Visualizzazione della formazione di increspature a membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione

La macropinocitosi è un processo endocitico responsabile dell'internalizzazione di una grande quantità di fluido extracellulare e del suo contenuto attraverso la formazione di sporgenze dinamiche e guidate dall'actina della membrana plasmatica chiamate increspature di membrana¹. Molti di questi volant di membrana formano coppe che si chiudono e si fondono di nuovo sulla cellula e si separano dalla membrana plasmatica come grandi ed eterogenei endosomi intracellulari noti anche come macropinosomi¹. Sebbene la macropinocitosi sia indotta da fattori di crescita come il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e il fattore di crescita epidermico (EGF) in una vasta gamma di tipi di cellule, un ulteriore processo unico e dipendente dal calcio noto come macropinocitosi costitutiva è stato osservato anche nelle cellule immunitarie innate ^{2,3,4,5,6,7,8}.

La capacità delle cellule di internalizzare il materiale extracellulare attraverso la macropinocitosi ha dimostrato di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi fisiologici che vanno dall'assorbimento dei nutrienti alla cattura dei patogeni e alla presentazione dell'antigene ^9,10,11. Tuttavia, poiché questo processo non è selettivo e inducibile, è stato anche implicato in una serie di condizioni patologiche. Infatti, studi precedenti hanno suggerito che la macropinocitosi svolge un ruolo importante nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson, nel cancro, nella nefrolitiasi e nell'aterosclerosi 12,13,14,15,16. Inoltre, alcuni batteri e virus hanno dimostrato di utilizzare la macropinocitosi per entrare nelle cellule ospiti e indurre l'infezione^17,18. È interessante notare che la stimolazione della macropinocitosi può anche essere sfruttata per la somministrazione mirata di agenti terapeutici in varie condizioni di malattia^19,20.

Studi precedenti hanno esplorato la macropinocitosi quantificando marcatori in fase fluida internati con tag fluorescenti in assenza e presenza di agenti farmacologici che inibiscono la macropinocitosi utilizzando la citometria a flusso e l'imaging confocale^21,22. Gli strumenti farmacologici attualmente disponibili che inibiscono la macropinocitosi sono limitati e comprendono 1) inibitori della polimerizzazione dell'actina (citocalasina D e latrunculine), 2) bloccanti PI3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibitori degli scambiatori di idrogeno di sodio (NHE) (amiloride ed EIPA)5,14,15,23,24,25 . Tuttavia, poiché questi inibitori hanno effetti indipendenti dall'endocitosi, è difficile determinare selettivamente il contributo della macropinocitosi all'assorbimento del soluto e alla patogenesi della malattia, specialmente in vivo²¹.

La microscopia elettronica a scansione (SEM) è un tipo di microscopio elettronico che produce immagini ad altissima risoluzione di cellule utilizzando un fascio focalizzato di elettroni²⁶. Nella ricerca sulla macropinocitosi, l'imaging SEM è considerato la tecnica gold standard per visualizzare le caratteristiche topografiche e morfologiche della membrana plasmatica, quantificare la formazione di volant di membrana e studiare la loro progressione verso l'internalizzazione dei macropinosomi. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione combinata con la quantificazione dell'assorbimento del soluto, in presenza e assenza di bloccanti della macropinocitosi, fornisce una strategia affidabile per esaminare l'internalizzazione del soluto macropinocitotico in vitro. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato su come preparare le cellule per il SEM, visualizzare la superficie cellulare, quantificare la formazione di volant ed esaminare i loro progressi verso la chiusura della coppa e l'internalizzazione dei macropinosomi.

NOTA: Di seguito è riportato un protocollo generale utilizzato per quantificare la formazione di increspature di membrana nei macrofagi RAW 264.7 utilizzando la microscopia SEM. L'ottimizzazione può essere necessaria per diversi tipi di celle.

