Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Sommario

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Abstract

I saggi di spostamento termico (TSA) esaminano come la temperatura di fusione (T_m) di una proteina bersaglio cambia in risposta ai cambiamenti nel suo ambiente(ad esempio,composizione tampone). L'utilità della TSA, e in particolare della fluorimetria a scansione nano-differenziale (nano-DSF), è stata stabilita nel corso degli anni, sia per trovare condizioni che aiutano a stabilizzare una proteina specifica sia per esaminare il legame del ligando monitorando i cambiamenti nel T_mapparente . Questo documento presenta uno screening efficiente della libreria di frammenti Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 composti) mediante l'uso di nano-DSF, monitorando T_m per identificare potenziali legami di frammenti. I prerequisiti relativi alla qualità e alla concentrazione delle proteine per l'esecuzione di esperimenti nano-DSF sono brevemente delineati seguiti da un protocollo passo-passo che utilizza un distributore robotico da nano litri comunemente usato nei laboratori di biologia strutturale per preparare i campioni richiesti in piastre a 96 pozzetti. Il protocollo descrive come le miscele di reagenti vengono trasferite ai capillari necessari per le misurazioni nano-DSF. Inoltre, questo documento fornisce protocolli per misurare la denaturazione termica (monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano) e l'aggregazione (monitoraggio della diffusione della luce) e le fasi successive per il trasferimento e l'analisi dei dati. Infine, vengono discussi esperimenti di screening con tre diversi target proteici per illustrare l'uso di questa procedura nel contesto delle campagne di scoperta dei lead. Il principio generale del metodo descritto può essere facilmente trasferito ad altre librerie di frammenti o adattato ad altri strumenti.

Introduzione

I programmi di scoperta di farmaci spesso iniziano con lo screening di composti chimici per la loro capacità di interagire e / o modificare la funzione dei bersagli farmacologici, il più delle volte proteine. I cosiddetti "successi" che si trovano in tali schermi, gettarono le basi per la scoperta di nuovi lead e candidati allo sviluppo, e per la maggior parte dei nuovi farmaci che vengono concessi in licenza in questi giorni. La disponibilità di metodi ad alto rendimento è quindi indispensabile per vagli un numero enorme di bersagli disponibili con un numero enorme di composti diversi per identificare rapidamente il loro legame stretto o la loro capacità di modulare una funzione specifica del bersaglio. Dopo che gli hit sono stati identificati, le combinazioni hit-target più promettenti vengono spinte in una vasta pipeline di sviluppo di farmaci utilizzando altre tecnologie, spesso costose e dispendiose in termini di tempo, per comprendere le "relazioni struttura-attività" (SAR).

Gli approcci di biologia strutturale, come quelli offerti dai programmi di accesso finanziati dall'UE "Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research" (iNEXT) e dal suo attuale successore iNEXT-Discovery, sono spesso utilizzati per studiare le interazioni di numerosi composti in modo estremamente dettagliato, migliorando al contempo l'affinità e le proprietà farmacologiche dei colpi iniziali tipicamente diversi cicli di chimica sintetica¹. I composti di piombo che emergono da queste campagne "da hit to lead" diventano candidati allo sviluppo e entrano in studi preclinici. La metodologia di screening molecolare ben sviluppata può essere approssimativamente classificata in due approcci, vale a dire la scoperta del piombo basata sul ligando (LBLD) e la scoperta del piombo basata su frammenti (FBLD). Nelle campagne LBLD, i recettori proteici vengono sottoposti a screening con poche migliaia di ligandi scelti a mano (in base alla struttura dei ligandi naturali o alla struttura del bersaglio), o con molte decine di migliaia di composti in librerie di ligandi simili a farmaci che coprono una grande porzione di spazio chimico.

Di solito, i composti vengono testati per la loro attività inibitoria in un test di attività, in genere monitorando una funzione enzimatica. Nelle campagne FBLD^2,3,4,5,tuttavia, alcune centinaia di composti che sono tipicamente più piccoli dei farmaci (100-200 Dalton) vengono testati per la loro capacità di legare direttamente il bersaglio, senza l'uso di un test di attività. Questo legame potrebbe interferire con l'attività del bersaglio e può essere misurato con molti metodi biofisici che riportano direttamente sulla capacità dei frammenti di legarsi al bersaglio, o con metodi strutturali come la cristallografia a raggi X⁶ e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare⁷e, più recentemente, anche la crio-microscopia elettronica. Quando i frammenti si legano in luoghi diversi che sono vicini l'uno all'altro sulla proteina, i diversi frammenti di legame, di solito a bassa affinità, possono essere combinati razionalmente chimicamente per creare un piccolo insieme di lead che possono essere studiati in modo più dettagliato. Ciò si traduce spesso in composti più potenti e di maggiore affinità e questa metodologia ha iniziato a produrre molecole importanti con potenziale clinico. La scelta di una libreria di frammenti "ideale" che sfrutta efficacemente i gruppi chimici è stata un'area di ricerca attiva per molti anni^8,9,10.

