Summary
Макропиноцитоз представляет собой высококонсервативный эндоцитарный процесс, инициируемый образованием F-актин-богатых листообразных мембранных проекций, также известных как мембранные оборки. Повышенная скорость макропиноцитотической интернализации растворенного вещества была вовлечена в различные патологические состояния. Этот протокол представляет собой метод количественной оценки образования мембранных оборок in vitro с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Abstract
Взъерошение мембраны представляет собой образование подвижных выступов плазматической мембраны, содержащих сетку из вновь полимеризованных актиновых нитей. Оборки мембран могут образовываться спонтанно или в ответ на факторы роста, воспалительные цитокины и сложные эфиры форбола. Некоторые из протрузий мембраны могут реорганизоваться в круглые оборки мембраны, которые сливаются на своих дистальных краях и образуют чашечки, которые закрываются и отделяются в цитоплазму в виде больших, гетерогенных вакуолей, называемых макропиносомами. Во время процесса оборки захватывают внеклеточную жидкость и растворенные вещества, которые интернализируются в макропиносомах. Сканирующая электронная микроскопия с высоким разрешением (SEM) является широко используемым методом визуализации для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборков, круговых выступов и закрытых макропиноцитарных чашек на поверхности клетки. Следующий протокол описывает условия клеточной культуры, стимуляцию образования мембранных рюшей in vitro, а также способы фиксации, обезвоживания и подготовки клеток к визуализации с использованием SEM. Также описана количественная оценка взъерошивания мембраны, нормализация данных, а также стимуляторы и ингибиторы образования мембранных рюшей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о роли макропиноцитоза в физиологических и патологических процессах, исследовать новые мишени, регулирующие образование мембранных оборок, и выявить еще не охарактеризованные физиологические стимуляторы, а также новые фармакологические ингибиторы макропиноцитоза.
Introduction
Макропиноцитоз представляет собой эндоцитарный процесс, ответственный за интернализацию большого количества внеклеточной жидкости и ее содержания путем образования динамических и актин-управляемых протрузий плазматической мембраны, называемых мембранными оборками1. Многие из этих мембранных оборок образуют чашечки, которые закрываются и сливаются обратно в клетку и отделяются от плазматической мембраны в виде больших, гетерогенных внутриклеточных эндосом, также известных как макропиносомы1. Хотя макропиноцитоз индуцируется факторами роста, такими как макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и эпидермальный фактор роста (EGF) в широком диапазоне типов клеток, дополнительный уникальный, кальций-зависимый процесс, известный как конститутивный макропиноцитоз, также наблюдался во врожденных иммунных клетках 2,3,4,5,6,7,8.
Было показано, что способность клеток интернализировать внеклеточный материал посредством макропиноцитоза играет важную роль в различных физиологических процессах, начиная от поглощения питательных веществ до захвата патогенов и представления антигена 9,10,11. Однако, поскольку этот процесс является неселективным и индуцируемым, он также был вовлечен в ряд патологических состояний. Действительно, предыдущие исследования показали, что макропиноцитоз играет важную роль в болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, раке, нефролитиазе и атеросклерозе 12,13,14,15,16. Кроме того, было показано, что некоторые бактерии и вирусы используют макропиноцитоз, чтобы проникнуть в клетки-хозяева и вызвать инфекцию17,18. Интересно, что стимуляция макропиноцитоза может быть также использована для адресной доставки терапевтических средств при различных заболеваниях19,20.
Предыдущие исследования изучали макропиноцитоз путем количественной оценки интернализованных флуоресцентно помеченных маркеров жидкой фазы в отсутствие и присутствие фармакологических агентов, которые ингибируют макропиноцитоз с использованием проточной цитометрии и конфокальной визуализации21,22. Доступные в настоящее время фармакологические средства, ингибирующие макропиноцитоз, ограничены и включают в себя 1) ингибиторы полимеризации актина (цитохалазин D и латрункулины), 2) блокаторы PI3K (LY-290042 и wortmannin) и 3) ингибиторы теплообменников натрия водорода (NHE) (амилорид и EIPA)5,14,15,23,24,25 . Однако, поскольку эти ингибиторы обладают независимыми от эндоцитоза эффектами, трудно выборочно определить вклад макропиноцитоза в поглощение растворенного вещества и патогенез заболевания, особенно in vivo21.
