Articolo metodologico

Modello di trapianto parziale di arti posteriori eterotopiche nei ratti

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DOI:

10.3791/62586

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9 giugno 2021

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1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Vascularized Composite Allotransplantation Laboratory, Center for Transplantation Sciences, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Service de Chirurgie Plastique, Hôpital Européen Georges Pompidou, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (APHP), Université de Paris

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo documento presenta un protocollo di trapianto di lembi osteomiocutaneo eterotopico parziale nei ratti e i suoi potenziali risultati nel follow-up a medio termine.

Abstract

Gli allotrapianti compositi vascolarizzati (VCA) rappresentano l'opzione di ricostruzione più avanzata per i pazienti senza possibilità chirurgiche autologhe dopo un difetto tissutale complesso. I trapianti di viso e mano hanno cambiato la vita dei pazienti sfigurati, dando loro un nuovo organo sociale estetico e funzionale. Nonostante i risultati promettenti, la VCA è ancora sottoperformata a causa delle comorbidità di immunosoppressione per tutta la vita e delle complicanze infettive. Il ratto è un modello animale ideale per studi in vivo che studiano le vie immunologiche e i meccanismi di rigetto dell'innesto. I ratti sono anche ampiamente utilizzati in nuove tecniche di conservazione dell'innesto di tessuto composito, compresi gli studi di perfusione e crioconservazione. I modelli utilizzati per la VCA nei ratti devono essere riproducibili, affidabili ed efficienti con bassa morbilità e mortalità postoperatoria. Le procedure di trapianto di arti eterotopici soddisfano questi criteri e sono più facili da eseguire rispetto ai trapianti di arti ortotopici. Padroneggiare i modelli microchirurgici dei roditori richiede una solida esperienza nella microchirurgia e nella cura degli animali. Qui è riportato un modello affidabile e riproducibile di trapianto parziale eterotopico di lembi osteomiocutanei nei ratti, gli esiti postoperatori e i mezzi di prevenzione di potenziali complicanze.

Introduzione

Negli ultimi due decenni, VCA si è evoluto come un trattamento rivoluzionario per i pazienti che soffrono di grave deturpazione tra cui viso1, amputazioni degli arti superiori2, pene3e altri difetti tissutali complessi4,5. Tuttavia, le conseguenze dell'immunosoppressione per tutta la vita ostacolano ancora un'applicazione più ampia di questi complessi interventi chirurgici ricostruttivi. La ricerca di base è fondamentale per migliorare le strategie anti-rigetto. Aumentare il tempo di conservazione del VCA è anche essenziale per migliorare la logistica del trapianto e aumentare il pool di donatori (poiché i donatori di VCA devono soddisfare più criteri rispetto ai donatori di organi solidi, tra cui tono della pelle, dimensioni anatomiche, sesso). In questo contesto, i trapianti di arti di ratto sono ampiamente utilizzati negli studi sul rigetto immunitario degli alloinnesti6,7,nuovi protocolli di induzione della tolleranza8e studi di conservazione9,10,11. Quindi, questi modelli VCA sono un elemento chiave da padroneggiare per la ricerca traslazionale VCA.

I lembi osteomiocutanei sono stati descritti in letteratura come modelli affidabili per studiare la VCA nei ratti8,12,13,14. Sebbene i trapianti ortotopici di arti interi consentano una valutazione a lungo termine della funzione dell'innesto, è una procedura che richiede tempo associata a tassi di morbilità e mortalità postoperatori più elevati14. Al contrario, i modelli di trapianto di arti eterotopici non sono funzionali, ma consentono studi riproducibili su VCA. Gli esiti postoperatori possono essere anticipati in modo affidabile prima dell'inizio di uno studio di trapianto di VCA su ratto. Questo studio riporta un modello di trapianto di lembo osteomiocutaneo eterotopico parziale nel ratto che include frequenti possibili esiti e complicanze che possono insorgere intra-operatoriamente e postoperatoriamente durante un periodo di follow-up di tre settimane.

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Protocollo

Tutti gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-protocollo 2017N000184) e l'Animal Care and Use Review Office (ACURO) hanno approvato tutti i protocolli sugli animali. Ratti Lewis maschi consanguinei (250-400 g) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti.