Mentre l'enfasi iniziale era sulla copertura dell'intero spazio chimico, l'attenzione successiva si è concentrata sul consentire alla combinazione chimica a valle di colpi di frammento di produrre composti di piombo. Tale ricerca ha portato alle cosiddette biblioteche "in bilico". Questi contengono frammenti con almeno un gruppo funzionale che consentono una chimica sintetica di follow-up rapida ed economica per progressi efficienti nello studio del SAR. Una delle attività catalizzato da iNEXT è stata quella di aggiornare la libreria in bilico sviluppata dai ricercatori del Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Questo sforzo congiunto ha portato alla libreria DSi-Poised¹¹, che è stata convalidata anche all'interno di iNEXT¹². Successivamente, questa libreria è stata allineata con la disponibilità di composti nel REAL Database di Enamine Ltd., un'organizzazione di ricerca chimica e produttrice di grandi collezioni di blocchi di costruzione e librerie composte per lo screening. DSi-Poised è ora disponibile per chiunque per l'acquisto, ma anche disponibile in molti laboratori partner di iNEXT-Discovery per progetti di screening dei frammenti supportati.

Le tecnologie di cristallografia a raggi X di fascia alta e di biologia strutturale NMR hanno entrambi i loro vantaggi e svantaggi per FBLD. Entrambi richiedono campioni target isolati e producono i dettagli atomici ad alta risoluzione necessari per FBLD. Tuttavia, i cristalli sono necessari per la cristallografia a raggi X e i frammenti si legano a cavità nelle regioni proteiche ben ordinate che non sono coinvolte nella costruzione del reticolo cristallino tridimensionale. La NMR della soluzione spesso produce risultati diversi dalla cristallografia a raggi X, in quanto non è influenzata dall'ambiente cristallino ed è buona nel rilevare il legame anche in regioni proteiche parzialmente ordinate. Tuttavia, mentre gli esperimenti NMR basati su ligando sono relativamente veloci, richiedono ancora una notevole quantità di tempo e materiale e possono essere eseguiti di routine solo per bersagli o domini proteici relativamente piccoli. Allo scopo di dare priorità ai composti per esperimenti cristallografici o NMR, sono stati utilizzati approcci biofisici^13,14,15.

Poiché la strumentazione recente e i protocolli computazionali consentono uno screening cristallografico efficiente per FBLD determinando le strutture e analizzando ~ 1.000 frammenti in modo molto efficiente, questa prioritizzazione è diventata meno essenziale nella ricerca basata sui raggi X. Per NMR, tuttavia, rimane auspicabile utilizzare esperimenti più economici e veloci per dare priorità allo screening della biblioteca e risparmiare tempo sugli strumenti su apparecchiature di fascia più alta. Allo stesso tempo, l'utilizzo di una combinazione di tecnologie essenzialmente diverse può fornire una conferma indipendente di eventi di legame, o anche ulteriori colpi che non vengono raccolti utilizzando solo la cristallografia o il metodo NMR. Le tecniche cristallografiche e NMR richiedono entrambe attrezzature molto costose e spesso possono essere eseguite solo in strutture esterne dedicate con l'aiuto di esperti locali altamente qualificati. Inoltre, la corretta analisi dei risultati richiede anche un'elevata competenza. Mentre programmi come iNEXT e iNEXT-Discovery stanno democratizzando l'accesso a tali strutture¹⁶, è stato riconosciuto che lo screening FBLD economico, veloce e ad alto rendimento con altri metodi può incoraggiare programmi di screening dei farmaci in una gamma molto più ampia di laboratori. Tali risultati possono quindi essere utilizzati come indicazione per costruire collaborazioni con chimici medicinali e per dare priorità agli esperimenti di screening più costosi ai composti più promettenti se le strutture NMR e cristallografiche impongono restrizioni sul numero di composti che possono essere sottoposti a screening.

La TSA forma un metodo biofisico rapido, efficiente e relativamente economico e accessibile¹⁷ che può essere utilizzato per lo screening FBLD. È stato utilizzato in più contesti, dall'aiutare a trovare condizioni proteiche stabili per gli studi^{di cristallizzazione 18}, alla ricerca di composti che si legano a bersagli specifici nelle cellule¹⁹. I TSA sono stati utilizzati anche per misurare le costanti di dissociazione per i ligandi che legano le proteine bersaglio, poiché il legame del ligando spesso porta ad alterazioni della stabilità termica. In tutti i TSA, il cambiamento della temperatura di denaturazione di una proteina (la sua stabilità) viene misurato in funzione di un lento aumento della temperatura. Un modo efficace per seguire la denaturazione delle proteine al momento del riscaldamento è il DSF o Thermofluor, che quantifica la tempra fluorescente di un colorante idrofobo (tipicamente Sypro Orange) all'interazione con regioni idrofobiche esposte di proteine che si dispiegano a causa dell'aumento della temperatura.

