Summary
Здесь мы описываем коррелятивный рабочий процесс для иссечения, герметизации, фиксации и визуализации мышиного легочного клапана для определения валовой конформации и локальных структур внеклеточного матрикса.
Abstract
Основные причины заболеваний, связанных с сердечным клапаном (HVD), неуловимы. Мышиные животные модели обеспечивают отличный инструмент для изучения HVD, однако хирургический и инструментальный опыт, необходимый для точной количественной оценки структуры и организации в нескольких масштабах длины, затмил его продвижение. Эта работа содержит подробное описание рассечения мыша, окрашивания блока, обработки образцов и корреляционных процедур визуализации для изображения сердечного клапана в различных масштабах длины. Гидростатическое трансклапанное давление использовалось для контроля временной гетерогенности путем химической фиксации конформации сердечного клапана. Микрокоммуническая томография (мкКТ) использовалась для подтверждения геометрии сердечного клапана и обеспечения ориентира для последующей обработки образцов, необходимой для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии лица (SBF-SEM). Были взяты и реконструированы последовательные SEM-изображения внеклеточного матрикса (ECM) с высоким разрешением, чтобы обеспечить локальное 3D-представление его организации. Затем методы визуализации μCT и SBF-SEM были коррелированы для преодоления пространственных вариаций в легочном клапане. Хотя представленная работа посвящена исключительно легочному клапану, эта методология может быть принята для описания иерархической организации в биологических системах и имеет решающее значение для структурной характеристики в нескольких масштабах длины.
Introduction
Легочный клапан (PV) служит для обеспечения однонаправленного кровотока между правым желудочком и легочной артерией. Пороки развития легочного клапана связаны с несколькими формами врожденных пороков сердца. В настоящее время лечение врожденного заболевания клапанов сердца (HVD) - это восстановление клапанов или замена клапанов, что может потребовать нескольких инвазивных операций в течение всей жизни пациента1. Широко признано, что функция сердечного клапана происходит от его структуры, часто называемой структурно-функциональным коррелятом. Более конкретно, геометрические и биомеханические свойства сердца диктуют его функцию. Механические свойства, в свою очередь, определяются составом и организацией ECM. Разрабатывая метод определения биомеханических свойств клапанов сердца мысей, трансгенные животные модели могут быть использованы для опроса о роли ECM на функции сердечного клапана и дисфункции2,3,4,5.
Модель мышиных животных уже давно считается стандартом для молекулярных исследований, потому что трансгенные модели более доступны у мышей по сравнению с другими видами. Мышиные трансгенные модели обеспечивают универсальную платформу для исследования заболеваний, связанных с сердечными клапанами6. Тем не менее, хирургический опыт и требования к инструментам для характеристики как геометрии, так и организации ECM были основным препятствием в продвижении исследований HVD. Хстологические данные в литературе дают картину содержания внеклеточного матрикса мышиного клапана сердца, но только в виде 2D-изображений, и не в состоянии описать его 3D-архитектуру7,8. Кроме того, сердечный клапан является как пространственно, так и временно неоднородным, что затрудняет выводы в экспериментах относительно организации ECM, если выборка и конформация не фиксированы. Обычные методы 3D-характеристики, такие как МРТ или 3D-эхокардиография, не обеспечивают разрешения, необходимого для разрешения компонентов ECM9,10.
Эта работа подробно описывает полностью коррелятивный рабочий процесс, где временная гетерогенность, обусловленная сердечным циклом, была устранена путем фиксации конформации мышиного PV с гидростатическим трансклапанным давлением. Пространственная гетерогенность контролировалась именно путем выборки интересующих областей и регистрации наборов данных из различных методов визуализации, в частности μCT и последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии, в разных масштабах длины. Этот метод разведки с помощью μCT для направления отбора проб вниз по течению был предложен ранее, но поскольку легочный клапан демонстрирует временные вариации, на хирургическом уровне11потребовался дополнительный уровень контроля.
