम करके संशोधित किया गया था, ताकि रसायनों की मात्रा को कम किया जा सके जो इस तरह के प्रयोगों के आयोजित होने पर पर्यावरण में जारी किए जाएंगे। संशोधन भी साबुत अनाज की मिलीग्राम मात्रा से phenolic निष्कर्षण सक्षम बनाता है.

HPLC विश्लेषण नमूने में घटक फेनोलिक एसिड का एक क्रोमैटोग्राम का उत्पादन करता है। एक फेनोलिक एसिड का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रत्येक क्रोमैटोग्राफिक शिखर को प्रामाणिक फेनोलिक एसिड मानकों के साथ एक पूर्वनिर्धारित तरंग दैर्ध्य पर इसके प्रतिधारण समय की तुलना करके पहचाना जा सकता है। पराबैंगनी (यूवी) डिटेक्टरों का उपयोग आमतौर पर यूवी तरंग दैर्ध्य सीमा के भीतर फेनोलिक एसिड की पहचान करने के लिए किया जाता है। Hydroxybenzoic एसिड आमतौर पर 254-280 एनएम के बीच की पहचान की जाती है जबकि hydroxycinnamic एसिड आमतौर पर 300-330 एनएम15 के बीच की पहचान की जाती है। फोटोडायोड सरणी डिटेक्टरों का उपयोग पूरे यूवी-दृश्यमान तरंग दैर्ध्य सीमा को स्कैन करने के लिए किया जा सकता है, और विशेष रूप से नमूनों में मौजूद यौगिकों के यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रा को निर्धारित करने में उपयोगी है जिनका कभी अध्ययन नहीं किया गया है। आर जे रॉबिन्स और एस आर बीन15 ने अधिकतम अवशोषण के लिए निम्नलिखित तरंग दैर्ध्य की सूचना दी, वैनिलिक एसिड, कैफेइक एसिड, पी-कौमेरिक एसिड, और फेरुलिक एसिड के लिए, क्रमशः: 260 एनएम; 325 nm; 310 एनएम; 325 एनएम। पहचान की एचपीएलसी विधि आमतौर पर ज्ञात फेनोलिक एसिड संरचना के नमूनों के लिए स्वीकार्य है, जिसका प्रतिधारण समय और यूवी वर्णक्रमीय डेटा पहले स्थापित किया गया है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ यौगिक सह-elute कर सकते हैं जब स्तंभ पर अच्छा अलगाव प्राप्त नहीं किया जाता है। अज्ञात फेनोलिक एसिड संरचना के नमूनों के लिए, पहचान के लिए प्रामाणिक मानकों के अलावा एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया जाता है। प्रकाशित साहित्य फेनोलिक यौगिकों के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करता है जो पहले अध्ययन के तहत नमूने में या इसी तरह के नमूनों में 3,9,14 की पहचान की गई है। यह ध्यान देने योग्य है कि एचपीएलसी विश्लेषण के दौरान, क्रोमैटोग्राम में फेनोलिक एसिड चोटियों को केवल तभी पहचाना जा सकता है जब प्रामाणिक मानक तुलना के लिए उपलब्ध हों। इसलिए, अन्य चोटियां हो सकती हैं जो उनके संबंधित मानकों के बिना पहचानयोग्य नहीं होंगी। यह एचपीएलसी विश्लेषण के साथ एक सीमा है जिसे दूर किया जा सकता है जब एचपीएलसी को एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर के साथ जोड़ा जाता है। इसलिए, परिमाणित फेनोलिक एसिड की कुल एकाग्रता पहचाने गए फेनोलिक एसिड की संख्या पर निर्भर करेगी।