Nano-DSF si riferisce tipicamente alla misurazione della stabilità termica delle proteine in assenza di coloranti esterni. Uno dei primi strumenti che ha offerto questa possibilità è stato l'OPTIM1000 che misura un ampio spettro di intensità luminosa e la diffusione della luce di un campione. Questa macchina ha permesso la misurazione simultanea dello sviluppo proteico (tipicamente dopo la fluorescenza del triptofano) e dell'aggregazione proteica (poiché le nanoparticelle formate provocano un aumento della diffusione della luce a ~ 400 nm). Successivamente, il Prometeo introdusse l'uso della retroriflessione per misurare l'aggregazione e il rilevamento sensibile del segnale di fluorescenza, consentendo lo screening di basse concentrazioni proteiche con una buona sensibilità²⁰. La sezione seguente descrive come Prometheus è stato utilizzato per dimostrare un protocollo di screening dei frammenti per rilevare gli hit per diversi bersagli proteici. Una breve introduzione sulla qualità e la quantità di proteine previste è seguita da un protocollo passo-passo per preparare, eseguire e analizzare gli esperimenti di screening dei frammenti. I risultati dello screening per tre proteine sono stati mostrati come dati di esempio ottenuti nell'ambito delle collaborazioni iNEXT-Discovery.

Protocollo

NOTA: Le proteine utilizzate negli esperimenti nano-DSF dovrebbero essere pure (>95%) e omogenee come giudicato dall'elettroforesi su gel di dodecilsolfato-poliacrilammide di sodio. Prima di eseguire lo screening dei frammenti, la stabilità delle proteine deve essere determinata in varie condizioni tampone. Un basso buffer salinoico e basso contenuto di sale che interferisce minimamente con la proteina dovrebbe essere usato in modo da non influenzare la sua interazione diretta con i frammenti. I buffer tipicamente utilizzati in questo protocollo per il controllo della stabilità sono mostrati nella tabella supplementare S1. La concentrazione della proteina che deve essere utilizzata per questo esperimento come soluzione stock è in genere di 0,2 mg mL^-1. Per lo screening dell'intera libreria DSi-Poised (768 composti), è necessario un totale di ~ 12 ml di proteine di quella concentrazione, per un totale di ~ 2,5 mg. La libreria DSi-Poised utilizzata in questi esperimenti è stata fornita in formato a 96 pozzeli (Figura 1). La concentrazione dei frammenti è stata regolata a 100 mM nel 20% v/v dimetilsolfossido (DMSO). Va notato che il protocollo di miscelazione qui descritto si traduce in basse concentrazioni finali di DMSO dello 0,4% v/v; sebbene sia molto improbabile che ciò influisca sulla stabilità della proteina, l'effetto del DMSO deve essere controllato per ogni nuova proteina.

Figura 1: I tipi di piastre utilizzate per questi esperimenti. (A) Piastra con fondo a U. (B) Piastra a 96 pozzi. (C) Una vista ravvicinata della piastra a 96 pozzetti che mostra il sottovano 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione del piatto

1. Estrai una piastra di frammento dal congelatore a -20 °C/-80 °C e lasciala scongelare a temperatura ambiente, agitando delicatamente su uno shaker da banco. Centrifugare la piastra a 500 × g per 30 s per raccogliere eventuali gocce attaccate al lato dei pozzi.
   NOTA: Poiché la libreria di frammenti è disponibile disciolta in DMSO-d₆ (punto di fusione 19 °C), è essenziale assicurarsi che ogni composto sia completamente scongelato e solubilizzato.
2. Prendere una piastra di cristallizzazione MRC a 2 pozzetti(Figura 1A)e una pipetta da 14,7 μL della soluzione proteica in ciascun sotto-pozzetto. Per farlo in modo efficiente in termini di tempo, tenere la proteina in un serbatoio di reagenti (Tabella dei materiali) e utilizzare una pipetta multicanale per l'erogazione ( Figura2A,B).
   NOTA: per la libreria DSi-Poised, a seconda del formato, non tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti contengono composti. In genere, le righe A, H e le colonne 1, 12 sono riempite con DMSO. Pertanto, le righe A, H e le colonne 1, 12 non devono essere riempite di proteine, poiché questi pozzetto non conterranno alcun frammento alla fine del passaggio successivo; solo DMSO verrà trasferito lì dal robot. Si prega di notare che le righe e le colonne vuote differiscono in alcune piastre.

