Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Le linee cellulari tumorali umane sono ampiamente accettate per studiare la biologia del cancro e valutare gli agenti antitumorali. Tuttavia, queste linee cellulari non conservano necessariamente le caratteristiche originali del loro tessuto sorgente perché la loro morfologia, mutazione genica e profilo di espressione genica possono cambiare durante la coltura per lunghi periodi. Inoltre, la maggior parte di queste linee cellulari sono coltivate in un monostrato o utilizzate come xenotrapianti murini, nessuno dei quali rappresenta fisicamente il tessuto tumorale^1,2. Pertanto, l'efficacia clinica degli agenti antitumorali potrebbe non essere la stessa di quella osservata nelle linee cellulari tumorali. Pertanto, sono stati sviluppati sistemi in vitro, come saggi ex vivo che utilizzano xenotrapianti tumorali derivati dal paziente o organoidi tumorali derivati dal paziente (DOP) e modelli di sferoidi tumorali che riproducono accuratamente la struttura e la funzione dei tessuti tumorali. Prove crescenti suggeriscono che questi modelli predicono la risposta dei pazienti agli agenti antitumorali essendo direttamente paragonabili al corrispondente tessuto tumorale. Questi sistemi in vitro sono stati stabiliti per diversi tipi di tessuto tumorale e sono stati sviluppati anche sistemi di analisi ad alto rendimento associati (HTS) per lo screening farmacologico^3,4,5,6,7. Colture organoidi ex vivo eterogenee di tumori primari ottenuti da pazienti o xenotrapianti tumorali derivati da pazienti hanno guadagnato notevole trazione negli ultimi anni a causa della loro facilità di coltura e capacità di mantenere la complessità delle cellule nel tessuto stromale^8,9,10. Questi modelli dovrebbero migliorare la comprensione della biologia del cancro e facilitare la valutazione dell'efficacia del farmaco in vitro.

Una serie di nuove DOP sono state recentemente create da diversi tipi di tessuto tumorale, designato come F-PDO, nell'ambito del Fukushima Translational Research Project. Le DOP formano grandi cluster cellulari con una morfologia simile a quella del tumore di origine e possono essere coltivate per più di sei mesi^11. L'istologia comparativa e le analisi complete dell'espressione genica hanno mostrato che le caratteristiche delle DOP sono vicine a quelle dei loro tessuti tumorali di origine, anche dopo una crescita prolungata in condizioni di coltura. Inoltre, è stato stabilito un HTS adatto per ogni tipo di DOP in piastre a 96 pozzetti e 384 pozzetti. Questi saggi sono stati utilizzati per valutare diversi agenti e anticorpi a bersaglio molecolare. Qui, i chemioterapici standard (paclitaxel e carboplatino) utilizzati per il cancro dell'endometrio sono stati valutati utilizzando F-DOP derivate da un paziente che non rispondeva a paclitaxel e carboplatino. Di conseguenza, l'attività inibitoria della crescita cellulare di paclitaxel e carboplatino contro questa DOP era debole (IC₅₀: >10 μM). Inoltre, ricerche precedenti hanno riportato che la sensibilità di alcune F-DOP agli agenti chemioterapici e agli agenti a bersaglio molecolare è coerente con l'efficacia clinica^11,12,13. Infine, i cambiamenti nella struttura di ordine superiore delle DOP causati da agenti antitumorali sono stati analizzati utilizzando un sistema di analisi cellulare tridimensionale^12,13. I risultati della valutazione degli agenti antitumorali utilizzando un HTS a base di DOP sono paragonabili ai risultati clinici ottenuti per questi agenti. Qui, viene presentato un protocollo per un HTS più semplice e accurato che può essere utilizzato per valutare la potenza degli agenti antitumorali e dell'immunoterapia utilizzando i modelli DOP.

Tutti gli esperimenti che coinvolgono materiali di derivazione umana sono stati eseguiti ai sensi della Dichiarazione di Helsinki e approvati in anticipo dal comitato etico dell'Università di Medicina di Fukushima (numeri di approvazione 1953 e 2192; date di approvazione 18 marzo 2020 e 26 maggio 2016, rispettivamente). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti che hanno fornito i campioni clinici utilizzati in questo studio.

1. Cultura delle DOP

NOTA: le F-DOP formano cluster cellulari che presentano una varietà di morfologie eterogenee e crescono in coltura in sospensione (Figura 1). Inoltre, le F-DOP possono essere coltivate per più di 6 mesi e possono essere crioconservate per un uso futuro.