1. Linea cellulare e coltura cellulare

1. Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO₂. Sostituisci i substrati di crescita a giorni alterni.
2. Quando le cellule diventano confluenti all'80%, lavare la piastra due volte usando PBS sterile.
3. Staccare le cellule aggiungendo 1.000 μL di tripsina-EDTA allo 0,5% e incubare la piastra di coltura cellulare per 3-5 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C.
4. Esaminare la piastra al microscopio ottico per confermare la dissociazione cellulare. Aggiungere 10 ml di substrati di crescita contenenti il 10% di FBS per inattivare la tripsina.
5. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendare delicatamente le cellule nel terreno di coltura cellulare completo e determinare il numero di cellule e la vitalità utilizzando la colorazione Trypan Blue (0,4%).
   NOTA: la vitalità cellulare minima raccomandata per questo esperimento è >90%.
6. Posizionare le coperture di vetro sterile nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti usando una pinza autoclavata. Seminare le cellule su coverslips ad una densità di 1 x 10⁶ cellule/mL e incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO₂.
7. Cambiare i mezzi di ciascun pozzetto con mezzi completi freschi da 500 μL prima del trattamento. Pretrattare i macrofagi con veicolo (DMSO o altri solventi usati per sciogliere l'EIPA) o l'inibitore della macropinocitosi 5-(N-etil-N-isopropil)-Amiloride (EIPA, 25 μM²¹) per 30 min.
8. Trattare le cellule con veicolo e stimolatori della macropinocitosi per promuovere l'arruffamento della membrana: phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min²¹) e fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 100 ng / mL, 30 min³).
   NOTA: inibitori alternativi [ad esempio, latrunculina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] e stimolatori [ad esempio, fattore di crescita epidermico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] della macropinocitosi possono essere utilizzati anche per caratterizzare la macropinocitosi nei macrofagi e in altri tipi di cellule^{16,27, 28,29}. Le cellule possono richiedere la fame sierica durante la notte prima del trattamento con stimolatori fisiologici della macropinocitosi. È importante notare che le concentrazioni e i tempi di incubazione più efficaci dovranno essere determinati per stimolare la macropinocitosi in altri tipi di cellule.

2. Fissazione SEM

1. Dopo il trattamento, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare due volte i coperchi con PBS ghiacciato.
2. Fissare le cellule (4% paraformaldeide e 2% glutaraldeide in cacodilato di sodio 0,1 M) per 30 minuti a temperatura ambiente, seguite da incubazione notturna nel fissativo a 4 °C.
3. Lavare e incubare delicatamente le coperture con 500 μL dei seguenti reagenti senza disturbare il monostrato cellulare.
   1. Lavare una volta in cacodilato di sodio 0,1 M e incubare per 15 minuti.
   2. Lavare due volte con dH₂O con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   3. Lavare due volte con etanolo al 25% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   4. Lavare due volte con etanolo al 50% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   5. Lavare due volte con etanolo al 75% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   6. Lavare due volte con etanolo all'80% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   7. Lavare due volte con etanolo al 95% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
   8. Lavare due volte con etanolo al 100%. Eseguire 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
      NOTA: la sostituzione /sostituzione dei reagenti deve essere effettuata rapidamente per evitare l'essiccazione all'aria delle celle. I coverslip possono essere lasciati in etanolo al 100% per diversi giorni a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, aggiungere ulteriore etanolo al 100% e coprire i pozzetti con parafilm per evitare l'essiccazione all'aria del campione.

3. Punto critico di asciugatura

1. Posizionare i coverslip in un essiccatore a punto critico e coprire con etanolo al 100%. Premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio CO₂ .
2. Premere il pulsante Cool per circa 30 s fino a quando la temperatura non scende a 0 °C. Premere il pulsante Riempi finché non viene visualizzata una bolla nella finestra della camera.
3. Premere il pulsante Purge fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare. Premere nuovamente il pulsante Cool fino a quando la temperatura non scende a 0 °C.
4. Reprimere i pulsanti Fill e Purge per spegnerli e chiudere il serbatoio CO₂ . Reprimi il pulsante Cool per spegnerlo e premi il pulsante Heat .
5. Impostare la temperatura a 42 °C e la pressione a 1.200 psi. Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante Al vivo per consentire alla pressione di diminuire lentamente.
6. Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 psi, premere il pulsante di sfiato e attendere che la pressione scenda a 0 psi. Spegnere l'essiccatore del punto critico e rimuovere i coperchi.
7. Montare i coverslip su supporti per campioni di alluminio SEM utilizzando linguette adesive in carbonio e soggetti a rivestimento sputter utilizzando oro / palladio in un rivestimento sputter.
8. Accendi il pulsante di accensione e attendi che il vuoto raggiunga i 30 mTorr. Lavare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario.
9. Una volta che il vuoto aumenta a 200 mTorr spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga 30 mTorr. Ripetere questo passaggio 3 volte.
10. Premere il pulsante Timer e regolare la manopola Tensione fino a quando l'indicatore non legge 10 mA. Rimuovere le coperture rivestite dalla camera.
    NOTA: seguire le istruzioni del produttore per eseguire l'essiccazione del punto critico e il rivestimento sputter del campione.