Figura 2: Schema della procedura di screening dei frammenti. (A) Utilizzo di una pipetta multicanale e di un serbatoio di reagenti per erogare la proteina. (B) Erogazione della proteina nella piastra a 96 pozzi. (C) Erogazione di frammenti da parte del robot dispenser. (D) Carico della proteina nei capillari. (E) Cassetto che mostra il supporto capillare. (F) Vista ravvicinata del supporto capillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Panoramica delle apparecchiature utilizzate in questi esperimenti. (A) Robot nanodispenser utilizzato per l'erogazione di frammenti. Sono indicate le posizioni delle piastre. (B) Interfaccia di programma per la definizione di una nuova piastra. (C) Interfaccia del programma di erogazione. (D) Il programma di erogazione utilizzato per erogare i frammenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Nano-erogazione di frammenti da parte del robot Mosquito

1. Controllare il tipo di lastra in cui vengono forniti i frammenti (Tabella dei materiali).
2. Controlla le definizioni di frammenti e piastre proteiche sulla zanzara.
   1. Accendere il nanodispenser (Figura 3A). Assicurarsi che non ci siano ostacoli intorno ai componenti in movimento.
   2. Aprire l'interfaccia utente grafica, cliccare sulla scheda Setup, e sotto Configurazione Deck, verificarese il tipo di piastra in cui vengono forniti i composti e quella in cui la proteina è stata trasferita nella sezione 1 sono già presenti nell'elenco delle piastre disponibili. In caso contrario, fare clic su Opzioni| Piastre e creare una nuova definizione di piastra compilando i valori corretti per il tipo di proprietà (Figura 3B).
      NOTA: Questi valori per la piastra MRC a 2 pozzi e la piastra a 96 pozzi utilizzata in questo esperimento sono mostrati rispettivamente nella Tabella supplementare S2 e nella Tabella supplementare S3.
3. Il programma di erogazione
   1. Nella scheda Setup (Setup), specificate le posizioni delle piastre in Configurazione deck.
      NOTA: La zanzara utilizzata in questo esperimento ha due posizioni di piastra sul ponte. La posizione 1 è definita come la piastra sorgentee la posizione 2 è la piastra di destinazione.
   2. Utilizzando il menu a discesa, scegliere la piastra inferiore Greiner U per la posizione 1 e la piastra MRC 2-pozzetti per la posizione 2 (Figura 2C). Salvare il protocollo.
4. Erogazione frammenti
   1. Posizionare la piastra di frammento in posizione 1 e la piastra proteica in posizione 2 del ponte (Figura 3A).
   2. Nella scheda Protocollo (Figura 3D), fare clic su File e scegliere il protocollo salvato nella sezione 2.3 per l'erogazione dei frammenti. Definire il volume dei frammenti da erogare; utilizzare 0,3 μL. Per una piastra tipica, in cui le colonne 1 e 12 non contengono frammenti, definire la posizione iniziale alla colonna 2 e la posizione finale alla colonna 11. In alcune piastre, se le colonne 2 o 11 sono vuote, utilizzare rispettivamente le colonne 3 e 10 come valori iniziali e finali.
      NOTA: a causa della configurazione Mosquito, è possibile saltare solo le colonne, non le righe; per le file, la zanzara pipetterà DMSO. Assicurarsi che l'opzione Cambio punta sia selezionata come Sempre, in modo da non contaminare in modo incrociato la libreria di frammenti.
   3. Fare clic su Esegui per avviare il programma. Dopo aver completato l'erogazione, che richiede ~ 2 minuti, rimuovere le piastre proteiche e frammentarie dal robot e sigillarle con un film sigillante adesivo. Centrifugare brevemente la piastra proteica (500 × g,30 s) per raccogliere eventuali gocce attaccate ai lati dei pozzi prima di procedere alla fase successiva.

3. Misurazione di nano-DSF

NOTA: una descrizione dettagliata sull'esecuzione di TSA utilizzando Prometheus NT.48 è stata pubblicata in precedenza²⁰. Qui vengono menzionati punti importanti nel contesto dello screening dei frammenti.