1. Scongelamento delle DOP immagazzinate (giorno 0)
   1. Scongelamento e sementi DOP (ad esempio, RLUN007, adenocarcinoma polmonare) al giorno 0 (Figura 1). In primo luogo, aggiungere 15 mL di terreno per dop (vedi tabella dei materiali)contenente l'1% di integratore B-27 e 30 ng/mL di fattore di crescita epidermico in un tubo sterile da 50 mL per centrifuga.
   2. Dopo aver rimosso il flaconcino congelato dalla conservazione dell'azoto liquido, agitare delicatamente le DOP a bagnomaria a 37 °C per 2 minuti. Quindi, rimuovere la fiala dal bagno d'acqua, pulire la fiala con etanolo al 70% e quindi spostare la fiala in un armadio di sicurezza biologica.
   3. Trasferire il contenuto del flaconcino al tubo contenente 15 mL di supporto per le DOP. Mescolare le DOP e il mezzo pipettando delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta di trasferimento da 3 ml. Centrifugare il tubo a 200 x g per 3 minuti a ~25 °C ed eliminare il surnatante. Risospesciare il pellet DOP in 5 mL di mezzo fresco e trasferirlo in un matraccio da²⁵ cm 2 (vedi Tabella dei Materiali)con un delicato pipettaggio. Infine, coltivare le DOP in un incubatore a 37 °C in 5% CO₂.
2. Cambia il mezzo due volte a settimana (giorni 3-7). Centrifugare la sospensione DOP per far precipitare i cluster cellulari e sostituire 4 mL del mezzo (80% in volume). Risospese le cellule nel mezzo fresco.
   NOTA: la maggior parte di RLUN007 viene visualizzata come cluster di celle di diametro 100-500 μm. Quando il colore del rosso fenolo nel mezzo cambia in giallo come mostrato nella Figura 1A, sostituire il mezzo più frequentemente. Se il mezzo diventa giallo il giorno successivo alla sostituzione e ogni cluster di cellule si fonde per formare cluster più grandi che hanno un diametro di > 500 μm, passa con un rapporto di divisione di 1:2.
3. Sottocultura (giorni 8-28) delle DOP
   NOTA: Data la difficoltà di misurare effettivamente il numero di singole celle, i tempi di passaggio sono determinati in base a un'appropriata densità del cluster cellulare e alla dimensione del pellet DOP dopo centrifugazione (Figura 1B). Nel caso di RLUN007, il volume del pellet DOP raggiunge i 30 μL (densità satura in 25 cm² palloni) circa 2 settimane dopo lo scongelamento.
   1. Per il trasferimento da un matraccio da²⁵ cm 2 a due palloni da²⁵ cm 2 (P1), trasferire la sospensione DOP in un tubo per centrifuga e in una centrifuga a 200 x g per 2 minuti a circa 25 °C. Stimare il volume del pellet DOP ed scartare il surnatante. Risospendare il pellet DOP utilizzando una pipetta da 5 ml in 5 mL di terreno fresco. Pipetta delicatamente su e giù cinque volte a bassa velocità. Quindi, trasferire metà del volume della sospensione DOP (2,5 mL) in due palloni e aggiungere 2,5 mL di terreno fresco a ciascun matraccio. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO₂.
   2. Per il trasferimento da due palloni da²⁵ cm 2 a un matraccio da 75 cm² (P2), trasferire la sospensione DOP da due palloni in due tubi centrifughi e centrifugare la DOP a 200 x g per 2 minuti a circa 25 °C. Successivamente, stimare il volume del pellet DOP e risospesciare il pellet in 2,5 ml di mezzo fresco (per tubo). Successivamente, combinare la sospensione DOP in un tubo con quella nell'altro e trasferirla in un matraccio da 75 cm² contenente 10 ml di mezzo fresco. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO₂. Trasferire le DOP sottocoltura da due palloni da 25 cm² a un pallone da 75 cm² circa 1 settimana dopo il primo passaggio (Figura 1C).

2. Inibizione della crescita HTS

NOTA: L'attività inibitoria della crescita degli agenti antitumorali contro le DOP viene valutata misurando il contenuto intracellulare di ATP, come mostrato nella Figura 2. Questa fase viene eseguita utilizzando un kit di analisi di vitalità cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).