Исследования in vivo, описывающие биомеханику клапанов сердца мыщ, редки и вместо этого полагаются на вычислительные модели при описании деформационного поведения. Крайне важно, чтобы локальные внеклеточные данные по шкале нанометровой длины были связаны с геометрией и расположением сердечного клапана. Это, в свою очередь, обеспечивает количественное, пространственно отображенное распределение механически способствующих белков ECM, которые могут быть использованы для усиления существующих биомеханических моделей клапанов сердца12,13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных в этом исследовании соответствовало Национальному детскому госпиталью по уходу за животными и их использованию в соответствии с протоколом AR13-00030.
1. Иссечение легочного клапана
- Автоклав необходимых инструментов, необходимых для рассечения мыши. Это включает в себя тонкие ножницы, микрощипцы, микрососудистые зажимы, щипцы для применения зажимов, держатели микроигл, пружинные ножницы и втягивающие.
- Акклиматизуем всех мышей минимум за 2 недели до операции. Удалите мышей C57BL/6, примерно 1 года, из их клеток и взвесьте, а затем усыпить с помощью коктейля кетамина / ксилазина (3: 1 кетамин: ксилазин, 0,01 мл на г) передозировки.
- Поместите мышь в дорсальное положение лежа на лотке и закрепите ее конечности скотчем. После закрепления выполните торакотомию.
- Обнажите сердце, удалив излишки жировой ткани и фасций.
- Удалить правое предсердие и перфузировать через левый желудочек физиологическим раствором комнатной температуры (0,9% NaCl). Перфузия должна занимать примерно 20 мл в течение 30 с. Это приводит к экссангинации мыши.
- Удалите все сердце, разогнав верхнюю полую вену, нижнюю полую вену, легочную артерию и аорту. Особую осторожность следует проявлять к легочной артерии. Разрезают примерно на 2 мм выше вентрикуло-артериального соединения, так как это будет служить каналом для герметизации.
- Удалите левый и правый желудочки, чтобы подвергнуть камеры атмосферным давлениям. Убедитесь, что структура легочного ствола не должна быть затронута удалением желудочков.
2. Фиксация давления легочного клапана
- Анастомозная трубка напора с легочной артерией, оставляющая расстояние примерно в 1 мм между синотубчатым соединением и концом трубки для размещения больших движений листочков и легочного ствола.
- Поднимите резервуар до аналогичного физиологического давления и заполните его солевым раствором. Проверьте проточную систему, чтобы убедиться в отсутствии засоров или пузырьков воздуха.
- Прикрепите запорный кран к анастомозированному легочному клапану и обеспечьте достаточный поток через трубку (т. Е. Отсутствие пузырьков воздуха) путем переключения тракта оттока. Как только поток будет адекватным, переключите отток на анастомозированный легочный клапан и обеспечьте герметизацию легочной ствола. Это определяется растяжением легочной туловища.
- Как только давление легочной ствола подтверждено, постепенно включайте первичный фиксаторный раствор (1,25% глутаровый альдегид, 1,0% параформальдегид в 0,15 М какодилата) до тех пор, пока солевой раствор не продувят. Это делается путем удаления части, примерно 25% емкости резервуара, соляного раствора и замены его первичным фиксатором.
ВНИМАНИЕ: Используемые фиксаторы (параформальдегид и глутаральдегид) являются высокотоксичными, и для обеспечения безопасности следует носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). - Поместите пропитанную фиксаторами марлю на образец ткани, чтобы предотвратить высыхание.
- Перфьмировку фиксатора в течение 3 ч, заправляя резервуар по мере необходимости для поддержания постоянного давления. На протяжении всей фиксации легочный клапан нередко сжимается из-за химической фиксации. Если это так, постоянно пополняйте резервуар первичным фиксатором для поддержания физиологического давления.
- Храните сердечный клапан в фиксаторном растворе при 4 °C до использования. Образцы хранились до 1 недели без какой-либо заметной разницы.
