Summary
SAMHD1 er en deoxynukleosidtrifosfattriphosphohydrolase med kritiske roller i menneskers sundhed og sygdom. Her præsenterer vi et alsidigt enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay, implementeret i et 384-brønds mikropladeformat, der muliggør evaluering af små molekyler og nukleotidanaloger som SAMHD1-substrater, aktivatorer og hæmmere.
Abstract
Sterilt alfamotiv og HS-domæneholdigt protein 1 (SAMHD1) er en central regulator af intracellulære deoxynukleosidtrifosfatpuljer (dNTP), da dette enzym kan hydrolysere dNTP'er til deres tilsvarende nukleosider og uorganiske trifosfater. På grund af dets kritiske rolle i nukleotidmetabolisme, dets tilknytning til flere patologier og dets rolle i terapiresistens udføres der i øjeblikket intens forskning for en bedre forståelse af både reguleringen og den cellulære funktion af dette enzym. Af denne grund er udvikling af enkle og billige metoder med høj kapacitet til at undersøge små molekylers interaktion med SAMHD1, såsom allosteriske regulatorer, substrater eller hæmmere, afgørende. Til dette formål er det enzymkoblede malachitgrønne assay et simpelt og robust kolorimetrisk assay, der kan implementeres i et 384-mikrobrøndpladeformat, der muliggør indirekte måling af SAMHD1-aktivitet. Da SAMHD1 frigiver triphosphatgruppen fra nukleotidsubstrater, kan vi koble en pyrophosphataseaktivitet til denne reaktion og derved producere uorganisk phosphat, som kan kvantificeres af det malachitgrønne reagens gennem dannelsen af et phosphomolybdatmalachitgrønt kompleks. Her viser vi anvendelsen af denne metode til at karakterisere kendte hæmmere af SAMHD1 og til at dechiffrere mekanismerne involveret i SAMHD1-katalyse af ikke-kanoniske substrater og regulering af allosteriske aktivatorer, eksemplificeret ved nukleosidbaserede kræftlægemidler. Således er det enzymkoblede malachitgrønne assay et kraftfuldt værktøj til at studere SAMHD1 og kan desuden også bruges i undersøgelsen af flere enzymer, der frigiver fosfatarter.
Introduction
Sterilt alfa-motiv og histidin-aspartatdomæneholdigt protein 1 (SAMHD1) er en central regulator af nukleotidhomeostase i pattedyrceller1 med mange roller i menneskers sundhed og sygdom2. Dette enzym er i stand til at hydrolysere deoxynukleosidtrifosfater (dNTP'er) til deres beslægtede deoxynukleosid- og uorganiske triphosphatmolekyler 3,4, idet denne aktivitet reguleres allosterisk af (d)NTP-overflod (gennemgået i reference5). Hver SAMHD1-monomer indeholder to allosteriske steder (AS1 og AS2) og et katalytisk sted, og dannelsen af det aktive enzym kræver den ordnede samling af en homotetramer ved (d) NTP-binding. Dimerisering af SAMHD1-monomerer udløses først gennem binding af et guanintrifosfat (GTP eller dGTP) til AS1, og efterfølgende tetramerisering opnås, når et yderligere dNTP-molekyle binder til AS2, hvilket muliggør substratadgang til det katalytiske sted og efterfølgende hydrolyse.
SAMHD1-substrater indbefatter de fire kanoniske dNTP'er 3,4 sammen med nogle base- og sukkermodificerede nukleotider, herunder triphosphatmetabolitterne fra flere nukleosidbaserede lægemidler, der anvendes til behandling af virusinfektioner og kræft, hvoraf flere også kan tjene som allosteriske aktivatorer 6,7,8,9,10,11. Som følge heraf modulerer SAMHD1 effekten af mange af disse forbindelser i sygdomsmodeller 7,8,9,10,11,12,13,14,15, og desuden dikterer det i tilfælde af deoxycytidinanalogen cytarabin (ara-C), som har været standardbehandling for akut myeloid leukæmi (AML) i årtier Behandlingseffekt ved denne sygdom 7,8,16. SAMHD1 er således en potentiel biomarkør og terapeutisk målsætning for at forbedre effekten af nukleosidbaserede terapier17, og derfor har vi og andre søgt at identificere strategier til at inaktivere SAMHD1 i celler. Vi foreslog brugen af viralt protein X (Vpx) som en biologisk hæmmer til at målrette SAMHD1 til nedbrydning inde i kræftceller7, men denne tilgang har en række begrænsninger (diskuteret i reference12), og vi rapporterede også for nylig en indirekte tilgang til at undertrykke SAMHD1-aktivitet via hæmning af ribonukleotidreduktase, som vi demonstrerede i forskellige modeller af AML18. En række undersøgelser har søgt at identificere små molekyler, der er i stand til direkte at hæmme SAMHD1, og til dato er flere sådanne molekyler blevet rapporteret, dog kun dokumenteret hæmning in vitro 6,9,19,20,21,22. Som følge heraf understreger manglen på små molekyler, der kraftigt hæmmer SAMHD1-aktivitet i celler kombineret med de komplekse mekanismer for SAMHD1-katalyse af nukleosidbaserede terapi, behovet for yderligere undersøgelse. Således robuste og ideelt high-throughput amable metoder til sondering af små molekylers interaktion med SAMHD1 er ideelle til at identificere substrater, allosteriske regulatorer og hæmmere af dette klinisk relevante enzym.