1. Ispezione delle piastre prima della misurazione
   1. Ispezionare visivamente i pozzetti della piastra proteica per le precipitazioni che potrebbero essersi verificate a causa dell'aggiunta dei frammenti. Se si osserva la precipitazione in molti pozzi, ridurre la concentrazione dei frammenti e ripetere l'esperimento.
      NOTA: Si consiglia di mantenere la piastra proteica a temperatura ambiente; i frammenti tendono a diventare insolubili a temperature più basse.
2. Preparazione del Prometeo
   1. Accendere lo strumento Prometheus. Sul touchscreen, premere Apri cassetto per accedere al modulo di caricamento capillare dello strumento. Rimuovere la striscia magnetica dal modulo di carico e pulire lo specchio con etanolo per rimuovere eventuali particelle di polvere.
3. Trasferimento dalla piastra dei frammenti proteici ai capillari
   NOTA: Questa fase prevede il trasferimento del campione misto proteina/frammento da ciascun pozzo nella piastra proteica ai capillari per l'uso con il Prometeo. Per questo, sebbene venga tipicamente utilizzato il tipo capillare standard, è possibile utilizzare i capillari ad alta sensibilità per concentrazioni proteiche molto basse.
   1. Posizionare la piastra proteica e i capillari accanto allo strumento per avere un facile accesso al modulo di carico capillare.
   2. Prendi un capillare, tienilo a un'estremità e tocca la soluzione nella piastra proteica con l'estremità del capillare per trasferire il campione per azione capillare. Indossare sempre i guanti e assicurarsi di non toccare il capillare nel mezzo, poiché le impurità(ad esempioparticelle di polvere) dei guanti influenzerebbero la misurazione.
   3. Posizionare il capillare nella posizione designata del supporto, assicurandosi che sia correttamente allineato e centrato.
   4. Ripetere i passaggi 3.3.2 e 3.3.3, riempiendo così tutte le posizioni nel modulo di carico. Carica tutti i capillari di cui avrai bisogno per la misurazione.
      NOTA: per una singola corsa, è possibile caricare un massimo di 48 capillari.
   5. Alla fine, posiziona la striscia magnetica sopra i capillari per tenerli in posizione e premi Chiudi cassetto per iniziare l'esperimento.
4. Eseguire l'esperimento nano-DSF
   1. Scansione a fluorescenza
      1. Aprire l'applicazione Prometheus PR. ThermControl, e creare un nuovo progetto facendo clic su Avvia nuova sessione utilizzando il nome ProteinName_ScreenName_PlateNumber. Innanzitutto, esegui una scansione di scoperta per rilevare la fluorescenza dei campioni.
         NOTA: i livelli di fluorescenza dovrebbero idealmente essere superiori a 3.000 conteggi per ciascun campione. I campioni con fluorescenza superiore al limite di saturazione dello strumento (20.000 conteggi) non saranno misurati.
      2. Alterare il segnale di fluorescenza dei campioni regolando la potenza di eccitazione del laser (Figura 4).
   2. Denaturazione termica
      1. Fare clic sulla scheda Scansione di fusione. Per eseguire l'esperimento, impostare la temperatura iniziale su 20 °C, la temperatura finale su 95 °C e la pendenza della temperatura su 1 °C min^-1. Fare clic su Avvia misurazione.
   3. Annotazione dell'esperimento
      1. Dopo l'avvio degli esperimenti, fai clic sulla scheda Annotazione e risultati. Annota ogni capillare dandogli un numero unico di piastra e pozzo.
         NOTA: Ad esempio, capillare 1B2 corrisponderebbe alla Piastra 1 e al pozzo B2. In questa scheda, è possibile aggiungere colonne extra per l'esperimento, ad esempionome della proteina, buffer, concentrazione di proteine. Al termine dell'esperimento, anche i risultati vengono visualizzati in questa scheda. Questo è un buon momento per fermarsi alla fine della giornata; gli esperimenti si svolgono durante la notte, i risultati possono essere raccolti il giorno successivo.
   4. Visualizzazione ed esportazione dei dati
      1. Al termine dell'esperimento, fare clic sulla scheda Scansione fusione per visualizzare le curve di fusione e dispersione per i campioni. Per esportare i risultati in un foglio di calcolo, fare clic sulla scheda Scansione di fusione, fare clic su Esportae scegliere Esporta dati elaborati dal menu a discesa.

Figura 4: Regolazione della potenza di eccitazione e del segnale di fluorescenza. ( A ) Conunapotenza di eccitazione dell'80%, il segnale di fluorescenza per la maggior parte dei campioni è oltre il limite di saturazione. (B) Il segnale di fluorescenza viene ridotto a livelli misurabili diminuendo il potere di eccitazione al 60%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Iterazione

1. Ripetere i passaggi da 1 a 3 per eseguire 16 esecuzioni sull'intera libreria Enamine di 768 composti (16 × 48 = 768).
2. Poiché la misurazione di ciascuna piastra richiede ~ 1,5 ore per essere completata, completare l'annotazione (3.4.3) e preparare la successiva piastra di frammenti proteici ripetendo i passaggi nelle sezioni 1 e 2.
   NOTA: In una tipica giornata lavorativa, è possibile misurare 4-6 piastre, a seconda dell'esperienza. Lo screening dell'intera libreria DSi può essere completato in un totale di 3-4 giorni.