3. В блок окрашивание и встраивание образцов15,16
ВНИМАНИЕ: Окрашивающие реагенты, используемые в этом разделе (ферроцианид калия, тетроксид осмия, тиокарбогидразид, аспартат свинца и уранилацетат), являются высокотоксичными и с ними следует обращаться с особой осторожностью. Рекомендуется использовать вытяжную вытяжку и надлежащие СИЗ.
- Окрашивание
- Промывайте образец неподвижного сердечного клапана в течение 5 мин холодным какодилатным буфером 0,15 М. Повторите стирку еще два раза.
- Полностью погрузить сердечный клапан в раствор 1,5% ферроцианида калия, 0,15 М какодилата, 2 мМ хлорида кальция и 2% тетроксида осмия, на льду в течение 1 ч.
- Пока образец инкубируется, готовят раствор тиокарбогидразида (ТКП), растворяя 0,1 г ТКП в 10 мл ddH2O.Поместите раствор в духовку с 60 °C в течение 1 ч. Осторожно периодически перемешивать, чтобы убедиться, что ТХ полностью растворяется. Процедить раствор через шприцевой фильтр 0,22 мкм непосредственно перед использованием.
- Промыть образцы комнатной температурой ddH2O, поместив их в трубку с ddH2O на 5 мин и слегка перемешать, встряхнув емкость. Повторите этот процесс три раза.
- Поместите его в фильтрованный раствор ТХ на 20 мин при комнатной температуре. Выполните этап стирки три раза (по 5 мин каждая) при комнатной температуре ddH2O, как описано в шаге 3.1.4.
- После этого поместите образец в 2% тетроксида осмия в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем снова промыть его в общей сложности три раза по 5 мин каждый с комнатной температурой ddH2O.
- Инкубировать образец в 1% уранилацетата в течение ночи при 4 °C.
- За это время вносят раствор из 0,066 г нитрата свинца в 10 мл раствора аспарагиновой кислоты. Отрегулируйте рН до 5,5 с 1 Н КОН. Поместите раствор в духовку с 60 °C для растворения нитрата свинца.
- После ночной инкубации выполните этап промывки, как описано на этапе 3.1.4. Повторите три раза. Затем инкубируют ткань сердечного клапана в растворе аспартата свинца со ступени 3.1.8 в духовке при 60 °C в течение 30 мин.
- Обезвоживание
- Промыть салфетки в течение 5 мин при комнатной температуре с ddH2O. Повторить три раза.
- В составлять свежие растворы 20%, 50%, 70%, 90% и 100% этанола в ddH2O. Хранить на льду до использования.
- Для обезвоживания ткани сердечного клапана. Выполняйте последующие обработки 20%, 50%, 70% и 90% этанола на льду в течение 5 мин каждая. Затем выполняют две последующие обработки 100% этанолом на льду в течение 5 мин.
- Переместите ткань до ледяного ацетона в течение 10 мин. Затем поместить в свежий ацетон комнатной температуры на 10 мин.
- Внедрение
- Производят смоляную смесь (см. Таблицу материалов)в соответствии со спецификациями производителя: 11,4 г компонента А, 10 г компонента В, 0,3 г компонента С и 0,05-0,1 г компонента D. Первоначально смешайте компоненты A и B, нагревая каждый из компонентов до 60 °C перед добавлением компонентов C и D. Смесь превратится в янтарный цвет при добавлении компонентов C и D. Он будет однородным при правильном смешивании.
- Делайте смеси с объемными соотношениями 25:75, 50:50 и 75:25 смола:ацетон. Тщательно перемешать.
- Поместите ткани в последующие обработки смесью смолы: ацетона 25:75, 50:50 и 75:25 в течение 2 ч каждая при комнатной температуре.
- Поместите ткани в 100% смолу на ночь при комнатной температуре.
- На следующий день поместите ткани в свежую 100% смолу на 2 ч при комнатной температуре.
- Перенесите ткани сердечного клапана во встраиваемую капсулу, замените свежей 100% смолой и поместите в духовку с 60 °C на 48 ч для лечения.
- Выполните коррелятивную визуализацию, как показано ниже.