1. Chirurgia

  1. Anestetizzare i ratti lewis usando l'inalazione di isoflurano. Indurre l'anestesia con il 5% di isoflurano nella camera di induzione e mantenere l'anestesia con l'inalazione di isoflurano all'1,5-3% attraverso un cono respiratorio.
  2. Applicare lubrificante per gli occhi prima dell'intervento chirurgico nelle procedure di sopravvivenza. Rasare il sito chirurgico, trattare con crema depilatoria, scrub e drappeggio con tende sterili.
  3. Confermare l'anestesia totale con un test del pizzico della punta prima dell'incisione e regolarmente durante la procedura. Monitorare la frequenza cardiaca e respiratoria durante l'intera procedura. Per tutti gli interventi chirurgici, mantenere condizioni sterili utilizzando strumenti sterili, forniture, tende e guanti. Vedere la Tabella dei materiali per l'elenco degli strumenti utilizzati per le procedure.

2. Approvvigionamento parziale dell'arto posteriore del diritto del donatore

  1. Fai un'incisione circonferenziale della pelle sopra la caviglia al terzo distale della gamba.
  2. Scheletrare e cauterizzare l'arteria safena e il ramo terminale dell'arteria poplitea usando una pinna bipolare. Cauterizzare e tagliare i muscoli gastrocnemio, soleo, tibiale anteriore e bicipite femorale fino a quando l'osso tibiale non è esposto.
  3. Fai un'incisione di 2,5 cm nella piega inguinale destra. Sezionare il cuscinetto di grasso inguinale e ritrarlo distalmente per esporre i vasi femorali. Utilizzare un divaricatore a un amo per afferrare il legamento inguinale e una pinza di serraggio per tenere il cuscinetto di grasso inguinale distalmente.
    NOTA BENE: Il cuscinetto di grasso inguinale è incluso nella raccolta dell'arto parziale.
  4. Sezionare i vasi femorali, individualizzare i rami di Murphy (rami collaterali muscolari profondi di solito situati a metà strada tra il legamento inguinale e il ramo epigastrico) e ligate con 8-0 cravatte in nylon.
  5. Eparina al ratto donatore con 100 UI/kg di eparina, iniettata nella vena dorsale del pene utilizzando un ago da 27,5 G.
  6. Completare l'incisione cutanea intorno all'anca.
  7. Cauterizzare i muscoli bicipiti femorali e glutei superficiali usando una pinna bipolare. Cauterizzare e tagliare il nervo sciatico a metà lunghezza del femore. Esporre il femore prossimalmente a livello della cresta femorale posteriore.
    NOTA: i muscoli dell'adduttore e del quadricipite sono lasciati fuori dall'approvvigionamento. Il peduncole innominato è conservato.
  8. Vasi femorali ligate con fascette in nylon 8/0 a livello del legamento inguinale. Eseguire un'arteriotomia sull'arteria femorale appena sotto la legatura e dilatarsi per consentire l'inserimento di un angiocatetere da 24 G.
  9. Cauterizzare e tagliare il muscolo rimanente sotto il peduncolare, esponendo il lato anteriore del femore.
  10. Tagliare la tibia e il femore usando un tagliaosse il più vicino possibile e distalmente, rispettivamente (media lunghezza).
  11. Lavare l'arto posteriore parziale con 2 mL di eparina salina (100 UI/mL) per ottenere un chiaro deflusso venoso. Conservare sul ghiaccio in una garza sterile fino al trasferimento microvascolare (Figura 1).
  12. Mentre l'animale è in anestesia generale, eseguire l'eutanasia per dissanguamento fino a quando l'animale non mostra alcun segno di vita (nessun movimento respiratorio e nessun battito cardiaco).

figure-protocol-1
Figura 1: Ratto parziale arti posteriori raccolti. Un angiocate 24 G viene inserito nell'arteria femorale, pronto per il trasferimento microvascolare eterotopico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Chirurgia del ricevente