5. Analisi dei dati

1. Esame dei dati generati
   1. Una volta completata ogni esecuzione, fare clic sulla scheda Annotazioni e risultati per visualizzare i risultati. Per ogni campione, concentrarsi su due valori calcolati che sono più importanti in questa panoramica: 1) La temperatura di inizio dello scattering (Onset #1 for Scattering), che indica la temperatura all'inizio di eventi di scattering del campione aumentati ed è caratteristica dell'aggregazione; 2) il valore T_m (Inflection Point #1 for Ratio) estratto dal rapporto tra eventi di fluorescenza a valori di 330 e 350 nm che tipicamente corrispondono ai cambiamenti massimi della fluorescenza del triptofano in caso di cambiamenti nel suo ambiente.
   2. Assicurarsi di controllare la dispersione e le curve di fusione per ciascun capillare nella scheda Scansione fusione per assicurarsi che questi valori siano affidabili.
2. Esportazione e ispezione in un foglio di calcolo
   1. Esportare i dati da tutte le diverse tirature per l'ispezione in un software per fogli di calcolo, come descritto al punto 3.4.4, e per creare tabelle e grafici panoramici. Fare clic sui vari fogli nel file del foglio di calcolo per annotare le informazioni in ciascun foglio.
      1. Nel foglio Panoramica, si noti che ogni riga corrisponde a un esperimento. Lungo una panoramica dei parametri(ad esempio,temperatura iniziale e finale), osservare i valori calcolati per il T_m e l'inizio dello scattering (vedere 5.1 sopra per nomi e spiegazioni, e i file supplementari 1 e 2 per un esempio). Mentre il software calcola due o più valori T_m (punto di inflessione #1 e #2 per Ratio) per alcuni campioni, esaminare la curva di transizione di fusione per determinare quale dei valori T_m è corretto.
      2. Nel foglio Rapporto, si noti che ogni colonna corrisponde a un campione e ogni riga ai dati letti a ogni passo di temperatura. Osservare i valori di conteggio della fluorescenza corrispondenti a ciascuna fase della temperatura e utilizzarli per tracciare le curve di fusione per campioni specifici, tracciando la colonna della temperatura rispetto alla colonna del conteggio della fluorescenza. Si noti che i dati nel Rapporto (derivata prima), 330 nm, 330 nm (derivata prima), 350 nm, 350 nm (derivata prima) vengono utilizzati per calcolare il rapporto e la sua derivata prima (che ha un massimo al tasso massimo di variazione) in un formato simile.
      3. Osservare dati simili per lo scattering nel foglio Scattering. Generare la curva di scattering per ogni campione tracciando la colonna di temperatura rispetto alla colonna di scattering. Cercate il foglio per la derivata prima di scattering.
3. Creazione e convalida di una panoramica globale per tutti i frammenti
   1. Dopo aver verificato i valori T_m corretti per i frammenti, combinare le colonne ID campione e Punto di inflessione del rapporto 330/350 nm (T_m) da tutte le esecuzioni in un unico nuovo file di risultati, copiando queste colonne da ogni esecuzione.
   2. Utilizzare il valore medio T_m della proteina nativa (tipicamente calcolato su dieci run) e sottrarlo dai valori T_m di ciascun campione, per ottenere il ΔT_m. Ordinare i risultati su ΔT_m in ordine decrescente per identificare i campioni che generano lo spostamento più grande.
   3. Dividere i frammenti in contenitori a seconda dello spostamento ΔT_m e generare una tabella di frequenza per l'intera libreria tracciando il ΔT_m per ciascun contenitore rispetto al numero di frammenti (Figura 5). Per comodità, mostrate l'asse che rappresenta il numero di frammenti nella scala del registro. Raccogli il campione con ΔT_m ±1 e adatta gli altri contenitori a ciascuna corsa per regolare empiricamente il numero di valori anomali.

Risultati

Uno schermo intero della libreria DSi-Poised (768 frammenti) è stato eseguito su tre proteine di interesse medico, vale a dire, la proteina kinetochore esterna Highly Expressed in Cancer 1 (Hec1, o Ndc80), il dominio regolatore della ripetizione tetraricopeptide (TPR) della chinasi monopolare del fuso 1 (Mps1) e la proteasi simile a SARS-CoV-2 3C, Nsp5, che si stacca dal C-terminus della poliproteina replicasi in 11 siti. Le condizioni tampone scelte per ciascuna proteina, così come la concentrazione proteica e T_m delle proteine, sono mostrate nella Tabella supplementare S4.

Figura 5: Distribuzione in frequenza dello spostamento della temperatura di fusione (ΔT_m) per le tre proteine, Hec1, Mps1 e Nsp5, presentate in questo studio come risultati rappresentativi. Abbreviazioni: Hec1 = Altamente espresso nella proteina Cancer 1; Mps1 = chinasi monopolare del fuso 1; Nsp5 = proteasi simile a SARS-CoV-2 3C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I risultati delle tre proiezioni utilizzando il protocollo sopra descritto, visualizzati come la distribuzione in frequenza della variazione di T_m rispetto al numero di frammenti, sono mostrati nella Figura 5. Questi grafici sono stati generati come descritto nella sezione 5.3 del protocollo, tracciando la frequenza della variazione osservata in T_m. Il significato del cambiamento deve essere definito in modo soggettivo per ogni diverso progetto, come descritto nella sezione di discussione seguente. Valori negativi indicano una riduzione della temperatura di fusione in presenza di un frammento, un valore positivo un aumento di T_m. Da tali trame, è facile osservare che per Nsp5, tutti i frammenti hanno un effetto destabilizzante, mentre per Hec1 e Mps1 si osservano sia colpi stabilizzanti che destabilizzanti. Questo può essere previsto e sarà discusso.