4. Микрокоммунографная томография
- Установите блок образцов смолы на держатель образца μCT с помощью клея (хорошо работает клей или двусторонняя лента).
- Поместите держатель в камеру μCT и закрепите его на сцене, прикрутив цангу таким образом, чтобы держатель не помещал. Перемещение образца во время сканирования приведет к снижению качества изображения.
- Откройте пользовательский интерфейс μCT, дважды щелкнув значок. Добавьте проект, выбрав знак + рядом с пунктом Проекты и заполните необходимые поля.
- Как только он будет создан, найдите созданный проект и выберите его, нажав на него. Это откроет вторую колонку Приобретения. Выберите + рядом с пунктом Приобретения и заполните необходимые поля.
- Закройте дверцы камеры и вооружите систему, нажав кнопку зажима на передней панели или μCT. Прогрейте рентгеновские снимки из пользовательского интерфейса, выбрав кнопку, указывающую Разогрев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Система автоматически отключит рентгеновские лучи после успешной процедуры разминки. Включите рентгеновские лучи, нажав кнопку. - Отрегулируйте вращение ступени таким образом, чтобы центр вращения образца не отклоняется от центра монитора (т.е. образец находится в поле зрения на протяжении всего сканирования). Для системы, используемой для этого эксперимента, это включает в себя настройку уровня интересующей области (ROI) в раскрывающейся вкладке, как описано ниже.
- Установите регулировку этапа ROI, установив угол поворота на 0° и отметив край образца. Затем образец поворачивается на 180° и край образца снова маркируется.
- Отрегулируйте положение оси X этапа ROI таким образом, чтобы край образца был между этими двумя крайностями. Повторите этот процесс для углов поворота 90° и 270° для положения Y.
- В случае, когда вращение образца приводит к тому, что края выходят за поле зрения, уменьшите увеличение потребностей μCT до тех пор, пока края образца не будут видны под заданными выше углами и не будет произведена грубая регулировка стадии ROI.
- После регулировки при меньшем увеличении переместите образец или детектор, чтобы увеличить увеличение, и положение ROI может быть точно отрегулировано.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс, возможно, потребуется повторить для обеспечения согласованности. Правильное выравнивание приводит к тому, что образец практически не показывает горизонтального движения через все углы поворота образца.
- Отрегулируйте μCT в соответствии с требуемыми параметрами сканирования с помощью программного обеспечения производителя. Эти параметры включают потенциал трубки, ток трубки, расстояние детектора, расстояние до образца, время экспозиции, траекторию и количество проекций (см. Таблицу S1 для параметров сбора μCT, используемых в этом исследовании).
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры калибровки, такие как сканирование чистого поля и темного поля, должны соблюдаться в спецификациях производителя, если не указано иное. Например, если образец слишком велик и система не может переместить образец из поля, то образец необходимо удалить для выполнения сканирования калибровки в чистом поле. - После того, как параметры установлены, приближение продолжительности сканирования можно увидеть, нажав кнопку Оценка времени. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать сканирование.
- После завершения сканирования убедитесь, что рентгеновские лучи выключены, открутите цангу и осторожно извлеките образец из камеры μCT.
5. Обработка образцов и корреляция изображений
- Реконструировать проекции μCT с помощью алгоритма отфильтрооированной обратной проекции с помощью программного обеспечения, предоставленного производителем (см. Таблицу материалов).
- Выберите вкладку Recon в верхней части экрана. Выберите вкладку Проект и приобретение.
- Выберите шаблон recon, связанный с отфильтроированной обратной проекцией. Нажмите кнопку Запустить разопоминочные работы.
- Идентификация и сегментация легочного клапана с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Для этого требуется предварительное знание анатомии легочного клапана17. При повышенном артериальном давлении листочки совмещаются и блокируют просвет легочного клапана.
- Определите ориентацию нарезки относительно направления сканирования и образца. Переориентировать образец таким образом, чтобы направление нарезки было выровнено с нужной осью.
- Определите области, представляющие интерес для изображений с высоким разрешением. В этом эксперименте был выбран живот (середина) листочка и артерио-клапанное соединение.