Flere metoder er tilgængelige, der direkte måler dNTPase-aktiviteten af SAMHD1, såsom tyndtlagskromatografi (TLC)9,20,23 og højtydende væskekromatografi (HPLC)9,21, men disse er ikke let modtagelige for opsætninger med høj kapacitet. En undtagelse er analysen rapporteret af Mauney et al., som udnytter SAMHD1's evne til at hydrolysere bis (4-nitrophenyl) phosphat (b4NPP) til p-nitrophenol og p-nitrophenylphosphat, når Mn2+ anvendes som aktiverende kation, hvilket resulterer i en kolorimetrisk ændring, der let kan måles i en mikrobrøndplade21. Dette assay er med succes blevet anvendt til identifikation og karakterisering af SAMHD1-hæmmere, men det skal bemærkes, at hydrolyse forekommer i fravær af (d) NTP-aktivatorer og i nærvær af en sandsynlig ikke-fysiologisk aktiverende kation, begge er vigtige forbehold at overveje. Dette gør også dette assay mindre anvendeligt til undersøgelse og identifikation af allosteriske regulatorer af SAMHD1.
I denne sammenhæng kan en enzymkoblet tilgang kombineret med det malachitgrønne reagens, som beskrevet i denne rapport, være en alsidig metode til indirekte at måle dNTPase-aktiviteten af SAMHD1 og desuden forhøre virkningen af forskellige små molekyler på den. Malachitgrøn analyse er en robust og pålidelig kolorimetrisk teknik til påvisning af frit uorganisk fosfat (Pi) baseret på dannelsen af et molybdophosphorsyrekompleks, der fører til en kolorimetrisk ændring målt ved 620 nm24. Da SAMHD1-hydrolyse frigiver triphosphatgruppen fra nukleotidsubstrater, er det således nødvendigt at koble denne reaktion med en (pyro)phosphataseaktivitet, som vil generere frit uorganisk phosphat, før tilsætning af det malachitgrønne reagens. Den malachitgrønne analyse er følsom og omkostningseffektiv og har været meget udbredt til identifikation og karakterisering af inhibitorer og substrater for enzymer, der frigiver uorganiske phosphatgrupper enten i deres reaktioner eller i nærvær af et koblingsenzym. Det er blevet anvendt i vid udstrækning til karakterisering af ATPase-aktiviteterne af helicases25,26,27 eller undersøgelsen af CD73 enzymatisk aktivitet, som medierer nedbrydningen af AMP til adenosin og uorganisk phosphat28. Derudover er det, når det er koblet, blevet anvendt til opdagelsen af antibiotika rettet mod UDP-2,3-diacylglucosaminpyrophosphatase LpxH, et essentielt enzym i de fleste gramnegative patogener29. Med hensyn til kræftforskning er den enzymkoblede tilgang blevet anvendt i vid udstrækning mod NUDIX-hydrolaserne, en familie af nukleotidmetaboliserende enzymer, både i karakteriseringen af substrater 30,31,32 og i identifikation og udvikling af lægemidler og kemiske sonder 33,34,35,36.
Med hensyn til dNTPase SAMHD1 er denne tilgang blevet brugt i flere rapporter. Ved anvendelse af exopolyphosphatase Ppx1 fra Saccharomyces cerevisiae som koblingsenzym blev dette assay anvendt til at teste flere nukleotidanaloger som enten substrater, aktivatorer eller hæmmere af SAMHD1 og resulterede i identifikation af triphosphatmetabolitten af det antileukæmiske lægemiddel clofarabin som aktivator og substrat6. Derudover er det med uorganisk pyrophosphatase fra Escherichia coli som koblingsenzym blevet anvendt til screening af et bibliotek af klinisk godkendte forbindelser mod SAMHD1 for at identificere hæmmere20. I vores forskning brugte vi denne tilgang til at vise, at ara-CTP, den aktive metabolit af ara-C, er et SAMHD1-substrat, men ikke allosterisk aktivator7 og brugte efterfølgende dette assay til at vise, at flere små molekyler, der kunne sensibilisere AML-modeller til ara-C på en SAMHD1-afhængig måde, faktisk ikke direkte hæmmede SAMHD118. I denne rapport vil vi detaljere denne alsidige metode og demonstrere dens anvendelighed i en high-throughput modtagelig opsætning til identifikation af hæmmere, aktivatorer og substrater af SAMHD1.
Protocol
En skematisk oversigt over metoderne nedenfor er afbildet i figur 1 , og en detaljeret liste over materialer og reagenser findes i materialetabellen.
1. Fremstilling af assaybuffere.
- Forberedelse af lagerbuffere.
BEMÆRK: Da analysen er følsom over for påvisning af fosfater, hvilket kan være almindeligt, skylles glasvarer tre gange med ultrarent eller dobbeltdestilleret vand for at undgå forurening. Alle buffere kan opbevares ved stuetemperatur (RT).- Der fremstilles 1 liter SAMHD1-reaktionsbufferopløsning (RB) (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) ved opløsning af 4,5 g Trisacetat, 2,3 g NaCl og 0,2 g MgCl2 i ca. 800 mlvand, før der justeres til pH 8 og slutvolumen.
- Forbered 5 ml 0,1 M TCEP-stamopløsning ved at fortynde 1 ml 0,5 M TCEP til 4 ml vand.
- Forbered 50 ml 11% Tween-20 stamopløsning ved at fortynde 5 ml 100% Tween-20 til 44,5 ml vand.
BEMÆRK: Tween-20 er lysfølsom. - Forbered 50 ml 0,5 M EDTA-stopopløsning ved at opløse 9,3 g EDTA i ca. 40 ml vand, før den justeres til pH 8 og slutvolumen.