  1. Prima dell'incisione, radersi la parte posteriore del collo e somministrare buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg per via sottocutanea. Posizionare il ratto in posizione supina su una piastra riscaldante.
  2. Fai un'incisione di 2,5 cm nella piega inguinale destra. Sezionare il cuscinetto di grasso inguinale e reclinarlo distalmente per esporre i vasi femorali. Utilizzare un gancio per ritrarre il legamento inguinale e una pinza di serraggio per tenere il cuscinetto di grasso inguinale distalmente.
  3. Seziona i vasi femorali, individualizza i rami di Murphy e ligate con fascette di nylon 8/0.
  4. Ligate entrambi i vasi sopra i vasi epigastrici utilizzando fascette di nylon 8/0. Posizionare i morsetti dell'approssimazione prossimale e dilatare le estremità del vaso; risciacquare con eparina salina.
  5. Fai un'incisione sul fianco sinistro sopra l'anca e crea una tasca sottocutanea con un tunnel sottocutaneo alla piega inguinale.
    NOTA: L'incisione dell'inserto viene eseguita al di sopra della gamma di movimento dell'anca per garantire che l'animale mantenga un normale movimento degli arti posteriori. Inoltre, mantenere un ponte cutaneo tra l'inserto dell'innesto e il sito di trasferimento microvascolare consente una migliore fissazione dell'innesto (Figura 2).
  6. Posizionare la parte prossimale dell'arto parziale e il cuscinetto di grasso inguinale attraverso il tunnel sottocutaneo per il trasferimento microvascolare. Eseguire anastomosi venose e arteriose utilizzando suture di nylon 10/0. Rimuovere entrambi i morsetti dell'approssimante e osservare la rivascolarizzazione dell'arto. Eseguire un "test di mungitura" su entrambi i vasi per valutare la pervietà di ciascuna anastomosi.
    NOTA: Otto o nove suture sono solitamente necessarie per l'anastomosi venosa, 6 suture in media per l'anastomosi arteriosa.
  7. Fare un'incisione cutanea longitudinale sul lato mediale dell'arto trapiantato e inserire l'innesto. Rimuovere la pelle in eccesso dell'innesto e chiudere la ferita con suture separate e una sutura in esecuzione utilizzando suture 4/0 assorbibili.
  8. Suturare insieme i cuscinetti di grasso inguinale dell'arto trapiantato e del ricevente utilizzando due suture assorbibili separate e chiudere la piega inguinale alla fine dopo un ultimo controllo delle anastomosi microvascolari.
    NOTA: i cuscinetti di grasso inguinale vengono suturati strettamente per aggiungere uno strato protettivo di grasso sopra le anastomosi e garantire una posizione sicura dell'innesto e del suo peduncolo. Una chiusura meticolosa è migliore per la guarigione delle ferite; previene anche il sanguinamento residuo dalla ferita e diminuisce il rischio di automutilazione.
  9. Compensare la perdita di liquidi per via sottocutanea con 1-3 ml di soluzione salina in base alla quantità di sanguinamento perioperatorio.
  10. Posizionare un collare elisabettiano attorno al collo dell'animale e applicare 2 punti di sutura sciolti sulla pelle per mantenerla nella posizione corretta.
  11. Fermare l'inalazione di isoflurano e monitorare continuamente l'animale su un cuscinetto riscaldante fino a quando non è completamente cosciente e ambulatoriale.

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Figura 2: Immagine perioperatoria prima dell'incasso dell'arto osteomiocutaneo. Un ponte cutaneo di circa 1 cm è conservato tra l'incisione della piega inguinale e l'inserto dell'innesto sopra l'anca. L'innesto viene posto sotto il ponte, mantenendolo stabile per il trasferimento microvascolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Cura postoperatoria

  1. Monitorare l'animale due volte al giorno per 72 ore, poi una volta al giorno fino al giorno postoperatorio (POD) 7 e poi due volte a settimana.
    NOTA: il monitoraggio deve essere adattato alle condizioni dell'animale e dell'innesto (gli occhi pallidi potrebbero richiedere liquidi supplementari, colorazione della porfirina come indicatore del dolore animale, colore / temperatura anormale dell'innesto) e ulteriori cure devono essere discusse con il veterinario. È necessario un singolo alloggiamento per i ratti riceventi durante l'intero periodo di studio per evitare danni all'innesto.
  2. Eseguire l'analgesia con iniezione sottocutanea di buprenorfina e/o farmaco antinfiammatorio non steroideo secondo le linee guida IACUC.
  3. Valutare l'innesto ed eseguire quotidianamente l'esame fisico con le immagini utilizzando lo stesso dispositivo.
    NOTA: L'uso della crema per la depilazione sulla pelle dell'innesto è utile per valutare meglio il colore della pelle del trapianto.