- Удалите избыток смолы и образец либо лезвием бритвы, либо шлифовкой для больших кусков материала, либо микротомом для более мелких кусочков.
- Оказавшись в интересуемом месте, сравните физический образец с виртуальными срезами μCT, чтобы подтвердить местоположение. Это было сделано путем сравнения анатомических особенностей на поперечном сечении.
6. Последовательная блок сканирующей электронной микроскопии18
- Уменьшите поперечное сечение образца, чтобы вместить SBF-SEM, примерно на 2,0 x 1,5 x 1,8 мм.
- Установите обрезанный образец на алюминиевый заглушку SBF-SEM с помощью эпоксидной смолы.
- Покрыть блок образца 35-нм золотом. Раскрутите образец на платформе, чтобы нанести ровный слой покрытия.
- Вентиляционная камера SBF-SEM и регулировка высоты лезвия ножа в соответствии с эйцентрической высотой микроскопа.
- Вставьте образец и выровнйте заглушку образца.
- Изображение в условиях низкого вакуума для предотвращения зарядки и с помощью детектора обратного рассеяния (см. Таблицу S2 для параметров сбора SBF-SEM).
- Изобразите и сшите несколько областей интереса при разных увеличениях с помощью автоматизированного программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анастомоз легочной артерии до напорной трубки показан на фиг.1А. После применения гидростатического давления легочный ствол растяжение радиально(рисунок 1B),что указывает на то, что створки легочного клапана находятся в закрытой конфигурации. Конформация легочного клапана была подтверждена μCT. В этом случае листовки были коаптами (закрытыми), а кольцо круговым(рисунок 2А). На рисунке 2B,C показаны различные степени неадекватного давления легочного клапана либо путем фиксации(рисунок 2B),либо артериального коллапса(рисунок 2C).
Обрезка блока образцов проводилась с помощью объемного рендеринга μCT. В этом случае в качестве направления нарезки была выбрана плоскость, параллельная сино-трубчатым соединениям. Используя анатомические ориентиры, виртуальные поперечные сечения объемного рендеринга μCT коррелировали с оптическими изображениями(рисунок 3)для подтверждения направления и местоположения нарезки.
Как только блок образцов находился в нужном месте и ориентации, изображения SBF-SEM с высоким разрешением были сделаны в локальном регионе внутри листовки. Корреляция изображений была выполнена между виртуальным срезом рендеринга объема μCT(рисунок 4A),изображениями SBF-SEM с низким разрешением(рисунок 4B)и изображениями SBF-SEM с высоким разрешением(рисунок 4C). Из-за ручного монтажа образца необходимые срезы блока образцов были необходимы для создания плоской поверхности перед получением изображений в SBF-SEM; следовательно, различные расположения между рисунками 3 и 4.
Полную корреляцию изображений между наборами данных μCT и SBF-SEM можно увидеть в Видео 1. Образец легочного клапана в объемном рендеринге μCT можно легко отличить от окружающей встраиваемой смолы из-за окрашивания атомов тяжелых металлов. Длина и углы измеряются на изображении, чтобы направлять нарезку. В этом примере использовалась плоскость, параллельная сино-трубчатого соединения. Виртуальный срез эмулирует удаление материала до тех пор, пока не будет достигнута глубина интереса. Изображения с высоким разрешением, сделанные SBF-SEM, были сделаны на этом поперечном сечении и зарегистрированы в наборе данных μCT.
После получения изображения с высоким разрешением, сделанные SBF-SEM, могут быть импортированы в процессор обработки изображений и скомпилированы в 3D-представление(рисунок 5),где могут быть идентифицированы внеклеточные компоненты.