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo di throughput medio-alto per lo screening di librerie di frammenti utilizzando alcuni strumenti di robotica e misurazione comuni. Schermate come quelle descritte in questo protocollo possono essere eseguite di routine dalla NKI Protein Facility di Amsterdam, ad esempio come servizio iNEXT-Discovery, spesso anche gratuitamente per gli utenti dopo l'applicazione della proposta e la revisione tra pari. In questi casi, la libreria DSi-Poised può essere fornita dalla struttura, ma l'uso di altre librerie può anche essere discusso nel contesto di ogni diversa applicazione utente e contratto di servizio. La scelta degli strumenti in questo protocollo rappresenta soluzioni pratiche per molti laboratori, ma non deve essere considerata come un gold standard. Per misurare la stabilità termica della proteina bersaglio per lo screening dei frammenti sono raccomandati metodi privi di etichette per misurare la stabilità termica della proteina bersaglio, piuttosto che metodi che utilizzano etichette sensibili all'ambiente per rilevare lo svolgimento in un termociclatore a reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa.

I metodi senza etichetta, come quello qui presentato con lo strumento Prometheus, hanno alcuni vantaggi: usano basse quantità di proteine, spesso un paio di ordini di grandezza in meno; possono essere utilizzati per misurare simultaneamente lo scattering del campione e quindi l'aggregazione; e le etichette utilizzate per rilevare lo svolgimento in altri approcci possono interagire in modo diverso con ciascun frammento, con conseguenti artefatti di misurazione. Questo protocollo è stato descritto nel contesto del robot Mosquito, che consente il pipettaggio di un volume molto piccolo di campione (0,3 μL) che non può essere fatto manualmente. Il Mosquito è un robot popolare, presente in molti laboratori che lavorano su progetti di biologia strutturale e scoperta di farmaci; tuttavia, il protocollo può chiaramente utilizzare approcci alternativi per il pipettaggio a basso volume.

Le librerie di frammenti contengono composti disciolti in DMSO. Una delle sfide iniziali è trovare la concentrazione ottimale di DMSO alla quale la proteina rimane stabile e i composti rimangono solubili. Ciò comporta l'esecuzione delle misurazioni a varie concentrazioni di DMSO per determinare le condizioni ottimali per lo screening. La diluizione da proteina a frammento qui utilizzata si traduce in concentrazioni di DMSO dello 0,2%; la maggior parte delle proteine sono abbastanza stabili in queste condizioni. La quantità di proteine necessaria per effettuare lo screening per la libreria di 768 composti è di ~ 2-3 mg in totale, poiché le misurazioni vengono in genere eseguite a basse concentrazioni proteiche (0,2 mg mL^-1). Lavorare con concentrazioni proteiche relativamente basse non solo riduce i costi di produzione delle proteine, ma riduce anche le possibilità di precipitazione delle proteine. La bassa concentrazione proteica non influisce sul rilevamento del legame dei frammenti, poiché la concentrazione dei frammenti nell'esperimento è di ~ 2 mM, consentendo di identificare anche i leganti deboli.

Poiché il rilevamento della transizione di fusione in questi esperimenti si basa sull'intensità della fluorescenza, un aspetto critico è determinare il potere di eccitazione del laser a cui effettuare le misurazioni. L'interazione dei composti con la proteina può (i) non avere alcun effetto sulla sua fluorescenza intrinseca, (ii) provocare la tempra o (iii) aumentare la sua fluorescenza intrinseca. Inoltre, lavorare con basse concentrazioni proteiche significa che il conteggio di fluorescenza per la proteina nativa sarebbe basso. Il potere di eccitazione deve quindi essere regolato in modo tale da poter misurare la maggior parte dei campioni. Il profilo di scattering di ogni esecuzione fornisce informazioni importanti sugli effetti di aggregazione che potrebbero essere attivati dall'aggiunta di qualsiasi frammento. Inoltre, l'effetto della temperatura sulla solubilità del composto può essere visto anche sul profilo di scattering.

Inaspettatamente, per molti composti è stato osservato che lo scattering in realtà diminuiva con l'aumentare della temperatura (Figura 6). È quindi importante esaminare sia la curva di transizione di fusione che il profilo di scattering di accompagnamento per decidere l'affidabilità di ciascun esperimento, specialmente per quei frammenti che sono considerati candidati per misurazioni più impegnative mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR, o addirittura considerati come hit per la chimica di follow-up. Una limitazione specifica del metodo ai fini dello screening dei frammenti è che molti frammenti nella libreria DSi-Poised hanno una fluorescenza intrinseca significativa, a volte anche oltre il limite di saturazione del rivelatore, e quindi questi non possono essere adeguatamente sottoposti a screening per il legame target anche a basso potere di eccitazione. Un altro punto da notare per questo metodo è che può essere utilizzato solo con proteine contenenti residui di triptofano.