- Forbered Malachit Green (MG) stamopløsning (3,2 mM malachitgrøn i H2SO4) ved langsomt at tilsætte 60 ml koncentreret svovlsyre til 300 ml vand i en brun glasflaske. Opløsningen afkøles til RT og opløses 0,44 g malachitgrøn.
FORSIGTIGHED: Reaktionen af svovlsyre med vand er eksoterm, og flasken kan derfor varme op og forårsage opbygning af tryk; Sørg for, at dette tryk frigives ofte.
BEMÆRK: Den resulterende orange opløsning er lysfølsom (derfor brun flaske) og stabil i mindst 1 år ved RT. Der kan dannes bundfald over tid, idet det sikres, at kun supernatanten anvendes. - Forbered 50 ml 7% ammoniummolybdatstamopløsning ved at opløse 3,75 g ammoniummolybdat i 50 ml vand.
BEMÆRK: Der kan dannes bundfald over tid, og sørg for, at kun supernatanten anvendes.
- Fremstilling af komplette assaybuffere
BEMÆRK: Dette skal gøres på forsøgsdagen- Forbered komplet SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20). Brug tidligere fremstillede 11 % Tween-20- og 0,1 M TCEP-lagre til at tilføje disse komponenter i en slutkoncentration på 0,005 % for Tween-20 og 0,3 mM for TCEP til SAMHD1 RB-bestanden.
- Forbered EDTA-stopopløsning (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005% Tween-20, 7,9 mM EDTA). For at fuldføre SAMHD1 RB skal du bruge 0,5 M EDTA-stamopløsning til at tilføje EDTA til en slutkoncentration på 7,9 mM.
- Forbered MG-arbejdsløsning (2,5 mM malachitgrøn, 1,4% ammoniummolybdat, 0,18% Tween-20) ved at blande 10 dele MG-stamopløsning med 2,5 dele 7% ammoniummolybdat og 0,2 dele 11% Tween-20.
2. SAMHD1-hæmningsassay og bestemmelse af forbindelse IC50
BEMÆRK: De endelige analysebetingelser er vist i tabel 1.
- Fremstilling af forbindelser i analyseplade
BEMÆRK: Små molekylvægtforbindelser opløses typisk i 100% DMSO- og nukleotidanaloger i vand. Stamkoncentrationen varierer fra 10 til 100 mM og påvirkes af forbindelsernes styrke og opløselighed sammen med analysens DMSO-tolerance. Kontroller, at den endelige DMSO-koncentration i reaktionen ikke overstiger 1% for at sikre, at enzymaktiviteter ikke påvirkes af dette opløsningsmiddel. Det er god praksis at teste analysens tolerance over for opløsningsmidlet før forsøget.- Der fremstilles serielt fortyndede teststoffer ved 100x slutkoncentrationen i det relevante opløsningsmiddel (f.eks. 100 % DMSO for små molekyler eller vand for nukleotidanaloger) i en klar rundbundet polypropylenplade med 96 brønde enten ved hjælp af en multikanalpipette eller automatiseret væskehåndteringsudstyr.
BEMÆRK: Afhængigt af forbindelsens stabilitet kan fortyndingspladerne forberedes på forhånd, forsegles og opbevares ved -20 °C. Lad pladerne ekvilibrere til RT, før protokollen fortsættes. - Ved hjælp af komplet SAMHD1 RB fortyndes forbindelser til 25x slutkoncentrationen (for at holde den endelige opløsningsmiddelkoncentration under 1%) og overføres 5 μL til de relevante huller i en klar 384-brønds fladbundet analyseplade. Proceduren gentages med kontrolprøver, der kun indeholder opløsningsmidler.
- Der fremstilles serielt fortyndede teststoffer ved 100x slutkoncentrationen i det relevante opløsningsmiddel (f.eks. 100 % DMSO for små molekyler eller vand for nukleotidanaloger) i en klar rundbundet polypropylenplade med 96 brønde enten ved hjælp af en multikanalpipette eller automatiseret væskehåndteringsudstyr.
- Fremstilling af reaktionskomponenter
BEMÆRK: Dette skal gøres på dagen for analysen. Rekombinante humane SAMHD1- og E. coli-pyrophosphatasealikvoter (PPase) opbevares langtidsved -80 °C fortyndet ved henholdsvis 9,1 mg/ml og 23,0 mg/ml i opbevaringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM TCEP). Når alikvoterne er optøet, opbevares de kortvarigt ved -20 °C.- Forbered enzym (SAMHD1/PPase) masterblanding ved at fortynde rekombinant humant SAMHD1-protein og rekombinant PPase i komplet SAMHD1 RB til 4x ønsket slutkoncentration, dvs. 1,4 μM SAMHD1 og 50 E / ml PPase.
- Forbered aktivator/substrat dGTP ved at fortynde dGTP-materiale (typisk 10 eller 100 mM i vand) i komplet SAMHD1 RB til 2x endelig koncentration, dvs. 50 μM dGTP.
- Udfør analysen
BEMÆRK: Alle analysekomponenter skal ekvilibreres til RT. Væsketilsætninger kan udføres med enten en multikanalpipette eller en flydende dispenser til bulkreagens.- Til 384-brønds analyseplade, der indeholder fortyndinger af forbindelser og kontroller kun med opløsningsmiddel, dispenseres 5 μL SAMHD1/PPase-masterblanding. Til ingen enzymkontrolhuller dispenseres 5 μL komplet SAMHD1 RB. Forinkubere enzym og forbindelser i 10 minutter ved RT.
- Til alle brønde dispenseres 10 μL 2x dGTP-opløsning for at starte reaktionen.