Рисунок 1:Репрезентативные изображения анастомозированного легочного ствола. Иссякаемый легочный ствол(А)до и(В)после гидростатического напора. Пунктирная линия указывает на вентрикуло-артериальное соединение, где находится кольцевое кольцо легочной ствола. Обратите внимание на растяжение легочной магистрали при надавливании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативный объем μCT, отображающий легочный клапан. (A) Легочный клапан находится в закрытом положении с надлежащим образом растянутыми и коаптами (кругом). (В,В) Недостаточное давление легочного клапана. Обратите внимание, что листовки не являются должным образом коаптами(B)и что кольцевое кольцо не является круглым(C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Корреляция изображений блока образцов легочного клапана. (A)μCT объемный рендеринг виртуального среза и(B)физический блок образца после обрезки, взятый с помощью оптической микроскопии. Участки листовок легочного клапана обведены красным цветом и использовались в качестве ориентиров для корреляции двух различных методов визуализации. Шкала соответствует 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Корреляция изображений поперечного сечения легочного клапана. (A) Виртуальное поперечное сечение, генерируемое объемным рендерингом μCT. Красным полем обозначена область, которая была изображена с помощью SBF-SEM в (B). (B)Обзорные изображения с низким разрешением для корреляции с поперечным сечением μCT. Синее поле представляет местоположение(C)изображения SBF-SEM высокого разрешения. Шкалы соответствуют(B)100 мкм и(C)10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Сегментированная область легочного клапана, взятая SBF-SEM. Изображения поперечного сечения были сложены и скомпилированы для формирования 3D-представления локальной области легочного клапана. Метки были присвоены эндотелиальным клеткам (зеленый), клапанным интерстициальным клеткам (синий) и внеклеточным волокнам (желтый). Приблизительные размеры изображенной области составляют 30 мкм x 20 мкм x 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Трубчатый потенциал | 70 кВ |
| Ток трубки | 75 мкА |
| Режим фокусировки | M |
| Траектория | Круговой |
| Прогнозы/Революция | 2880 |
| Режим | 3040 x 3040 пикселей |
| Усредняющий | 1 |
| Время экспозиции | 1.0 с |
| Дистанция от образца до пистолета | 15 мм |
| Дистанция от детектора до пистолета | 725 мм |
| Размер вокселя | 2.9 мкм |
| Поле зрения | 8.4 x 8.4 x 6.3 мм |
Таблица S1: Параметры визуализации для μCT.
| Энергия посадки | 2 - 2,5 кВ |
| Ток пучка | 100 - 400 пА |
| Рабочее расстояние | 6.5 - 7 мм |
| Детектор | VS-DBS |
| Время пребывания | 1 - 2 мкс |
Таблица S2: Параметры визуализации для SBF-SEM.
Видео 1: Коррекция изображений наборов данных μCT и SBF-SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Удаление желудочков служит двум целям. Во-первых, подвергая сторону желудочка атмосферному давлению, тем самым нужно лишь прикладывать трансклапанное давление с артериальной стороны легочного клапана для закрытия, а во-вторых, обеспечивая стабильное основание для предотвращения скручивания легочного ствола. Во время наддувки легочный ствол растяжяется радиально и неполно, что делает его склонным к скручиванию, вызывая коллапс легочной ствола. Предварительная загрузка легочного клапана солевым раствором обеспечивает дополнительную проверку качества, чтобы убедиться, что давление является адекватным и если есть какие-либо утечки в системе. Действие первичного фиксатора быстрое, порядка нескольких секунд, и без гидростатической предварительной нагрузки солевым раствором легочный клапан фиксируется в случайной конформации. Без предварительной загрузки показатель успеха для закрытого легочного клапана составлял около 10-20%. На этапе предварительной загрузки показатель успеха был выше 90%.
Условия визуализации μCT и SBF-SEM были настроены для этого приложения. Легочный клапан при полном растяжении может быть толщиной менее 10 мкм. Как правило, для разрешения функции требуется порог в 3 вокселя; таким образом, объемные рендеры μCT сканировались с размером вокселя 2,9 мкм с полем зрения 8,4 x 8,4 x 6,3 мм. Меньшие размеры вокселя могут быть достигнуты в μCT, но это требует либо обрезки образца, либо более длительного времени сканирования. Меньший образец позволил бы получить более высокое разрешение, разместив его ближе к источнику рентгеновского излучения. Меньшие воксели также могут быть достигнуты путем размещения рентгеновского детектора дальше от образца; однако это уменьшит общий поток на детекторе и поставит под угрозу отношение сигнал/шум. В качестве справки, наши μCT-сканирования были примерно 5-6 ч в продолжительности. Конкретные условия визуализации, используемые в этом исследовании, приведены в Дополнительной таблице S1 и Дополнительной таблице S2).