Сканирующая электронная микроскопия (SEM) - это тип электронного микроскопа, который производит изображения клеток со сверхвысоким разрешением с использованием сфокусированного пучка электронов26. В исследованиях макропиноцитоза визуализация SEM рассматривается как метод золотого стандарта для визуализации топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны, количественной оценки образования мембранных оборок и исследования их прогрессирования в направлении интернализации макропиносом. Кроме того, сканирующая электронная микроскопия в сочетании с количественной оценкой поглощения растворенного вещества в присутствии и отсутствии блокаторов макропиноцитоза обеспечивает надежную стратегию для изучения интернализации макропиноцитотического растворенного вещества in vitro. В этой статье представлен подробный протокол о том, как подготовить клетки к SEM, визуализировать поверхность клеток, количественно оценить образование рюшей и изучить их прогресс в направлении закрытия чашки и интернализации макропиносом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен общий протокол, используемый для количественной оценки образования мембранных оборков в макрофагах RAW 264.7 с использованием микроскопии SEM. Оптимизация может потребоваться для различных типов клеток.
1. Клеточная линия и клеточная культура
- Выращивайте макрофаги RAW 264,7 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco, дополненные 10% (об/об) термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Заменяйте питательные среды через день.
- Когда клетки станут на 80% сливающимися, промыть пластину два раза, используя стерильный PBS.
- Отделяют клетки путем добавления 1000 мкл 0,5% трипсина-ЭДТА и инкубируют пластину культуры клеток в течение 3-5 мин в увлажненном инкубаторе при 37 °C.
- Исследуйте пластину под световым микроскопом, чтобы подтвердить диссоциацию клеток. Добавьте 10 мл питательной среды, содержащей 10% FBS, чтобы инактивировать трипсин.
- Собрать клеточную суспензию в коническую трубку объемом 50 мл и центрифугу при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно повторно суспендируйте клетки в полной питательной среде клеток и определите количество клеток и жизнеспособность с помощью окрашивания Trypan Blue (0,4%).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая минимальная жизнеспособность клеток для этого эксперимента составляет >90%. - Поместите стерильные стеклянные крышки в колодцы из 24-луночной пластины с помощью автоклавных щипцов. Засейте клетки на покровные листы плотностью 1 х 106 клеток/мл и инкубируйте пластину в течение ночи в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
- Перед обработкой замените среду каждой лунки на свежую полную среду объемом 500 мкл. Предварительно обработать макрофаги носителем (ДМСО или другими растворителями, используемыми для растворения EIPA) или ингибитором макропиноцитоза 5-(N-этил-N-изопропил)-Амилоридом (EIPA, 25 мкМ21) в течение 30 мин.
- Обрабатывайте клетки носителями и стимуляторами макропиноцитоза для содействия взъерошению мембран: форбол 12-миристат 13-ацетат (PMA, 1 мкМ, 30 мин21) и макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF, 100 нг/мл, 30 мин3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативные ингибиторы [например, латрункулин А (1 мкМ, 30 мин) или цитохалазин D (1 мкМ, 30 мин)] и стимуляторы [например, эпидермальный фактор роста (EGF, 100 нг/мл, 10 мин) или тромбоцитарный фактор роста (PDGF, 100 нг/мл, 15 мин)] макропиноцитоза могут также использоваться для характеристики макропиноцитоза в макрофагах и других типах клеток16,27, 28,29. Клеткам может потребоваться ночное сывороточное голодание перед лечением физиологическими стимуляторами макропиноцитоза. Важно отметить, что наиболее эффективные концентрации и время инкубации должны быть определены для стимуляции макропиноцитоза в других типах клеток.
2. Фиксация SEM
- После обработки дважды аспирируйте среду из колодцев и промывайте крышки ледяными ПБС.