- Inkuber reaktionen i 20 minutter ved RT.
- Stop reaktionen ved at dispensere 20 μL EDTA stopopløsning til alle huller.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her, hvis det ønskes. - Tilsæt 10 μL MG arbejdsløsning til alle huller.
FORSIGTIGHED: MG arbejdsløsning indeholder svovlsyre. - Sørg for blanding af brøndindhold ved hjælp af en orbital mikrobrøndpladeryster og centrifugering ved 1.000 x g i 1 min.
- Inkuber pladen i 20 minutter ved RT.
- Absorptionen ved 630 nm bølgelængde aflæses i en mikrobrøndspladelæser.
- Datavisualisering og analyse
- Beregn gennemsnits- og standardafvigelsen for de positive og negative kontrolbrønde (positiv, fuldstændig reaktion med opløsningsmiddel; negativ, dGTP alene med opløsningsmiddel). Beregn Z-faktor37 som indikator for analysekvalitet.
- Hver absorbansværdi normaliseres til middelværdierne for de positive og negative kontroller, idet den positive kontrol indstilles til 100 % SAMHD1-aktivitet og den negative kontrol til 0 % SAMHD1-aktivitet.
- SAMHD1-aktivitet (%) afbildes som funktion af den sammensatte koncentration og tilpasses en dosis-responskurve med fire parametre med variabel hældning, der muliggør bestemmelse af forbindelse IC50.
3. SAMHD1-aktivator og substratskærm
BEMÆRK: De endelige analysebetingelser er vist i tabel 2. Rekombinante SAMHD1- og PPase-alikvoter opbevares langtidsved -80 °C fortyndet ved henholdsvis 9,1 mg/ml og 23,0 mg/ml i opbevaringsbuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM TCEP) ved -80 °C. Når alikvoterne er optøet, opbevares de kortvarigt ved -20 °C.
- Fremstilling af nukleotidanaloger i analyseplade
- Fortynd nukleotidanaloge lagre (typisk 10 eller 100 mM i vand) til 4x endelig koncentration i komplet SAMHD1 RB, i vores tilfælde 800 μM nukleotidanalog, og overfør 5 μL til de relevante brønde i en 384-brønds analyseplade.
- Fremstilling af reaktionskomponenter
BEMÆRK: Dette skal gøres på dagen for analysen- Forbered enzym (SAMHD1/PPase) masterblanding ved at fortynde rekombinant humant SAMHD1-protein og rekombinant E. coli PPase i komplet SAMHD1 RB til 2x ønsket slutkoncentration, dvs. 0,7 μM SAMHD1 og 25 E / ml PPase.
- Forbered PPase aleneopløsning ved at fortynde rekombinant E. coli PPase i komplet SAMHD1 RB til 2x ønsket slutkoncentration, dvs. 25 E/ml PPase.
- Forbered aktivatorer GTP (AS1) og dGTPαS (AS1 og AS2) fortyndingsmateriale (typisk 10 eller 100 mM i vand) i komplet SAMHD1 RB til 4x endelig koncentration, således 50 μM GTP eller dGTPαS.
- Udfør analysen
BEMÆRK: Alle analysekomponenter skal ekvilibreres til RT. Væsketilsætninger kan udføres med enten en multikanalpipette eller en flydende dispenser til bulkreagens.- Til 384-brønds analyseplade, der indeholder nukleotidanaloger, dispenseres 5 μL af aktivatoren (enten GTP eller dGTPαS) eller komplet SAMHD1 RB til de relevante huller.
- Start reaktionen ved at dispensere 10 μL SAMHD1/PPase-masterblanding, PPase alene, eller komplet SAMHD1 RB til de relevante huller.
- Inkuber reaktionen i 20 minutter ved RT.
- Stop reaktionen ved at dispensere 20 μL EDTA-stopopløsning til alle hullerne.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her, hvis det ønskes. - Tilsæt 10 μL MG arbejdsløsning til alle hullerne.
FORSIGTIGHED: MG arbejdsløsning indeholder svovlsyre. - Sørg for blanding af brøndindhold ved hjælp af en orbital mikrobrøndpladeryster og centrifugering ved 1.000 x g i 1 min.
- Inkuber pladen i 20 minutter ved RT.
- Absorptionen ved 630 nm bølgelængde aflæses i en mikrobrøndspladelæser.
- Datavisualisering og analyse
- De gennemsnitlige absorbansværdier for hullerne med PPase-reaktionen (negativ kontrol eller baggrundssignal beregnes).
BEMÆRK: Som en positiv kontrol af en SAMHD1 allosterisk aktivator og substrat kan dGTP inkluderes i pladen. I dette tilfælde kan du bruge denne betingelse til at beregne Z-faktor som indikator for analysekvalitet. - Træk baggrundsværdien fra de tilsvarende huller i SAMHD1/PPase-reaktionerne.
- Der afbildes korrigerede absorbansværdier for hver nukleotidanalog med buffer-, GTP- og dGTPαS-betingelser.
- De gennemsnitlige absorbansværdier for hullerne med PPase-reaktionen (negativ kontrol eller baggrundssignal beregnes).
Representative Results
Protokollen skitseret i figur 1 beskriver den grundlæggende arbejdsgang for anvendelse af det enzymkoblede malachitgrønne assay til at undersøge interaktionen mellem små molekyler med dNTPase SAMHD1 og kan tilpasses på en række måder for at forhøre forskellige biokemiske spørgsmål. I de repræsentative resultater, der diskuteres i nedenstående afsnit, illustrerer vi eksempler på anvendelse af dette assay til at bestemme de hæmmende egenskaber af små molekyler mod SAMHD1 og til at teste, om forskellige nukleotidanaloger er substrater og / eller aktivatorer af dette enzym.