У этого метода есть ограничения. Хирургическая часть этой процедуры требует опыта в обращении с животными, чтобы не поставить под угрозу структуру легочного клапана во время обработки. Кроме того, визуализация занимает много времени и требует нескольких инструментов визуализации. В качестве ориентира, визуализация высокого разрешения SBF-SEM составляла примерно 1 неделю непрерывной визуализации на глубине около 100 мкм. Это сложная задача для инструмента, чтобы оставаться стабильным и последовательным в течение длительных сеансов визуализации. Более практичным подходом было бы разработать стратегию отбора проб, чтобы точно изобразить неоднородность легочного клапана без временных вложений. Это еще предстоит определить. На сегодняшний день весь коррелятивный рабочий процесс был выполнен на одной мыши, но показал осуществимость и потенциал коррелятивного рабочего процесса при исследовании легочного клапана по шкалам длины.
Будущие итерации этого коррелятивного подхода могут включать эксперименты in situ μCT, так что один и тот же образец может подвергаться воздействию различного трансклапанного давления для удаления вариаций от образца к образцу. В настоящее время это ограничено стабильностью образцов и приборов для длительного времени сканирования, устройством наддувки, интегрированным в системы визуализации, и контрастом из-за аналогичных коэффициентов затухания воды и ткани. Кроме того, хотя трансклапанное давление отражало физиологические состояния, оно не является репрезентативным для пульсирующего потока, характерного для сердечного сокращения. Тем не менее, было показано, что скорость деформации мало влияет на конформацию листка. В будущих итерациях может оказаться более актуальным спроектировать устройство, способное управлять пульсирующим потоком9. Кроме того, большая часть работы требует ручного опроса образца, так как в настоящее время нет автоматизированного рабочего процесса. Расположение легочного клапана, обработка образцов в интересующей области, корреляция изображений и регистрация были выполнены вручную, но в будущем окажутся полезными для оптимизации обработки и смягчения субъективности.
Представленная работа представляет собой коррелятивный рабочий процесс для фиксации конформации легочного клапана и регистрации визуализации в μCT и SBF-SEM. Информация, полученная с помощью этого метода, в конечном итоге будет использована для определения базовой биомеханики легочного клапана на мышиных животных моделях, которые еще предстоит выяснить. Вальвулярная биомеханика может быть полностью описана ее геометрией и внеклеточным матриксом, но они находятся на двух разных масштабах длины. Для этого необходим точный контроль неоднородности клапана и точное отображение изображений внеклеточного матрикса с высоким разрешением относительно его расположения внутри легочного клапана. Этот коррелятивный рабочий процесс уже внедряется в другие эксперименты для проведения сравнений между мышами дикого типа и трансгенным остеогенезом несовершенных для сравнения различий фибриллярного внеклеточного матрикса и может быть легко экстраполирован на другие врожденные дефекты, такие как двустворчатое образование клапана19,20. Эта информация в сочетании с возможной протеомикой даст полную картину того, как биомеханика будет отличаться между двумя моделями мышиных животных.
Несмотря на то, что эта работа изображает только легочный клапан, этот рабочий процесс легко изменяется на другие гетерогенные, иерархические биологические системы. Мы использовали методы 3D-визуализации для захвата архитектурной организации ECM, но методы с более высоким разрешением, такие как просвечивающая электронная микроскопия или сканирующая просвечивающая электронная микроскопия, могут быть добавлены в зависимости от желаемой информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается, в частности, грантами R01HL139796 и R01HL128847 для CKB и RO1DE028297 и CBET1608058 для DWM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
References
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , CRC Press. (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
