Visualizzazione della formazione di increspature a membrana utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Summary

La macropinocitosi è un processo endocitico altamente conservato avviato dalla formazione di proiezioni di membrana simili a fogli ricchi di F-actina, noti anche come volant di membrana. L'aumento del tasso di internalizzazione del soluto macropinocitotico è stato implicato in varie condizioni patologiche. Questo protocollo presenta un metodo per quantificare la formazione di volant di membrana in vitro utilizzando la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

L'arruffamento della membrana è la formazione di sporgenze di membrana plasmatica mobile contenenti una rete di filamenti di actina appena polimerizzati. Le volant di membrana possono formarsi spontaneamente o in risposta a fattori di crescita, citochine infiammatorie e esteri di forbolo. Alcune delle sporgenze di membrana possono riorganizzarsi in volant circolari di membrana che si fondono ai loro margini distali e formano tazze che si chiudono e si separano nel citoplasma come vacuoli grandi ed eterogenei chiamati macropinosomi. Durante il processo, i volant intrappolano il fluido extracellulare e i soluti che si interiorizzano all'interno dei macropinosomi. La microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione (SEM) è una tecnica di imaging comunemente usata per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche chiuse sulla superficie cellulare. Il seguente protocollo descrive le condizioni di coltura cellulare, la stimolazione della formazione di volant di membrana in vitro e come correggere, disidratare e preparare le cellule per l'imaging utilizzando SEM. Sono inoltre descritti la quantificazione dell'increspamento della membrana, la normalizzazione dei dati e gli stimolatori e gli inibitori della formazione di volant di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della macropinocitosi nei processi fisiologici e patologici, studiare nuovi bersagli che regolano la formazione di increspature di membrana e identificare stimolatori fisiologici ancora non caratterizzati e nuovi inibitori farmacologici della macropinocitosi.

Introduction

La macropinocitosi è un processo endocitico responsabile dell'internalizzazione di una grande quantità di fluido extracellulare e del suo contenuto attraverso la formazione di sporgenze dinamiche e guidate dall'actina della membrana plasmatica chiamate increspature di membrana¹. Molti di questi volant di membrana formano coppe che si chiudono e si fondono di nuovo sulla cellula e si separano dalla membrana plasmatica come grandi ed eterogenei endosomi intracellulari noti anche come macropinosomi¹. Sebbene la macropinocitosi sia indotta da fattori di crescita come il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e il....

Protocol

NOTA: Di seguito è riportato un protocollo generale utilizzato per quantificare la formazione di increspature di membrana nei macrofagi RAW 264.7 utilizzando la microscopia SEM. L'ottimizzazione può essere necessaria per diversi tipi di celle.

1. Linea cellulare e coltura cellulare

1. Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO₂. Sostituisci i substrati di crescita a giorni alterni.
2. Quando le cellule diven....

Results

Qui, descriviamo i risultati della tecnica presentata. Le immagini SEM rappresentative mostrate nella Figura 1 mostrano la formazione di volant di membrana nei macrofagi RAW 264.7 dopo trattamento con PMA e M-CSF. Le immagini sono state prima catturate con un ingrandimento di 3.500x per scopi di quantificazione e poi a livelli più elevati di ingrandimento (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica a maggiori dettagli. Pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropin.......

Discussion

L'attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. Sebbene l'attuale protocollo si concentri sui macrofagi, gli studi hanno dimostrato che la formazione di volant di membrana si verifica anche su vari altri tipi di cellule tra cui cellule dendritiche, fibroblasti, neuroni e cellule tumorali 11,12,14,21,30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% Tripsina-EDTA	Gibco	15400-054
2% Glutaraldeide	Microscopia Elettronica Scienze	16320
4% Paraformaldeide	Santa Cruz Biotechnology	281692
5-(N-etil-N-isopropil)-Amiloride	Sigma Life Science	A3085
Accuri C6 Citometro
a flussoLinguette adesive al carbonio Microscopia	elettronica Scienze	77825-09
Dimetil solfossido	Corning	25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24 pozzetti Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate	Falcon	353047
Siero fetale bovino	Gemini Bio	900-108
FitC-destrano	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i Incubatore a CO2	Thermo Fisher Scientific	51026282
Hummer Modello 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR microscopio			elettronico a scansione
Vetro di copertura del microscopio	Thermo Fisher Scientific	12-545-82
Penna Strep	Gibco	15140-122
forbolo 12-miristato 13-acetato	Millipore Sigma	524400
RAW 264.7 macrofago	ATCC	ATCC TIB-71
Umano ricombinante M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 Essiccatore per punti critici	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM Alluminio Campione Monta	Microscopia elettronica Scienze	75220
Microscopia elettronica con cacodilato di sodio	Scienze	12300
Texas red-dextra	Thermo Fisher Scientific	D1864
Soluzione blu di tripano	Thermo Fisher Scientific	15250061
			confocale Zeiss LSM 780