- Фиксируют клетки (4% параформальдегида и 2% глутаральдегида в 0,1 М какодилата натрия) в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей ночной инкубацией в фиксаторе при 4 °С.
- Аккуратно промыть и инкубировать покровы с 500 мкл следующих реагентов, не нарушая клеточный монослой.
- Промыть однократно в 0,1 М какодилата натрия и инкубировать в течение 15 мин.
- Дважды промыть с dH2O с 10 мин инкубации в каждой стирке.
- Дважды промыть 25% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
- Дважды промыть 50% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
- Дважды промыть 75% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
- Дважды промыть 80% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
- Дважды промыть 95% этанолом с 10 мин инкубации в каждой промывке.
- Дважды промыть 100% этанолом. Выполняйте 10 мин инкубации в каждой стирке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замена/замена реагентов должна производиться быстро, чтобы предотвратить высыхание клеток на воздухе. Покровные листы можно оставлять в 100% этаноле в течение нескольких дней при 4 °C. Для длительного хранения добавьте дополнительно 100% этанол и накройте колодцы парапленкой, чтобы предотвратить воздушную сушку образца.
3. Сушка в критической точке
- Поместите крышки в сушилку критической точки и накройте 100% этанолом. Нажмите кнопку питания и откройте резервуар CO2 .
- Нажимайте кнопку Cool в течение примерно 30 с, пока температура не снизится до 0 °C. Нажимайте кнопку «Заполнить», пока в окне камеры не появится пузырь.
- Нажимайте кнопку Purge до тех пор, пока запах этанола из выхлопных газов продувки не исчезнет. Нажмите кнопку Cool еще раз, пока температура не снизится до 0 °C.
- Нажмите кнопки «Заполнить» и «Очистить », чтобы выключить их и закрыть резервуар CO2 . Нажмите кнопку Cool , чтобы выключить ее, и нажмите кнопку Heat .
- Установите температуру на уровне 42 °C и давление на уровне 1 200 фунтов на квадратный дюйм. Как только давление и температура стабилизируются, нажмите кнопку «Выпуск за обрез », чтобы давление медленно снижалось.
- Как только давление в камере достигнет 150 фунтов на квадратный дюйм, нажмите кнопку Vent и подождите, пока давление не снизится до 0 фунтов на квадратный дюйм. Выключите сушилку в критической точке и снимите крышки.
- Монтируйте обшивки на алюминиевые крепления SEM с помощью карбоновых клеевых вкладок и подвергайте напылянию покрытия с использованием золота / палладия в напыляющемся покрытии.
- Включите кнопку питания и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Промывайте камеру, чтобы удалить влагу и воздух, выключив газовый выключатель и повернув газовый клапан Fine против часовой стрелки.
- Как только вакуум увеличится до 200 мТорр выключите газовый выключатель и подождите, пока вакуум не достигнет 30 мТорр. Повторите этот шаг 3 раза.
- Нажмите кнопку «Таймер» и отрегулируйте ручку напряжения до тех пор, пока датчик не покажет 10 мА. Снимите покрытые оболочкой чехлы из камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя для выполнения сушки в критических точках и напыления покрытия образца.
4. Визуализация и количественная оценка
- Вставьте образцы крышки в камеру сканирующего электронного микроскопа. Закройте дверь и нажмите кнопку Evac .
- Откройте операционное программное обеспечение SEM. Установите ускоряющее напряжение на 15 кВ и рабочее расстояние на 10 мм.
- Нажмите кнопку «Координаты» и перемещайтесь вокруг контроллера, пока ячейки не появятся в центре экрана наблюдения. Установите увеличение в 3 500 раз и создайте образец, нажав кнопку «Фото».
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте более высокий уровень увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану более подробно. - Делайте снимки по крайней мере из 10 случайных мест на крышках, убедившись, что каждое микроскопическое поле содержит несколько клеток. Сохраняйте изображения в виде .tif файлов.
