Rilevamento dell'aggregazione proteica mediante spettroscopia di correlazione a fluorescenza

Summary

Introduciamo qui una procedura per misurare gli oligomeri proteici e l'aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive utilizzando la spettroscopia di correlazione a fluorescenza.

Abstract

L'aggregazione proteica è un segno distintivo di disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SSS), il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), il morbo di Huntington (MH) e così via. Per rilevare e analizzare oligomeri o aggregati proteici solubili o diffusi, è stata utilizzata la spettroscopia di correlazione a fluorescenza (FCS), in grado di rilevare la velocità di diffusione e la luminosità di una singola particella con una singola sensibilità molecolare. Tuttavia, la procedura e il know-how adeguati per il rilevamento dell'aggregazione proteica non sono stati ampiamente condivisi. Qui, mostriamo una procedura standard di misurazione FCS per le proprietà di diffusione delle proteine soggette a aggregazione nel lisato cellulare e nelle cellule vive: frammento carbossile-terminale associato alla SLA di DNA/proteina legante l'RNA 43 kDa (TDP25) e superossido dismutasi 1 (SOD1). I risultati rappresentativi mostrano che una parte degli aggregati di TDP25 taggato da proteine fluorescenti verdi (GFP) è stata leggermente inclusa nella frazione solubile del neuroblastoma murino Neuro2a cell lysate. Inoltre, sod1 con tag GFP che trasporta mutazioni associate alla SS mostra una diffusione più lenta nelle cellule vive. Di conseguenza, qui introduciamo la procedura per rilevare l'aggregazione proteica attraverso la sua proprietà di diffusione utilizzando FCS.

Introduction

Le aggregazioni proteiche che coinvolgono disturbi neurodegenerativi come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, il morbo di Huntington e^{così via sono note} per essere tossiche e disturberebbero l'omeostasi proteica (proteostasi) nelle cellule e negli organi, che potrebbe quindi portare all'invecchiamento². La clearance dell'aggregazione proteica è prevista come strategia terapeutica; tuttavia, non sono ancora state stabilite sostanze chimiche che impediscono la formazione di aggregazione proteica e degradano aggregati proteici (ad esempio, piccole molecole o farmaci). Inoltr....

Protocol

1. Materiali e reagenti

1. Utilizzare soluzioni e mezzi pirogenici liberi per la coltura cellulare(tabella 1).
2. Preparare soluzioni per l'esperimento biochimico utilizzando acqua ultrapura e utilizzare come privo di DNasi/RNasi.
3. Selezionare un FBS appropriato per le impostazioni cultura delle celle con un processo di controllo del lotto. Poiché il lotto FBS selezionato cambia regolarmente, il catalogo e il numero di lotto per FBS non possono essere rappresentati qui.
4. DNA plasmide
   1. Preparare pmeGFP-N1^{5 per l'espressione} monomero eGFP; pmeGFP-C1-TDP25^{6 per} l'espre....

Results

Abbiamo eseguito la misurazione FCS di GFP-TDP25 in lisato cellulare e SOD1-G85R-GFP in cellule vive. In entrambi i casi, è stato possibile acquisire un'ampiezza positiva e aFS lisci. Abbiamo dimostrato che una porzione di GFP-TDP25 espressa in cellule Neuro2a è stata recuperata nella frazione solubile nella condizione indicata⁶. Nella frazione solubile del lisato cellulare, molecole di fluorescenza estremamente luminose sono state rilevate nel record di velocità di conteggio dei fotoni utilizzand.......

Discussion

Per quanto riguarda la taratura del sistema prima delle misurazioni, devono essere utilizzate le stesse vetrerie utilizzate per misurare il campione (ad esempio, la camera di vetro di copertura a 8 pozzi per il lisato cellulare e la base in vetro da 35 mm per celle vive). A causa dell'adsorbimento di Rh6G sul vetro, la sua concentrazione effettiva può talvolta diminuire. In tal caso, una soluzione Rh6G altamente concentrata come 1 μM deve essere utilizzata solo per la regolazione del foro stenopeica. Le velocità di conte.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% (p/v) tripsina-1 mmol/L EDTA· Soluzione 4Na con rosso fenolo (tripsina-EDTA)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	201-16945
Piastre in plastica da 100 mm	CORNING	430167
Piastra con base in vetro da 35 mm	IWAKI	3910-035	Per la misurazione di cellule vive
Piastre in plastica da 35 mm	Thermo Fisher Scientific	150460
Piastra in alluminio	Bio-Bik	AB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27	Carl Zeiss		Obiettivo
Raschietto cellulare	Sumitomo bachelite Co., Ltd.	MS-93100
Membrana filtrante in acetato di cellulosa (0,22 mm)	Advantech Toyo	25CS020AS
Copertura della camera di vetro a 8 pozzetti	IWAKI	5232-008	Per la misurazione
della soluzione Terreno dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM)	Terreno basale	Sigma-Aldrich	D5796
Siero fetale bovino (FBS)	biosieri		È richiesto il controllo del lotto
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS sistema
Neuroblastoma murino Cellule Neuro2a	ATCC	CCL-131	Linea cellulare
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	RIKEN	RDB08938	DNA plasmidico per il vettore di trasfezione
Soluzione di penicillina-streptomicina (× 100 )	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	168-23191
pmeGFP-C1-TDP25			DNA plasmidico per TDP25 marcato con eGFP monomerico
pmeGFP-N1			DNA plasmidico per l'espressione del monomero eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			DNA plasmidico per il mutante G85R legato alla SLA di SOD1 marcato con cocktail monomerico di inibitori della
proteasi	eGFP Sigma-Aldrich	P8304