Resultaterne vist i figur 2 illustrerer flere kerneprincipper i dette assay. Det malachitgrønne reagens tillader kolorimetrisk påvisning af uorganisk phosphat gennem dannelsen af et phosphomolybdatmalachitgrønt kompleks, og følgelig kan denne tilgang anvendes til undersøgelse af enzymatiske reaktioner, hvis produkt er phosphat. For at påvise denne metodes følsomhed over for påvisning af frit uorganisk phosphat viser figur 2A absorbansværdierne opnået med stigende koncentrationer afNa3PO4efter 20 minutters inkubation med det malachitgrønne reagens. Mens signalet når mætning ved 0,25 mMNa3PO4, er det lineære detektionsområde for fosfat synligt fra 0,004 til 0,03 mM (figur 2A, højre panel) i overensstemmelse med andre undersøgelser, der rapporterede et phosphatlineært område op til 10-20 μM ved anvendelse af malachitgrøn analyse38.
SAMHD1 er en dNTPase, der frigiver uorganisk trifosfat ved hydrolysering af et dNTP-molekyle, og således kræves et koblingsenzym for at generere frit uorganisk fosfat til påvisning af malachitgrønt. Uorganisk pyrophosphatase (PPase) fra E. coli har vist sig nyttig til dette formål, både med hensyn til SAMHD1 7,20, men også andre nukleotidmetaboliserende enzymer 30,33,35. Derudover er SAMHD1 en aktiv dNTPase, når den er homotetramer, og dette kræver allosterisk aktivering af (d) NTP'er, specifikt et guanintrifosfat (GTP eller dGTP) ved AS1 og enhver dNTP ved AS2. Derefter bliver det katalytiske sted tilgængeligt for substratbinding, og den enzymatiske reaktion finder sted. Da dGTP opfylder kravene til binding til AS1 og AS2 og er et substrat, forenkler brugen af dette nukleotid i hæmningsanalysen arbejdsgangen betydeligt. Figur 2B illustrerer de forskellige analysekomponenters behov for at opnå målelig SAMHD1-aktivitet, hvilket fremgår af en stigning i absorbansen ved 630 nm. Hverken SAMHD1 eller PPase alene er i stand til at generere uorganisk fosfat i nærvær af dGTP, i overensstemmelse med disse enzymers dokumenterede aktiviteter. I den tilstand, hvor alle analysekomponenterne er til stede (SAMHD1, PPase og dGTP-aktivatoren / substratet), observerer vi imidlertid en stigning i signalet. Z-faktoren37 i eksemplet vist her (uden enzymer + dGTP som negativ kontrol og SAMHD1/PPase + dGTP som positiv kontrol) var 0,74, hvilket indikerer et robust assay.
En af de potentielle anvendelser af enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay er identifikation af inhibitorer gennem high-throughput screening (HTS). I denne rapport validerer vi således påvisningen af SAMHD1-hæmning i dette assay ved hjælp af et forskelligt sæt forbindelser, der allerede er beskrevet i litteraturen. Seamon et al. evaluerede den dosisafhængige hæmning af kanoniske nukleosider mod SAMHD1 ved hjælp af et lignende assay som vist her og fandt, at deoxyguanosin (dGuo) var det eneste kanoniske nukleosid, der var i stand til signifikant at hæmme SAMHD1 med en IC50-værdi på 488 μM20. En HTS af FDA-godkendte lægemidler udført med det direkte b4NPP-assay afslørede flere hits, der hæmmede SAMHD1-aktivitet ved mikromolære koncentrationer, hvorfra lomofungin var det molekyle, der mest potent hæmmede SAMHD1 dNTPaseaktivitet in vitro og udviste en IC50 på 20,1 μM, når den blev bestemt i nærvær af dGTP som substrat21. Derudover er de fire α,β-imido-dNTP-analoger også blevet identificeret som konkurrencedygtige hæmmere af SAMHD1 ved hjælp af MDCC-PBP-sensoren og SAMHD1 koblet til Ppx-aktivitet, hvilket viste, at dNMPNPP-analogernes hæmmende konstanter var i det lave mikromolære / høje nanomolære område 6,22. For at demonstrere, at det enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsassay kan bruges til at identificere SAMHD1-hæmmere, blev dGuo, lomofungin og 2'-deoxythymidin-5'-[(α,β)-imido]triphosphat (dTMPNPP) anvendt til at validere teknikken. Figur 3A illustrerer dosis-responskurverne opnået for disse forbindelser, hvilket viser, at stigende koncentrationer effektivt hæmmer SAMHD1-aktivitet. De gennemsnitlige IC50-værdier opnået for disse molekyler fra tre uafhængige eksperimenter (± standardafvigelse) var som følger: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungin 6,78 ± 3,9 μM og dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Som et eksempel på et negativt resultat blev virkningen af hydroxyurea (HU) på SAMHD1-aktivitet også bestemt. HU er en hæmmer af ribonukleotidreduktase, og selvom det begrænser SAMHD1 ara-CTPase-aktivitet i forskellige AML-modeller, viste virkningerne af HU på SAMHD1 sig at være indirekte og stole på at forstyrre den allosteriske regulering af SAMHD118. Dosisresponskurven for HU er vist i figur 3B, og der blev ikke observeret ændringer i SAMHD1-aktivitet ved stigende HU-doser, hvilket viser, at HU ikke hæmmer SAMHD1-aktivitet in vitro.