- На снимках найдите мембранные оборки, определяемые как выступающие одеялоподобные складки плазматической мембраны, размером более 500 нм (рисунок 1). Подсчитайте количество оборок на ячейку.
ПРИМЕЧАНИЕ: С-образные оборки были идентифицированы как изогнутые мембранные выступы, которые не сливались на их боковых концах [(Рисунок 1 (обработка M-CSF) и Рисунок 2B]. Плавленые кольцевые мембранные оборки до их закрытия были идентифицированы как макропиноцитотические чашки (рисунок 2C). - Нормализуйте количество оборок мембраны до общего числа клеток в оцениваемом микроскопическом поле. Повторите этот анализ для образцов из каждой группы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы опишем результаты представленной методики. Репрезентативные изображения SEM, показанные на рисунке 1 , демонстрируют образование мембранных оборок в макрофагах RAW 264.7 после обработки PMA и M-CSF. Изображения были сначала сделаны с увеличением 3 500x для целей количественной оценки, а затем на более высоких уровнях увеличения (от 8 500x до 16 000x), чтобы показать плазматическую мембрану в более деталях. Предварительная обработка макрофагов ингибитором макропиноцитоза EIPA ослабляет образование мембранных оборков (фиг.1). Активность плазматической мембраны, связанная с макропиноцитозом, может быть разделена на пять последовательных этапов: 1) инициирование взъерошения мембраны, 2) циркуляризация, 3) образование чашечек, 4) закрытие чашечки и 5) интернализация внеклеточной жидкости и связанных с ней растворенных веществ через образование макропиносом. На рисунке 2 показаны репрезентативные изображения этих морфологически различных активностей плазматической мембраны после стимуляции M-CSF. Большие листовидные оборки (рисунок 2A), круглые С-образные оборки (рисунок 2B) и макропиноцитарные чашечки (рисунок 2C) были захвачены с увеличением от 6000x до 7000x. Сканирующая электронная микроскопия может быть использована для получения изображений поверхности клетки с высоким разрешением, но не может быть использована для визуализации интернализованных макропиносом. Количественная оценка мембранных оборок после обработки PMA и M-CSF показана на рисунке 3. Образование макропиносом может быть подтверждено альтернативными методами визуализации, включая конфокальную микроскопию, как показано на рисунке 4. Наконец, количественная оценка SEM мембранного взъерошения должна быть дополнена количественной оценкой проточной цитометрии флуоресцентного жидкофазного маркера (например, FITC- или техасского красного декстрана) для подтверждения стимуляции макропиноцитоза (рисунок 5).
Рисунок 1: Сканирующая электронная микроскопия изображений макрофагов RAW 264.7. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (dmso control) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ, 30 мин) или M-CSF (100 нг/мл, 30 мин) для стимуляции взъерошивания мембраны. Изображения справа показывают более высокое увеличение поверхности клетки. Красные стрелки: мембранные оборки. Зеленая стрелка: с-образная оборка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфологические стадии макропиноцитоза, фиксируемые сканирующей электронной микроскопией. Макрофаги RAW 264.7 обрабатывали M-CSF (100 нг/мл) в течение 30 мин, а клетки обрабатывали для визуализации SEM. (A) листовая мембранная протрузия, (B) С-образная мембранная оборка и (C) макропиноцитарная чашечка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка образования мембранных оборок. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (dmso control) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ, 30 мин) или M-CSF (100 нг/мл, 30 мин) для стимуляции взъерошивания мембраны. Гистограмма показывает количество оборок мембраны, нормализованных до общего числа клеток (n = 3). Данные представляют собой среднее ± SEM. Односторонняя ANOVA; *p < 0,05 против транспортного средства, #p < 0,05 против лечения PMA или M-CSF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Образование макропиносом. Клетки предварительно обрабатывали ПМА в течение 30 мин и инкубировали техасским красным декстраном (25 мкг/мл, красный) и FM4-64 (5 мкг/мл, зеленый) в течение 10 мин. Визуализация проводилась с помощью конфокального микроскопа. Синие стрелки: взъерошивание мембраны, желтые стрелки: макропиносомы, содержащие техасский красный декстран, зеленые стрелки: макропиносомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественная оценка макропиноцитоза. Макрофаги RAW 264.7 предварительно обрабатывали транспортным средством (контроль DMSO) или EIPA (25 мкМ) в течение 30 мин и инкубировали с PMA (1 мкМ) и FITC-декстраном (100 мкг/мл; 70 000 МВт) в течение 2 ч. Гистограмма показывает изменение средней интенсивности флуоресценции (MFI), нормализованное для обработки транспортного средства (n = 3, выполненное в трех экземплярах). Данные представляют собой среднее ± SEM. Односторонняя ANOVA; *p < 0,05 против автомобиля, #p < 0,05 против PMA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол визуализации SEM предоставляет инструмент для визуализации и количественной оценки образования мембранных оборок, круговых выступов и макропиноцитарных чашек на поверхности клетки in vitro. Хотя текущий протокол фокусируется на макрофагах, исследования показали, что образование мембранных оборков также происходит на различных других типах клеток, включая дендритные клетки, фибробласты, нейроны и раковые клетки 11,12,14,21,30. Учитывая это, оптимизация условий клеточной культуры и использование различных стимуляторов или условий лечения могут потребоваться для визуализации оборок мембран в других типах клеток.
Хотя существует некоторая свобода действий для подготовки образцов, этапы обезвоживания и сушки в критической точке должны соблюдаться точно, чтобы сохранить архитектуру поверхности клетки. Кроме того, присутствие воды или других растворителей, таких как этанол, будет нарушать вакуум, что имеет важное значение для визуализации SEM и, следовательно, он должен быть удален контролируемым образом, чтобы сохранить морфологию образца нетронутой14.
Электронные микроскопы используют пучок ускоренных электронов в качестве источника освещения. Первые электронные микроскопы были разработаны, когда длина волны стала ограничивающим фактором в световых микроскопах31. Электроны имеют гораздо более короткие длины волн, поэтому электронные микроскопы имеют более высокую разрешающую способность, чем световые микроскопы, и могут использоваться для получения изображений с высоким разрешением и исследования ультраструктуры широкого спектра биологических образцов. Основное ограничение этого метода связано с тем, что SEM обеспечивает только снимок морфологии плазматической мембраны, в отличие от флуоресцентной визуализации живых клеток, которая позволила бы визуализировать оборки мембраны, их переход в макропиноцитарные чашечки и образование макропиносом. Визуализация живых клеток, просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) и флуоресцентные анализы поглощения декстрана могут быть использованы для исследования интернализации флуоресцентных растворенных веществ посредством макропиноцитоза, транслокации и созревания макропиносом, а также внутриклеточных сигнальных механизмов, регулирующих макропиноцитоз. Поскольку SEM требует фиксации на покровных пластинках, можно визуализировать только дорсальную сторону и периферическую область клетки, что является еще одним ограничением этого метода.
Добавим, что иногда трудно отличить макропиноцитозно-независимое образование мембранных протрузий и макропиноцитарных мембранных взъерошений. Мы стандартизировали нашу количественную оценку, определив оборки мембраны с минимальным расстоянием не менее 0,5 мкм между любыми двумя точками на краю выступа. Количество оборок мембраны на клетку сильно варьируется и зависит от многочисленных факторов, включая стимулятор, его концентрацию, время инкубации и тип клеток32. С PMA и M-CSF мы видели клетки с несколькими мембранными оборками, но выбрали репрезентативные изображения, которые лучше представляют наши количественные данные (1-2 рюши на клетку). SEM остается золотым стандартом методики оценки топографических и морфологических характеристик плазматической мембраны in vitro. Сочетание этого метода наряду с визуализацией живых клеток и анализом проточной цитометрии интернализации растворенного вещества обеспечивает надежную стратегию анализа макропиноцитоза в различных типах клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Либби Перри (Университет Августы) за помощь в подготовке проб SEM. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01HL139562 (G.C.) и K99HL146954 (B.S.)] и Американской кардиологической ассоциацией [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