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Risultati

In questo studio a operatore singolo, sono stati eseguiti 30 trapianti di arti parziali eterotopici singenici. Il successo è stato definito al giorno 21 postoperatorio come l'assenza di fallimento del VCA o complicazioni che richiedono l'eutanasia. La normale evoluzione dell'innesto è rappresentata in Figura 3. La durata media per l'approvvigionamento parziale dell'arto e l'innesto nel ricevente sono stati rispettivamente di 35 e 105 minuti; il tempo medio di ischemia è stato di 105 min. Dur...

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Discussione

Modelli di trapianto ortotopico di arti nei roditori sono stati descritti in letteratura15,16,17; tuttavia, richiedono una riparazione nervosa, un riattaccamento muscolare e una perfetta osteosintesi del femore, che può essere un passaggio molto difficile. Questi modelli sono anche associati a un più alto tasso di morbilità e mortalità neiroditori 14, specialmente nel follow-up a breve termine in quanto i...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno divulgazioni.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Ufficio dell'Assistente Segretario alla Difesa per gli Affari Sanitari attraverso il Programma di Ricerca Medica Diretto dal Congresso sotto il Premio No. W81XWH-17-1-0680. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
24 GA angiocatheterBD Insyte Autoguard381412
sutura 4-0 sutura nera monofilamento non assorbibileEthicon1667Utilizzato per suturare il collare E alla parte posteriore del collo
sutura 4-0 Vicryl Plus AntibattericoEthiconVCP496
Pinza per tessuti Adson, 11 cm, 1 x 2 denti con piattaforma di legaturaASSIASSI.
Corde bipolariASSI228000C
Monofilamento di poliammide nero USP 10-0, 4 mm 3/8cAROSurgicalT04A10N07-13Utilizzato per eseguire le anastomosi microvascolari
Buprenorfina HClPharmaceutical, Inc42023-179-01
Pinze dilatatriciStrumenti per la scienza fine (FST)18131-12
Forbici da dissezione 15 cm, manico rotondo diametro 8 mm, lama conica sottile e diritta 7 mm, modello LipshultzASSIASSI.
Doppi Micro Morsetti 5,5 x 1,5 mmStrumenti per la scienza fine (FST)18040-22
Collare elisabettianoBraintree ScientificEC-R1
Pinze lunghe 13,5 cm, manico piatto, larghe 9 mm Punte dritte diametro 0,1 mm (x2)ASSIASSI. JFL31
Halsey Micro Needle HolderStrumenti per la scienza fine (FST)12500-12
Soluzione di lavaggio con blocco dell'eparina, USP, 100 unità/mLBD PosiFlush306424
IsofluranoPatterson Veterinario14043-704-06
Pinze bipolari per gioiellieri antiaderente 11 cm, punta dritta, diametro della punta di 0,25 mmASSIASSI.
Lone Star Elastic StaysCooperSurgical3314-8GUtilizzato per ritrarre il legamento inguinale per la dissezione dei vasi femorali
Divaricatori autobloccanti Lone StarCooperSurgical3301G
Emostatici Micro-MosquitoStrumenti scientifici (FST)13010-12Utilizzato per ritrarre distalmente
il cuscinetto adiposo inguinalePorta aghi, manico rotondo da 15 cm, diametro 8 mm, ganascia curva superfine diametro punta 0,2 mm, senza bloccoASSIASSI. B1582
Sutura in nylon Monofilamento nero 8-0, 6,5 mm 3/8cEthilon2808GUtilizzato per legare i rami collaterali sui vasi femorali
Tronchesi ossee offsetStrumenti per la scienza fine (FST)16101-10
S& Morsetti vascolari a T 5,5 x 1,5 mmStrumenti per le scienze fini (FST)00398-02
Forbici WaltonStrumenti per le scienze fini (FST)14077-09
ATK26426SAS15RVLBPNS11223

Riferimenti

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