Summary
Salivkörtlar har föreslagits som en vävnad mål plats för genterapi, särskilt inom området vaccination genom genöverföring. Vi visar gen leverans i en icke-mänskliga primat modell med retrograd parotid infusion.
Abstract
Salivkörtlar är ett attraktivt vävnadsmål för genterapi med lovande resultat som redan leder till mänskliga prövningar. De är i sig kapabla att utsöndra proteiner i blodomloppet och är lättillgängliga, vilket gör dem potentiellt överlägsna vävnadsplatser för substitutionshormonproduktion eller vaccination genom genöverföring. Föreslagna metoder för gen leverans inkluderar transkutan injektion och bakåtsträvande infusion genom salivary kanaler. Vi visar hur man utför retrograd salivary gland infusion (RSGI) i icke-mänskliga primater. Vi beskriver de viktiga anatomiska landmärken inklusive identifiering av parotid papilla, en atraumatic metod för cannulating och tätning Stensens kanal med hjälp av grundläggande tandverktyg, polyeten slangar och cyanoakrylat och lämplig infusionshastighet. Även om detta är den minst traumatiska leveransmetoden, är metoden fortfarande begränsad av volymen som kan levereras (<0,5 ml) och risken för trauma till kanalen och körteln. Vi visar med fluoroskopi att en infusat kan levereras helt i körteln, och ytterligare visa genom immunohistokemi transduktion av en typisk vektor och uttryck av den levererade genen.
Introduction
Medan salivkörtlar är kända för sin exokrina produktion av saliv, har forskare länge erkänt sin förmåga att utsöndra proteiner direkt i blodomloppet1, vilket gör dem till ett potentiellt mål för genterapi för systemisk administrering, såsom ersättningshormoner eller antikroppsproduktion. Faktum är att salivkörtlar erbjuder flera fördelar jämfört med andra vävnadsmål, såsom den inneboende förmågan att producera proteiner för utsöndring (en egenskapsmuskler saknar), tung inkapsling som kan begränsa vektorspridning och väl differentierad vävnad som ger stabilitet för icke-integrerande vektorer. Dessutom, i händelse av en allvarlig biverkning, salivkörtlar är inte kritiska för livet och kan kirurgiskt avlägsnas. Även om de inte är omedelbart intuitiva, är parotidkörtlar också lättillgängliga från munnen genom deras huvudsakliga utsöndringskanal, Stensens kanal2.
Med tanke på fördelarna med salivvävnad för genterapi ökar intresset för att utforska detta vävnadsmål. Många studier har redan utförts på gnagare, hund och icke-mänskliga primatmodeller och minst en mänsklig klinisk prövning pågår3,4,5. För att ytterligare utforska och utveckla nyttan av detta vävnadsmål för genterapiändamål måste fler icke-mänskliga primatstudier utföras. Detta dokument beskriver en metod för att komma åt parotidkörtlarna genom Stensens kanal för att leverera en vektorerad gen för transduktion i den icke-mänskliga primatmodellen. För att synligt visa leveransen av infusate och anatomin av kanalen när den kommer in i körteln, fluoroskopi med hjälp av radiocontrast utfördes. För att visa framgångsrik transduktion av en vektor användes en Adenovirus serotyp 5 (Ad5) vektored egfp gen. Ad5 är en välbeskriven vektor som kan omvandla salivvävnad. Även om det är för immunogent för ultimat klinisk användning, valdes en Ad5 vektor för denna demonstrationsstudie för att säkerställa effektiv transduktion. Att utvärdera förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP) produktion är en väl beskriven metod för att visa framgångsrik transkription och översättning av en vektor gen efter transduktion och gjordes här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utfördes på Wake Forest School of Medicine Clarkson Campus för djurstudier. Den institutionella kommittén för djurs vård och användning (IACUC) rådfrågades av etiska skäl och detaljer om förfarandena lämnades in för granskning. Wake Forest IACUC godkände vårt studieprotokoll och alla procedurer gjordes enligt IACUC-godkända protokoll #A17-147.
1. Förbereda infusionsanordningen
- Skär storlek 10 Polyetenrör (PET10) i 25 cm längder med en sax.
- Märe PET10 vid 1 cm och 2 cm från ena änden med en svart markör.
- Förfyll 0,5 ml Ad5-EGFP-lösning (109 viruspartiklar/ml) till en 1 ml (tuberkulin) spruta.
- Skjut den omärkta änden av PET10-röret över 29-31 G nål fäst vid en spruta. Det är i allmänhet lättare att utföra den här uppgiften under förstoring.
- Ingjut lösningen i PET10 tills röret är helt fullt (synlig droppe i fri ände).
- Använd SKYDDSUTRUSTNING av full standard, inklusive kirurgiska scrubs, långärmad klänning, ogenomträngliga handskar, kirurgisk mask, ansiktsskydd, hårhuv och skoskydd.
2. Förbereda djuret
Cynomolgus makaker användes för videodemonstrationen. Anatomin hos andra icke-mänskliga och mänskliga primater är mycket lik, och protokollet bör översättas till andra arter.