Folin-Ciocalteu विधि, जो पहली बार V. L. Singleton और J. A. Rossi (1965)16 द्वारा प्रकाशित किया गया था, एक इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण-आधारित परख है जिसका उपयोग एक विश्लेषक17 के TPC का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। यह एक क्षारीय माध्यम में फॉस्फोमोलिब्डेट-फॉस्फोटुंगस्टेट को कम करने के लिए विश्लेषक की क्षमता पर आधारित है, जिससे इसे पीले से गहरे नीले रंग के समाधान में परिवर्तित किया जा सकताहै। परिणामी समाधान के अवशोषण को तब 765 एनएम19 पर मापा जा सकता है। अभिकर्मक अकेले फेनोलिक यौगिकों के लिए विशिष्ट नहीं है, लेकिन थिओल जैसे गुणों को कम करने, शर्करा और कुछ अमीनो एसिड (जैसे, टायरोसिन) को कम करने के साथ कई अन्य यौगिकों के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। इसलिए, यह सुझाव दिया जाता है कि टीपीसी का उपयोग नमूना या विश्लेषक17 की कम करने वाली संपत्ति का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। फेनोलिक निष्कर्षण के दौरान, अधिकांश हस्तक्षेप करने वाले यौगिकों को बाहर रखा जाता है और चूंकि फेनोलिक यौगिक सबसे सर्वव्यापी फाइटोकेमिकल्स हैं, इसलिए फोलिन-सियोकाल्ट्यू परख एक नमूने के टीपीसी का अनुमान लगाने के लिए एक उपयोगी विधि बनी हुई है। अधिकांश नमूनों में जिनकी फेनोलिक संरचना ज्ञात नहीं है, गैलिक एसिड का उपयोग टीपीसी का अनुमान लगाने के लिए एक अंशांकन वक्र खींचने के लिए एक मानक के रूप में किया जाता है। हालांकि, सभी नमूनों में गैलिक एसिड नहीं होगा। वर्तमान अध्ययन में, हमने गैलिक एसिड के परिणामों की तुलना करने के लिए फेरुलिक एसिड का उपयोग किया। एक दो-नमूना टी-परीक्षण से पता चला है कि फेरुलिक एसिड समकक्ष के रूप में निर्धारित टीपीसी में गैलिक एसिड समकक्ष के रूप में व्यक्त किए गए टीपीसी की तुलना में काफी अधिक मूल्य थे। चूंकि हमने अपने एचपीएलसी विश्लेषण और अन्य रिपोर्ट किए गए परिणामों के आधार पर सभी नमूनों में मौजूद होने के लिए फेरुलिक एसिड की पुष्टि की है, इसलिए हम टीपीसी परिणामों को फेरुलिक एसिड समकक्ष के रूप में व्यक्त करने की ओर अधिक झुकेंगे। यह नमूने में एक प्रमुख घटक फेनोलिक यौगिक के सापेक्ष टीपीसी को व्यक्त करने के लिए उपयोगी है।

तीन अलग-अलग एंटीऑक्सिडेंट assays का उपयोग करते हुए, यह देखा गया कि विभिन्न अनाज ने मुक्त कणों को साफ करने के लिए अपनी क्षमताओं में अलग-अलग प्रतिक्रिया दी। DPPH कट्टरपंथी scavenging क्षमता और TEAC परख इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण (ईटी) तंत्र पर आधारित हैं, जबकि ORAC परख हाइड्रोजन परमाणु हस्तांतरण (HAT) तंत्र20 पर आधारित है. इसलिए, तीन assays के संयोजन एक नमूने की एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का एक बेहतर संकेत देता है। यह ध्यान देने योग्य है कि, ORAC परख शारीरिक रूप से प्रासंगिक पेरोक्सिल कट्टरपंथी को मैला ढोने के लिए एक नमूने की क्षमता को मापता है, जो एक शारीरिक प्रणाली में, लिपिड पेरोक्सीडेशन का कारण बन सकता है जो फोम सेल गठन और एथेरोजेनेसिस21,22 से संबंधित है। दूसरी ओर, DPPH और TEAC assays radicals का उपयोग करते हैं जो शारीरिक प्रासंगिकता के नहीं हैं। हालांकि, उनके उपयोग में आसानी उन्हें एक नमूने की कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता का अनुमान लगाने के लिए तेजी से तरीकों के रूप में उपयोगी बनाती है। ORAC परख भी अन्य इन विट्रो या पूर्व विवो एंटीऑक्सिडेंट assays कि कोशिकाओं और डीएनए biomarkers23 के रूप में उपयोग के साथ अच्छी तरह से तुलना करते हैं.