Figura 6: Effetto della temperatura sulla solubilità del composto. Curva di transizione di fusione e profilo di scattering di Hec1 con due composti diversi. (A) Il profilo di dispersione mostra che per questo campione la solubilità non è influenzata dalla temperatura. (B) Il profilo di dispersione mostra che la solubilità di questo campione aumenta con l'aumentare della temperatura. La curva di transizione di fusione in questo caso non è quindi affidabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Una domanda aperta è cosa dovrebbe essere considerato come un cambiamento significativo in T_m, non da una prospettiva matematica, ma dal punto di vista pratico: quale cambiamento in T_m è importante considerare come indicativo del legame di un ligando a una proteina? In questi esempi, si vedono spostamenti inferiori a 1 °C per il 74% dei frammenti per legare Hec1, il 66% per Mps1 e il 53% per Nsp5. Considerare 1 °C come "cambiamento significativo" difficilmente fornirebbe risultati degni di essere perseguiti dalla chimica di follow-up. Nei grafici di panoramica (Figura 5), sono stati considerati contenitori di 1, 2, 5 o più di 5 gradi di spostamento T_m, sia positivi che negativi. Ciò richiede modifiche in base a ciascun caso specifico per fornire una buona panoramica e consentire un processo decisionale informato, determinando il passo successivo. In particolare, per alcune proteine, sono state osservate sia la stabilizzazione che la destabilizzazione del bersaglio a seconda dei frammenti considerati. Entrambi gli eventi sono interessanti, in quanto entrambi possono essere il risultato del legame dei frammenti, ed entrambi possono portare a una buona molecola di follow-up per manipolare il comportamento delle proteine.

Rimane un'ultima domanda, vale a dire, "cosa definisce un colpo utile?". In realtà, la risposta dipende dalla situazione specifica. Ad esempio, per Hec1, tutti i frammenti che stabilizzano la proteina di oltre 2 gradi o la destabilizzano di più di 5 sono stati comunicati ai nostri collaboratori di chimica, che hanno progettato nuove molecole basate su questi colpi. Per Nsp5, tuttavia, i colpi più destabilizzanti sono stati comunicati ai nostri collaboratori NMR per confermare i colpi derivati dal nanoDSF con esperimenti NMR. In altre parole, i risultati dello screening ottenuti da questo protocollo dovrebbero essere analizzati con cautela e in modo dipendente dal contesto, prendendo decisioni informate basate sulla domanda specifica e sulla metodologia circostante. In ogni caso, il metodo qui descritto è un approccio complementare alle metodologie esistenti come lo screening a raggi X e nmR, che può mirare a confermare, dare priorità o dare nuove idee per le campagne di chimica.

Tabella supplementare S1: Elenco dei tamponi utilizzati per lo screening delle proteine. Abbreviazioni: HEPES = acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico; DTT = ditiotritolo; MOBS = acido 4-(N-morfolino)butanisolfonico. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S2: Proprietà per la piastra MRC a 2 pozzi per l'uso con robot nanodispenser. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S3: Proprietà per piastra con fondo a V a 96 pozzi per l'uso con robot nanodispenser. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare S4: Il tampone, la concentrazione proteica ela T_m delle proteine discusse nei risultati rappresentativi. Abbreviazioni: DTT = ditiotritolo; Hec1 = Altamente espresso nella proteina Cancer 1; Mps1 = chinasi monopolare del fuso 1; Nsp5 = proteasi simile a SARS-CoV-2 3C. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: Parametri di panoramica-datidi esempio. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: valori T_m e ΔT_m per 406 frammenti-dati di esempio. Fare clic qui per scaricare questo file.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ClearVue Sheets	Molecular Dimensions		pellicola sigillante adesiva per piastra proteica
Nastro sigillante in alluminio CORNING 6570 Pellicola sigillante	CORNING		per piastra di frammenti
Libreria di poised DSi Libreria di	Enamine		contenente 768 composti utilizzati in questo studio
Elisa Reagent Reservior	ThermoFisher Scientific	15075	Riserva di reagenti utilizzata per il pipettaggio delle proteine
	di fondo rotonde (U)	di Greiner Cat. No. 650201	Frammenti forniti in queste piastre
Mosquito type X1	sptlabtech	Codice 3019-0003	Dispenser di nanolitri
	cristallizzazione a 2 pozzetti	MRC96T-PS
Serbatoi di reagenti ELISA Pierce
Prometheus Capillari ad alta sensibilità	Catalogo PR-C006
Prometheus NT.48 nanoDSF	Nanotemper	Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO)	nanoDSF e light back scattering
Prometheus Standard tipo capillare	Catalog PR-C002
TX-1000	Centrifuga termoscientifica	per piastre