- Injicera subkutant 0,05 mg/kg atropin 15 min före proceduren för att minimera salivensöndringar och optimera fördelningen och retentionen av infusatet.
- Ge anestesi med 5 ml sprutor med intramuskulärt ketamin/midazolam (10-15 mg/kg ketamin och 0,01-0,05 mg/kg midazolam). Bekräfta korrekt anestesi när det sederade djuret blir medvetslöst och inte kan reagera på stimuli.
3. Utföra proceduren
- Använd orala upprullningsdon för att hålla öppen mun.
- Placera gummidynan i ena änden av upprullningsdonet på den hårda gommen bakom de övre tänderna på sidan av munnen mittemot körteln som kommer att infunderas. Placera gummidynan i den andra änden på den nedre hunden på samma sida som övre upprullningsdonet. Låt försiktigt upprullningsdonets fjäderåtgärd expandera och öppna munnen.
- Identifiera parotid papilla, öppningen av Stensens kanal, på den bakre kinden, intill den övre2: a molaren. Detta visualiseras bäst med hjälp av tandslingor för förstoring.
- Vidga försiktigt parotidpapudern med den koniska dilatatorns punkt. Det är bäst att placera dilatatorns punkt i mitten eller öppningen av papillan och sedan försiktigt rotera den fram och tillbaka. Punkten ska långsamt komma in i papillan och vidga den över cirka 20-30 s av mild roterande.
- Sätt i PET10-slangen i den dilaterade parotidpacilen. Detta uppnås bäst genom att hålla den markerade änden av PET10-röret med pincett ca 0,5 cm från den distala änden och försiktigt sätta in rörspetsen i den dilaterade papillan.
- För försiktigt fram röret, som ofta underlättas av små roterande rörelser för att hjälpa röret att glida, följt av justering av pincetterna 0,5 cm proximalt till föregående grepp. Upprepa detta tills 2 cm-märket når parotidpalyillan.
- Applicera cyanoakrylat på kinden runt papillan och det insatta röret och vänta tills det torkar (ingen specifik mängd registrerad, precis tillräckligt för att försegla ingången till Stensens kanalpalja). Detta tar vanligtvis mindre än en minut och hjälper till att försegla parotid papilla och minska spill av infusera tillbaka i munhålan.
- Tryck långsamt på sprutinnehållet över 5 min med en hastighet av 100 μL/min. Denna långsamma infusionshastighet minimerar risken för kanalskada på grund av plötslig ökning av intradukttrycket.
- Lämna PET10 på plats i minst 5 minuter efter att infusionen är klar. Håll kanalen förseglad och låt infusatet förbli i parotidkörteln.
- Ta bort PET10 med skonsam dragkraft. Cyanoakrylaten kommer att dra sig loss med röret.
- Upprepa steg 3.2 till 3.8 på motsatt sida.
- Släpp långsamt orala upprullningsdon efter att båda parotiderna har infunderats och båda PET10-rören har tagits bort.
OBS: Hela proceduren för båda sidor bör ta mindre än 30 minuter.
4. Vård efter förfarandet
- När infusionen är klar och Stensens kanal har avkodas, observera djuren tills anestesieffekten avtar (vanligtvis mellan 20-30 min efter ingreppet).
- Erbjud djurdryckerna och sedan mat efter att de är helt vakna och återuppta rutinvård.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lyckad procedur, transduktion och transkription
Bild 1 visar parotid papilla intill2: a molaren på den bakre överlägsna kinden. Bilden visar också rätt placering av munstödet, en gummislut på den hårda gommen och den andra gummi änden på den ensidiga hunden. Figur 2 visar en bild tagen efter lyckad kannulering av parotidpapillan vid 2 cm-märket på PET10. Figur 3 visar en fluoroskopibild i ett ögonblick av en radiokontrastinfusion som demonstrerar förgrening av lösningen genom Stensens kanal och in i parotidkörteln. Denna fluoroskopiska bild utfördes för den enda avsikten att visa anatomi och fördelning av en infusate. Fluoroskopi krävs inte när du utför denna procedur för vektorleverans. Figur 4 visar EGFP immunostained i rött på histopatologi. Både duktal och acinar celler har färgats i rött, vilket indikerar framgångsrika transduktion och transkription i båda celltyperna. Sammanfattningsvis visar dessa fyra siffror lämpliga RSGI med visualisering av anatomi och transduktion av Ad5 vektoriserade EGFP.
Figur 1: Parotid papilla. Notera cirkeln på figuren som markerar parotid papilla intill2: a molaren på den bakre kinden. Observera också placeringen av munstödet, med en gummislut på den hårda gommen och det andra gummibandet på den nedre hunden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Parotid papilla cannulation av PET10. Notera 2 cm-märket på PET10-röret som är synligt vid parotidpalongen (pilspetsen), som ligger på den bakre kinden,intill den andra övre molaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Fluoroskopibild som visar diffusion till parotidkörtel. Notera förgrening i slutet av Stensens kanal (pilspets) eftersom den förgrenar sig till mindre kanaler i parotidkörteln (Cirkel). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Patologirutschbana av parotidkörtel. Anmärkning uttryck av EGFP (färgat i rött) av duktal/acinar parotid vävnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll om bakåtsträvande infusion i parotidkörteln genom Stensens kanal. Den beskrivna metoden ger vägledning som potentiellt kan användas av forskare som utforskar nyttan av salivvävnad som en plats för genterapi och andra applikationer.