4. Imaging e quantificazione

1. Inserire i coverslip del campione nella camera di un microscopio elettronico a scansione. Chiudi la porta e premi il pulsante Evac .
2. Aprire il software operativo SEM. Impostare la tensione di accelerazione a 15 kv e la distanza di lavoro a 10 mm.
3. Premere il pulsante Coordinate e spostarsi all'interno del controller finché le celle non vengono visualizzate al centro della schermata di osservazione. Imposta l'ingrandimento su 3.500x e visualizza l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto.
   NOTA: utilizzare un livello di ingrandimento più elevato (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica in modo più dettagliato.
4. Scatta immagini da almeno 10 posizioni casuali sui coverslip, assicurandoti che ogni campo microscopico contenga più celle. Salva le immagini come file .tif.
5. Dalle immagini, individuare le increspature della membrana, definite come pieghe sporgenti simili a coperte della membrana plasmatica, con una dimensione superiore a 500 nm (Figura 1). Contare il numero di volant per cella.
   NOTA: le volant a forma di C sono state identificate come sporgenze di membrana curve che non si fondevano sulle loro estremità laterali [(Figura 1 (trattamento M-CSF) e Figura 2B]. Le volant circolari a membrana fuse, prima della loro chiusura, sono state identificate come coppe macropinocitotiche (Figura 2C).
6. Normalizzare il numero di volant di membrana al numero totale di cellule nel campo microscopico valutato. Ripetere questa analisi per i campioni di ciascun gruppo.

Qui, descriviamo i risultati della tecnica presentata. Le immagini SEM rappresentative mostrate nella Figura 1 mostrano la formazione di volant di membrana nei macrofagi RAW 264.7 dopo trattamento con PMA e M-CSF. Le immagini sono state prima catturate con un ingrandimento di 3.500x per scopi di quantificazione e poi a livelli più elevati di ingrandimento (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica a maggiori dettagli. Pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropinocitosi EIPA attenuato formazione di increspature di membrana (Figura 1). Le attività della membrana plasmatica associate alla macropinocitosi possono essere suddivise in cinque fasi consecutive: 1) inizio dell'arruffamento della membrana, 2) circolarizzazione, 3) formazione della tazza, 4) chiusura della tazza e 5) internalizzazione del fluido extracellulare e dei suoi soluti associati tramite formazione di macropinosomi. La Figura 2 mostra immagini rappresentative di queste attività morfologicamente distinte della membrana plasmatica dopo stimolazione M-CSF. Grandi volant simili a fogli (Figura 2A), volant circolari a forma di C (Figura 2B) e coppe macropinocitiche (Figura 2C) sono stati catturati con un ingrandimento da 6.000x a 7.000x. La microscopia elettronica a scansione può essere utilizzata per fornire immagini ad alta risoluzione della superficie cellulare, ma non può essere utilizzata per visualizzare macropinosomi interiorizzati. La quantificazione delle increspature di membrana dopo il trattamento con PMA e M-CSF è mostrata nella Figura 3. La formazione di macropinosomi può essere confermata da tecniche di imaging alternative, compresa la microscopia confocale, come mostrato nella Figura 4. Infine, la quantificazione SEM dell'arruffamento della membrana dovrebbe essere integrata dalla quantificazione della citometria a flusso di un marcatore fluorescente in fase fluida (ad esempio, FITC o Texas red-dextran) per confermare la stimolazione della macropinocitosi (Figura 5).

Figura 1: Immagini al microscopio elettronico a scansione di macrofagi RAW 264.7. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) per stimolare l'arruffamento della membrana. Le immagini a destra mostrano un ingrandimento maggiore della superficie cellulare. Frecce rosse: increspature a membrana. Freccia verde: volant a forma di C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fasi morfologiche della macropinocitosi catturate mediante microscopia elettronica a scansione. I macrofagi RAW 264.7 sono stati trattati con M-CSF (100 ng / mL) per 30 minuti e le cellule sono state elaborate per l'imaging SEM. (A) protrusione di membrana simile a un foglio, (B) volant di membrana a forma di C e (C) coppa macropinocitica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Quantificazione della formazione di increspature di membrana. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) per stimolare l'arruffamento della membrana. Il grafico a barre mostra il numero di volant di membrana normalizzati al numero totale di cellule (n = 3). I dati rappresentano la media ± SEM. ANOVA unidirezionale; *p < 0,05 vs. veicolo, #p < 0,05 vs. trattamento PMA o M-CSF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Formazione di macropinosomi. Le cellule sono state pre-trattate con PMA per 30 minuti e incubate con texas rosso-destrano (25 μg / mL, rosso) e FM4-64 (5 μg / mL, verde) per 10 minuti. L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale. Frecce blu: increspature di membrana, frecce gialle: macropinosoma contenente texas rosso-destrano, frecce verdi: macropinosomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Quantificazione della macropinocitosi. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM) e FITC-destrano (100 μg/mL; 70.000 MW) per 2 ore. Il grafico a barre mostra il cambiamento medio di piega dell'intensità di fluorescenza (IFM) normalizzato al trattamento del veicolo (n = 3, eseguito in triplicati). I dati rappresentano la media ± SEM. ANOVA unidirezionale; *p < 0,05 vs veicolo, #p < 0,05 vs PMA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.