En anden anvendelse af enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay er at undersøge, om nukleotider og deres analoger er substrater og / eller allosteriske aktivatorer af dette enzym, hvilket er illustreret i figur 4. I dette eksperiment blev kanoniske nukleotider såvel som de aktive metabolitter af flere anticancernukleosidanaloger, såsom cytarabin (ara-CTP), clofarabin (Cl-F-ara-ATP) og gemcitabin (dF-dCTP), testet som SAMHD1-substrater og aktivatorer. På grund af den komplekse allosteriske regulering af SAMHD1 udføres reaktionen i nærvær af GTP som en AS1-aktivator eller den ikke-hydrolyserbare dGTP-analog 2'-deoxyguanosin-5'-(α-thio)-triphosphat (dGTPαS), som kan optage AS1 og AS2. SAMHD1-aktivitet i nærvær af den testede nukleotidanalog og GTP indikerer, at nukleotidet er i stand til at binde til det sekundære allosteriske sted og katalytiske sted (dvs. AS2-aktivator og substrat), mens SAMHD1-aktivitet med nukleotidanalogen og dGTPαS indikerer, at nukleotidet kun kan optage det katalytiske sted (dvs. kun et substrat). Hvis nukleotiden er i stand til at binde til både AS1- og AS2-allosteriske steder og til det katalytiske sted, vil SAMHD1 være aktiv i nærvær af nukleotidet alene, som vist i tilfælde af dGTP. Resultaterne viser, at alle kanoniske dNTP'er er i stand til at binde til AS2-stedet og til det katalytiske sted. I tilfælde af nukleotidanaloger er clofarabintriphosphat en AS2-aktivator og et substrat, mens cytarabintriphosphat kun er i stand til at optage det katalytiske sted. På den anden side blev der ikke observeret nogen aktivitet med gemcitabintrifosfat, hvilket tyder på, at gemcitabintrifosfat under de testede betingelser ikke er i stand til at fungere som allosterisk effektor eller substrat. Selvom dette resultat er i overensstemmelse med tidligere forudsigelser9, afslørede senere krystallisering og kinetiske undersøgelser10 , at gemcitabintrifosfat er i stand til at binde SAMHD1-katalytlommen, og at det faktisk er et substrat af enzymet. I sidstnævnte undersøgelse10 viser forfatterne imidlertid, at hydrolysehastigheden er betydeligt lavere sammenlignet med andre rapporterede substrater, såsom cytarabintrifosfat, hvilket forklarer, hvorfor vi ikke var i stand til at observere dette med denne screeningsopsætning.
Alt i alt validerer disse repræsentative resultater brugen af enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay som en robust teknik til identifikation og karakterisering af SAMHD1-hæmmere, allosteriske regulatorer og substrater. I lighed med alle eksperimentelle tilgange har denne metode imidlertid sine forbehold, og derfor bør ortogonale assays (f.eks. Ved hjælp af en anden analyseteknologi) bruges til yderligere at validere fund.
Figur 1: Skematisk oversigt over den protokol, der er beskrevet i denne artikel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay. (A) Na3PO4-standardkurve i den malachitgrønne analyse. Na3PO4 seriel fortynding (2 gange) blev fremstillet fra 1 mM til 0,004 mM i tre eksemplarer og inkuberet med malachitgrønt reagens i 20 minutter. Råabsorbansværdier for hele spektret af testede koncentrationer vises i venstre panel og det lineære område i højre panel. Repræsentativ for to uafhængige eksperimenter vist. B) Validering af enzymkoblet aktivitetsassay. SAMHD1 (0,35 μM) og/eller PPase (12,5 E/ml) ved tilstedeværelse eller fravær af aktivator/substrat dGTP (25 μM) blev inkuberet i 20 minutter i enzymkoblet aktivitetsassay. Firlinger fra en repræsentant for to uafhængige eksperimenter vist med afbildede rå absorbansværdier, søjler og fejlbjælker angiver middelværdi og SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Evaluering af forbindelser til SAMHD1-hæmning i enzymkoblet aktivitetsassay. Dosisrespons af lomofungin (0,78-100 μM), 2'-deoxythymidin-5'-[(α,β)-imido]triphosphat (dTMPNPP, 0,01-100 μM) og deoxyguanosin (dGuo, 10-1.500 μM) (A) eller hydroxyurea (HU) (0,78-100 μM) (B) i enzymkoblet SAMHD1-aktivitetsassay med dGTP (25 μM) som aktivator/substrat. Procentvis aktivitet i forhold til reaktionskontroller fra individuelle replikater plottet (DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% aktivitet, DMSO + dGTP = 0% aktivitet) med en repræsentativ for tre viste eksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Evaluering af nukleotidanaloger som SAMHD1 allosteriske aktivatorer og substrater i enzymkoblet aktivitetsassay. Kanoniske nukleotider og udvalgte trifosfatmetabolitter af kræftlægemidler cytarabin (ara-CTP), clofarabin (Cl-F-ara-ATP) og gemcitabin (dF-dCTP) blev testet ved 200 μM i det enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsassay i tilstedeværelse eller fravær af GTP eller ikke-hydrolyserbar dGTP-analog dGTPαS (12,5 μM). Normaliserede absorbansværdier fra individuelle eksperimentelle replikater plottet, middelværdien og SD er angivet. Repræsentativ for to uafhængige eksperimenter vist, tilpasset fra vores tidligere undersøgelse7. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Skridt | Reagens | Dispenseret volumen (μL) | Endeligt reaktionsvolumen (μL) | Koncentration dispenseret | Foldfortynding i reaktion | Endelig koncentration i reaktion |
| 1 | Hæmmer | 5 | 20 | 0,4 mM | 4 | 0,1 mM |
| 2 | SAMHD1+PPase-blanding | 5 | 1,4 μM SAMHD1, 50 E/ml PPase | 4 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/ml Ppase | |
| 3 | dGTP | 10 | 50 μM | 2 | 25 μM | |
| 4 | Inkubation i 20 minutter | |||||
| 5 | EDTA-løsning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG reagens | 10 | 50 | 2,5 mM malakit grøn, 64,4 mM ammoniummolybdat, 0,18% Tween-20 | 5 | 0,5 mM malakit grøn, 12,9 mM ammoniummolybdat, 0,036% Tween-20 |
| 7 | Inkubation i 20 minutter | |||||
| 8 | Læs @ 630 nm | |||||
Tabel 1: Oversigt over de endelige betingelser i enzymkoblet assay til screening af inhibitorer.