Det finns flera kritiska steg för att säkerställa att proceduren blir framgångsrik. Först och främst bör alla förfarandemässiga steg slutföras varsamt. Kraftfull bracing av munnen kan resultera i mandibular subluxation. Kraftfull kannulering av parotidpalyillan eller snabb infusion av lösningen i Stensens kanal kan leda till akuta duktaltårar eller kronisk duktal stenos.
För det andra, se till att anestesi har administrerats och är effektiv. Utan korrekt anestesi kan inget av stegen lätt uppnås och risken för djur- och mänskliga skador ökar avsevärt. Vi valde intramuskulär anestesi med ketamin och midazolam, som är en standardregim i icke-mänskliga primatstudier6. Vi anser atropin vara viktigt för att minska salivary sekret under förfarandet, förbättra synligheten av anatomin och minska washout av infusate före transduktion7,8.
Ett steg som ofta är utmanande är den första kannuleringen och förskottet av PET10 in i parotid papilla och Stensens kanal. Skonsam rotation av PET10 under insättning underlättar dessa steg. Överdriven påt tryckning kan leda till duktalskador.
Förfarandet begränsas huvudsakligen av bräckligheten och storleken på vävnaden. Detta kräver mycket skonsam teknik och användning av förstoringsöglor och små verktyg för att säkerställa korrekt kannulering, förskott av slangar och leverans av infusatet. En annan potentiell begränsning är den mängd infusat som parotidkörtlarna kan rymma. Tidigare studier har infunderat en maximal volym på 0,5 ml i varje parotidkörtel, totalt 1 ml per djur6,9,10. Även om detta inte direkt påverkar själva förfarandet, beroende på läkemedelskoncentrationen i infusatet, kan det visa sig begränsa för en önskad fysiologisk effekt.
RSGI erbjuder det minst traumatiska alternativet om salivkörtelinfusion önskas. Alternativ såsom transkutan eller USA-guidad perkutan injektioner medför risk för ansiktsnervskada. Dessutom kan dessa förfaranden misslyckas med att uppnå tillräcklig distribution till hela körteln, medan RSGI använder kanalsystemet för att säkerställa distribution. Fluoroskopi utfördes med standard radiocontrast lösning endast för denna artikel för att visa att RSGI levererar en fullständig infusate med god distribution i hela körteln. Detta utfördes separat från den faktiska infusionen av Ad5 vektorn. Fluoroskopi och/eller annan röntgenavbildning som utförs under RSGI för att leverera genvektorer skulle inte vara till hjälp och rekommenderas inte.
När området för terapier genom genöverföring fortsätter att utvecklas, ökar salivkörtlarna som målvävnad redan popularitet2,5. Ponzio et al. erbjuder en bra recension om fördelarna med salivkörtlarna som mål för immunisering4. Som inkapslade, icke-vitala körtelvävnad som vi har visat är lättillgängliga, parotid körtlar utgör en idealisk genterapi plattform. RSGI erbjuder den minst traumatiska tekniken för genöverföring till körtlarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Cagney Gentry för hans audiovisuella stöd för att filma förfarandet. Vi vill också uppmärksamma Hefner VA medical center för akademiskt stöd i jakten på detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 µL U100 syringes with 30-gauge needles | Becton Dickinson | 328466 | fixed needle for less waste |
| Adhesive (e.g., Ethicon Dermabond) | Various | Cyanoacrylate adhesive to seal and keep the tubing in the duct during infusion. | |
| Atropine injectable solution | Patterson Veterinary | 07 869-6061 | Atropine inj. 0.54 mg/mL |
| BD Ultra-Fine Insulin Syringes 30G | Walmart | N/A | Avilable in 0.5 mL and 1.0 mL sizes. |
| Cyanoacrylate (medical glue) | Ethicon | DNX12 | Dermabond topical skin adhesive |
| Dental loops with light | Amazon (DDP) | B012M3IV80 | Used to enhance visualization of Stensen's duct papilla |
| Infant Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-137 | |
| Ketamine injectable solution | Patterson Veterinary | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 mg/mL |
| Lacrimal Dilator | Surgipro | SPOI-132 | Used to dialate the Stensen's duct. |
| Midazolam injectable solution | Patterson Veterinary | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| Pair of scissors | Amazon (DDP) | N/A | Used to cut PET10 tube |
| Polyethylene Tubing (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | Tubing connecting the 30G syringe and inserted into the duct. |
| Q-tips | Walmart | N/A | Used to spread cyanoacrylate on the cheek |
| Size 10 Polyethylene Tube (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | low density polyethylene tubing |
| Small Animal Mouth Opener | Amazon (DDP) | B01F3LVJXC | Used to keep the animal's mouth open. |
| Tweezers | Amazon (DDP) | N/A | Used to insert PET10 tube into Stenson's duct |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 7646-86-7 | Included in plasmid DNA infusates |
References
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4 (2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