मुक्त फेनोलिक एसिड के निष्कर्षण और पहचान, कुल फेनोलिक सामग्री का अनुमान, और एंटीऑक्सिडेंट गुणों के निर्धारण के लिए ऊपर वर्णित सभी तरीकों को मानकीकृत नहीं किया गया है। तरल क्रोमैटोग्राफिक स्तंभों के विभिन्न निर्माता अपनी पहचान के लिए फेनोलिक एसिड को अलग करने के लिए सॉल्वैंट्स के विभिन्न ग्रेडिएंट एल्यूशन सिस्टम की सिफारिश करते हैं। हालांकि Folin-Ciocalteu विधि नमूनों की कुल phenolic सामग्री का अनुमान लगाने के लिए सबसे आम है, विभिन्न प्रयोगशालाओं इस परख अलग तरह से प्रदर्शन करते हैं. एंटीऑक्सिडेंट विधियों के बारे में भी यही कहा जा सकता है। इसलिए, परिणामों की अंतर-प्रयोगशाला तुलना को बढ़ावा देने के लिए इन विधियों के सामंजस्य की आवश्यकता है। मजबूत भविष्यवाणी मॉडल के विकास की भी आवश्यकता है जो विश्लेषण के इन महत्वपूर्ण तरीकों से मापे गए एंटीऑक्सिडेंट गुणों से फेनोलिक एसिड संरचना से संबंधित हो सकती है।