| Skridt | Reagens | Dispenseret volumen (μL) | Endeligt reaktionsvolumen (μL) | Koncentration dispenseret | Foldfortynding i reaktion | Endelig koncentration i reaktion |
| 1 | Allosterisk regulator | 5 | 20 | 800 μM | 4 | 200 μM |
| 2 | GTP eller dGTPαS | 5 | 50 μM | 4 | 12,5 μM | |
| 3 | SAMHD1 og/eller PPase | 10 | 0,7 μM SAMHD1, 25 U/ml PPase | 2 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml PPase | |
| 4 | Inkubation i 20 minutter | |||||
| 5 | EDTA-løsning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG reagens | 10 | 50 | 2,5 mM malakit grøn, 64,4 mM ammoniummolybdat, 0,18% Tween-20 | 5 | 0,5 mM malakit grøn, 12,9 mM ammoniummolybdat, 0,036% Tween-20 |
| 7 | Inkubation i 20 minutter | |||||
| 8 | Læs @ 630 nm | |||||
Tabel 2: Sammenfatning af de endelige betingelser i enzymkoblet assay for screening af allosteriske regulatorer
Discussion
Det enzymkoblede aktivitetsassay, der er beskrevet her, er et kolorimetrisk assay med høj kapacitet, der muliggør indirekte måling af dNTP-hydrolyse ved SAMHD1. Denne metode udnytter evnen af uorganisk PPase fra E. coli, som, når den indgår i overskud i reaktionsblandingen, omdanner hvert uorganisk trifosfat genereret af SAMHD1 til tre individuelle frie fosfater, der kan kvantificeres ved hjælp af det enkle og økonomiske malachitgrønne reagens. Vi leverer dette assay i et 384 mikrobrøndpladeformat, som er ideelt til screening af sammensatte biblioteker, og demonstrerer anvendeligheden og alsidigheden af denne teknik til identifikation og karakterisering af SAMHD1-hæmmere, aktivatorer og substrater.
Som med alle in vitro biokemiske screeningsassays er der en række kritiske trin og vigtige overvejelser, og mange af disse diskuteres indgående i den frit tilgængelige Assay Guidance Manual39. Integriteten af de oprensede rekombinante enzymer, både SAMHD1 og det koblede enzym uorganiske PPase, er ekstremt vigtig og bør bekræftes, før analysen etableres. Og derfor bør hver ny oprensning af disse enzymer underkastes et vist niveau af batchtest, da batch-til-batch-variabiliteter kan indføre uoverensstemmelser i resultaterne. Ideelt set bør anvendelse af et ortogonalt direkte assay, såsom HPLC, som muliggør påvisning af både substrat og reaktionsprodukt, anvendes til at verificere dNTP-triphosphohydrolaseaktiviteten af den rensede rekombinante SAMHD1, der anvendes.
Med hensyn til begrænsninger af dette assay er princippet et, at det måler dNTPase-aktiviteten af SAMHD1 på en indirekte måde og udnytter aktiviteten af uorganisk PPase, hvilket har en række konsekvenser. Det er vigtigt at bekræfte, at PPase besidder ringe eller ingen aktivitet mod nukleotider, der anvendes i analysen, og ligeledes, at hæmmende små identificerede molekyler ikke har nogen aktivitet mod PPase. Med hensyn til screening kan en modskærm mod PPase således være en vigtig overvejelse. Tilstedeværelsen af PPase i reaktionen gør det også kritisk at anvende et ortogonalt assay for at bekræfte fundene. Med hensyn til direkte aktivitetsanalyser er der til dato rapporteret en række af dem, herunder TLC 9,20,23 og HPLC 9,21, som nøjagtigt detekterer substratudmattelse og produktdannelse. Derudover kan b4NPP-assay21, som også er høj gennemstrømning, bruges til at teste potentielle hæmmere; Det er dog ikke ideelt at teste substrater eller allosteriske aktivatorer. Biofysiske analyser, såsom differentialscanningsfluorimetri (DSF), som vi tidligere har rapporteret med SAMHD118, kan også være særligt kraftfulde til at identificere og karakterisere ligander. En anden begrænsning af assayet, specifikt som vist i opsætningen her til identifikation af substrater og aktivatorer, er brugen af den ikke-hydrolyserbare dGTP-analoge dGTPαS som en AS1- og AS2-aktivator. Mens dette tillader aktivering af SAMHD1 uden observerbar aktivitet i analysen, er dGTPαS en kompetitiv hæmmer af SAMHD1, og derfor vil brugen af høje koncentrationer inaktivere enzymet. Efterhånden som vores forståelse af SAMHD1 skrider frem, kan fremtidige undersøgelser bruge molekyler, der udelukkende optager hvert sted i SAMHD1, og dermed negere dette potentielle problem.