इस अध्ययन से यह निष्कर्ष निकाला गया है कि उपयोग की जाने वाली विलायक निष्कर्षण विधि साबुत अनाज अनाज और फलियों के आटे से मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड निकालने में प्रभावी है, जिससे उनकी पहचान और परिमाणीकरण की सुविधा मिलती है। एचपीएलसी विधि पूरे अनाज के अर्क में मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड की पहचान और परिमाणीकरण को सक्षम बनाती है, बशर्ते तुलना के लिए प्रामाणिक मानक हों। तीन अलग-अलग एंटीऑक्सिडेंट विधियों का उपयोग करके: DPPH, TEAC, और ORAC, पूरे अनाज से मुक्त घुलनशील फेनोलिक अर्क की एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं को हाइड्रोजन परमाणु हस्तांतरण और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण तंत्र के आधार पर प्रभावी ढंग से निर्धारित किया जा सकता है। यह अध्ययन आगे पुष्टि करता है कि साबुत अनाज उनके फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं में भिन्न होते हैं। सहसंबंध विश्लेषण दर्शाता है कि मापा गया एंटीऑक्सिडेंट क्षमताएं पूरे अनाज मुक्त घुलनशील अर्क में घटक फेनोलिक एसिड से संबंधित हैं। यद्यपि टीईएसी और डीपीपीएच दोनों इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण तंत्र द्वारा मुक्त कणों को साफ करते हैं, वे टीपीसी के साथ अलग-अलग सहसंबंधित हैं। विभिन्न एंटीऑक्सिडेंट assays के व्यवहार में अंतर assays की एक किस्म का उपयोग कर नमूनों की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता निर्धारित करने की आवश्यकता है। अध्ययन किए गए पांच साबुत अनाजों में, सोयाबीन में उच्चतम फेनोलिक एसिड एकाग्रता और तदनुसार उच्चतम एंटीऑक्सिडेंट क्षमता होती है। अध्ययन यह भी दर्शाता है कि पूरे अनाज मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड को निकाला जा सकता है और उनकी एंटीऑक्सिडेंट क्षमताओं का अध्ययन जलीय मेथनॉलिक समाधान के 1 एमएल के रूप में कम से कम किया जा सकता है, जिससे पर्यावरण में जारी प्रयोगशाला रसायनों की मात्रा कम हो जाती है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखकों ने सुश्री एलिसन सेर और सुश्री हन्ना ओदुरो-ओबेंग के तकनीकी समर्थन के साथ-साथ सुश्री जेनिस फजार्डो और श्री मिगुएल डेल रोसारियो द्वारा वीडियो संपादन समर्थन को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Falcon conical centrifuge tubes Fisher Scientific 05-527-90
2 mL Amber glass ID Surestop vial Thermo Scientific C5000-2W
2 mL Amber microcentrifuge tubes VWR 20170-084
2,2′-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Sigma-Aldrich 440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥98%, Sigma Aldrich A1888-2G
2,2-Diphenyl-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6) Sigma Aldrich D913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥98% Fluka Chemika 56510
9 mm Autosampler Vial Screw Thread Caps Thermo Scientific 60180-670
96 well flat bottom plates Fisher Scientific 12565501
Agilent BioTek ELx800 microplate reader Fisher Scientific BT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 Automated Microplate Pipetting System Fisher Scientific N/A
Agilent BioTek FLx800 Microplate Fluorescence Reader Fisher Scientific N/A
Analytical balance SI-114 Denver Instrument SI-114.1
Autosampler, Waters 717 Plus Waters WAT078900
BD 3 mL syringe Luer-Lok Tip BD 309657
Bransonic ultrasonic cleaner, Branson 5510 Millipore Sigma Z245143
Corning LSE Vortex Mixer Corning 6775
Durapore Filter (0.45 µm PVDF Membrane) Merck Millipore Ltd HVLP04700 
Durapore Membrane Filters (0.45 µm HV) Merck Millipore Ltd HVHP04700
Eppendorf Research plus, 0.5-10 µL Eppendorf 3123000020
Eppendorf Research plus, 0.5-5 mL Eppendorf 3123000071
Eppendorf Research plus, 100-1000 µL Eppendorf 3123000063
Eppendorf Research plus, 10-100 µL Eppendorf 3123000047
Ethyl acetate, HPLC grade Fisher Chemical E195-4
Ferulic acid standard Sigma Aldrich 128708-5G
Fluorescein Fisher Scientific AC119245000
Folin & Ciocalteu phenol reagent Sigma Aldrich F9252
Formic acid, 99% Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a 27048-0010
Gallic acid standard Sigma G7384
High performance liquid chromatograph (HPLC), Waters 2695 Waters 960402
Methanol, HPLC grade Fisher Chemical A452-4
Micro pipet tips, 0.5-10 µL Fisherbrand 21-197-2F
Microcentrifuge Sorvall Legend Micro 21 centrifuge Thermo Scientific 75002435
Multichannel micropipette, Proline Plus, 30-300 µL Sartorius 728240
Photodiode array detector, Waters 2996 Waters 720000350EN
Pipet tips, 1000 µL VWR 83007-382
Pipet tips, 1-5 mL VWR 82018-840
Potassium persulfate (K2S2O8), ≥99.0% Sigma Aldrich 216224-100G
Potassium phosphate dibasic anhydrous (K2HPO4) Fisher Scientific P288-500
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific P285-500
PYREX 250 mL Short Neck Boiling Flask, Round Bottom Corning 4321-250
Reversed phase C18 Analytical Column (100 x 3 mm) Accucore aQ Thermo Scientific 17326-103030
Roto evaporator, IKA RV 10 IKA  0010005185
Sodium carbonate (NaCO3) anhydrous Fisher Chemical S263-1
Sodium chloride (NaCl) Mallinckrodt AR® 7581
Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) Fisher Scientific BP332-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4) Fisher bioreagents BP329-500
Standardization pipet tips 0-200µL Fisherbrand 02-681-134
Syringe Driven Filter unit (0.22 µm)  Millex®-GV SLGVR04NL
Target micro-serts vial insert (400 µL) Thermo Scientific C4011-631
Ultrapure water (Direct Q-3 UV system with pump) Millipore ZRQSVP030

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References

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अनाज और फलियों की नि: शुल्क घुलनशील फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सामान्यीकृत विधि
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Apea-Bah, F. B., Drawbridge, P., Beta, T. A Generalized Method for Determining Free Soluble Phenolic Acid Composition and Antioxidant Capacity of Cereals and Legumes. J. Vis. Exp. (184), e62467, doi:10.3791/62467 (2022).

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