Som vi har vist her, er denne metode alsidig og kan bruges til at løse en række biokemiske spørgsmål. Vi har beskrevet to variationer af dette assay, en til identifikation af allosteriske regulatorer og substrater af SAMHD1 og en anden til karakterisering af inhibitorer, men yderligere tilpasninger kan foretages. Med hensyn til potentielle hæmmere gør dette assay, der er mikrobrøndpladebaseret, det velegnet til nedstrøms virkningsmekanismeundersøgelser 39,40. På samme måde kan denne teknik til yderligere karakterisering af substrater og allosteriske regulatorer anvendes til at bestemme kinetiske parametre for katalyse, som vi udførte for den aktive metabolit af cytarabin og clofarabin7. En ulempe er imidlertid, at det enzymkoblede assay, der rapporteres her, er et endepunktsassay, og selvom det er velegnet til screening, ville et kontinuerligt assay være bedre egnet til nogle mekanistiske undersøgelser. Arnold et al. rapporterede et kontinuerligt enzymkoblet assay, der anvender biosensoren MDCC-PBP6, som er afhængig af brugen af det periplasmatiske fosfatbindende protein (PBP) mærket med coumarinmaleimid (MDCC) fluorofor, der kan binde til en fri fosfatgruppe. MDCC-PBP er meget følsom og muliggør kvantificering af meget lave fosfatkoncentrationer, hvor sensorens responstid er i tidsskalaen fra millisekund til sekund.
SAMHD1 spiller en række vigtige funktioner i menneskers sundhed og sygdom2 , hvoraf mange kan knyttes til dets centrale rolle i opretholdelsen af intracellulære dNTP-niveauer1. Således ville identifikation af en kemisk sonde af høj kvalitet mod dNTPase-aktiviteten af SAMHD1 være et kraftfuldt værktøj til at definere disse links, og det enzymkoblede assay, der rapporteres her, kunne let anvendes til at identificere sådanne sonder. Desuden er nukleosidbaserede lægemidler, hvoraf mange moduleres af SAMHD1, en forskelligartet og vigtig gruppe af terapeutiske41; kemiske sonder kunne videreudvikles til lægemidler til at målrette SAMHD1 i den kliniske indstilling med det formål at øge effektiviteten af disse terapier. Det er også afgørende at forstå det fulde omfang af interaktionen mellem disse nukleosidbaserede forbindelser med SAMHD1, et spørgsmål, der også kan løses ved hjælp af dette enzymkoblede assay. Samlet set er det enzymkoblede SAMHD1-aktivitetsassay, som rapporteret her, et billigt, alsidigt assay med høj kapacitet, der kan bruges til at fremme vores forståelse af dette vigtige enzym.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Thomas Lundbäck og medlemmer af Thomas Helledays laboratorium for råd og støtte. En del af dette arbejde blev faciliteret af Protein Science Facility ved Karolinska Institutet / SciLifeLab (http://ki.se/psf), og vi anerkender National Cancer Institute (NCI), Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) og Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) for at levere en forbindelse. Finansieringen blev ydet gennem tilskud tildelt S.G.R. fra det svenske forskningsråd (2018-02114), den svenske kræftforening (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), den svenske børnecancerfond (PR2019-0014) og Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
| 2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
| 96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
| ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
| Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
| Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
| His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
| His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
| Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
| Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium phosphate (Na3PO4) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
| Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
| Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |
References
- Franzolin, E., et al. The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).
- Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. SAMHD1 functions and human diseases. Viruses. 12 (4), 382 (2020).
- Goldstone, D. C., et al. HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase. Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).
- Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase. The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).
- Morris, E. R., Taylor, I. A. The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).
- Herold, N., et al. Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies. Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).
- Schneider, C., et al. SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).
- Hollenbaugh, J. A., et al.
- Knecht, K. M., et al. The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).
- Oellerich, T., et al. Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML. Nature Communications. 10 (1), 3475 (2019).
- Herold, N., et al. SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites. Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).
- Rothenburger, T., et al. SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine. Communications Biology. 3 (1), 324 (2020).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Castellví, M., et al. Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy. Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).
- Rassidakis, G. Z., et al. Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens. Blood Cancer Journal. 8 (11), 98 (2018).
- Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies. Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554 (2017).
- Rudd, S. G., et al. Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy. EMBO Molecular Medicine. 41, 10419 (2020).
- Seamon, K. J., et al. Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization. Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).
- Seamon, K. J., Stivers, J. T. A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase. Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).
- Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay. Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).
- Morris, E. R., et al. Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis. Nature Communications. 11 (1), 3165 (2020).
- Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).
- Lin, H. -H., Huang, C. -Y. Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368 (2012).
- Yang, M., Wang, G. ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method. Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).
- Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays. Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).
- Lee, M., et al. Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay. ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).
- Carreras-Puigvert, J., et al. A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family. Nature Communications. 8 (1), 1541 (2017).
- Valerie, N. C. K., et al. NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine. Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).
- Carter, M., et al. Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold. Structure. 26 (2), 295-303 (2018).
- Gad, H., et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).
- Page, B. D. G., et al. Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells. Nature Communications. 9 (1), 250 (2018).
- Zhang, S. M., et al. Development of a chemical probe against NUDT15. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).
- Michel, M., et al. In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization. Frontiers in Chemistry. 8, 443 (2020).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67 (1999).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Markossian, S., et al.
- Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
- Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism. Cancers. 10 (7), 240 (2018).