1. Il giorno 0, coltivare le DOP (ad esempio, RLUN007) in palloni fino a quando non sarà disponibile un numero adeguato di cluster cellulari per il test. Un giorno prima della semina, trasferire la sospensione DOP da un matraccio da 75 cm² a un tubo da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 2 minuti per misurare il volume del pellet DOP. Quindi, risospesciare il pellet DOP in 15 ml di mezzo fresco e ricollocarlo in un matraccio da 75 cm^2. Colturare le cellule a 37 °C in 5% di CO₂.
   NOTA: Il volume di pellet DOP richiesto dipende dalla velocità di diluizione di ciascuna DOP e dal numero di piastre a 384 pozzetti utilizzate per il test. Per RLUN007, è necessario un volume di pellet di 200 μL per la semina in dieci piastre da 384 pozzetti.
2. Il giorno 1 (24 ore dopo aver cambiato il mezzo), tritare le DOP utilizzando apparecchiature di frammentazione e dispersione cellulare (vedi Tabella dei materiali)con un portafiltro contenente un filtro a maglie da 70 μm. Quindi, diluire 15 ml della sospensione DOP di 10x. Seminare 40 μL della sospensione DOP in micropiastre sferoidi (fondo tondo) ad attacco ultra basso a 384 pozzetti (vedi Tabella dei materiali)utilizzando un distributore di sospensioni cellulari (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: per i cluster di celle trituranti, si consiglia di utilizzare l'apparecchiatura di frammentazione e dispersione cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
3. A 24 ore dalla semina (giorno 2), trattare le DOP con 0,04 μL di soluzioni di agenti di prova a intervalli di concentrazione finale da 20 μM a 1,0 nM (10 diluizioni seriali) utilizzando un gestore di liquidi (vedi Tabella dei materiali).
4. Il giorno 8 (144 ore dopo il trattamento con la sostanza in esame), aggiungere il reagente di misurazione dell'ATP intracellulare ai pozzetti di prova. Mescolare le piastre con un mixer e incubare per 10 minuti a 25 °C. Misurare il contenuto intracellulare di ATP come luminescenza utilizzando un lettore di piastre (vedi Tabella dei materiali).
5. Per calcolare la vitalità cellulare, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di prova per quella nei pozzetti di controllo contenenti il veicolo, con lo sfondo sottratto. Per calcolare il tasso di crescita in 6 giorni, dividere la quantità di ATP nei pozzetti di controllo del veicolo per quella nei pozzetti di controllo del veicolo 24 ore dopo la semina.
6. Calcolare i valori di concentrazione inibitoria del 50% (IC₅₀₎e dell'area sotto la curva (AUC) dalle curve dose-risposta utilizzando un software di analisi dei dati biologici (vedi Tabella dei materiali). Il fattore Z è un parametro adimensionale che va da 1 (separazione infinita) a <0, definito come Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, dove σc+, σc-, μc+ e μc- sono le deviazioni standard (σ) e le medie (μ) dei controlli alti (c+) e bassi (c−)¹⁴, rispettivamente.

3. HTS con un sistema di prelievo e imaging cellulare per l'inibizione della crescita

NOTA: se c'è una grande deviazione (quando il coefficiente di variazione [CV] al saggio è superiore al 20%) nei dati utilizzando il protocollo 2, le DOP di una dimensione selezionata possono essere seminate in piastre a 96 pozzetti o 384 pozzetti utilizzando un sistema di prelievo e imaging cellulare (Figura 2). Il protocollo è lo stesso descritto nei passaggi 2.1 e 2.2 della sezione precedente. Questo passaggio viene eseguito utilizzando un sistema di prelievo e imaging delle celle disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).

1. Il giorno 1, impostare una micropiastra sferoidale ad attacco ultra-basso a 384 pozzetti con 40 μL di media/così come una piastra di destinazione sul sistema di prelievo e imaging cellulare.
2. Riempire la camera di raccolta (vedi Tabella dei materiali)con 6 mL di terreno di coltura e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti per rimuovere le bolle d'aria. Aggiungere le DOP sospese nel mezzo (volume di pellet DOP, 4 μL) alla camera di prelievo e impostarle sul sistema.
3. Stare in piedi la camera per almeno 1 minuto, seguita dalla dispersione, in modo che i cluster cellulari si depositino nella parte inferiore della camera; quindi, eseguire la scansione della camera.
4. Impostare la dimensione del picking su 140-160 μm (area 15.386-20.000 μm²) sul sistema per la selezione automatica dei cluster di celle. Quindi, controllare la qualità dei cluster di celle selezionati sulle immagini scansionate e trasferire dieci cluster di celle per pozzo utilizzando le punte di prelievo (vedere Tabella dei materiali)nella piastra di destinazione.
5. Eseguire i passaggi del protocollo dal passaggio 2.3 in poi.

4. HTS per la citotossicità cellulare anticorpo-dipendente

NOTA: Questa fase viene eseguita utilizzando un sistema disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali),che è uno strumento di misura dell'impedenza elettrica. Viene utilizzato per valutare la citolisi delle DOP mediante citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) con anticorpi monoclonali e cellule natural killer (NK) (Figura 3). Le cellule NK sono prodotte da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando il kit di produzione di cellule NK (vedere Tabella dei materiali),seguendo le istruzioni del produttore.

1. Misurazione dell'attività adCC
   1. Il giorno 0, rivestire una piastra a 96 pozzetti(vedi Tabella dei materiali) con 50 μL di soluzione di fibronectina da 10 μg/mL (0,5 μg/pozzetto) a 4 °C durante la notte.
   2. Il giorno 1, dopo aver rimosso la soluzione di fibronectina, aggiungere 50 μL del terreno di coltura a ciascun pozzetto per misurare l'impedenza di fondo.
   3. Prima della semina, aggiungere 5 mL di reagente di dissociazione per colture cellulari (vedi Tabella dei materiali)alle DOP (RLUN007: 100 μL del pellet DOP in un pallone da 75 cm²⁾ e incubare in un incubatore a CO₂ a 37 °C per 20 minuti per disperdere le DOP. Per interrompere la tripsinizzazione, aggiungere 5 ml di mezzo, centrifugare e rimuovere il reagente di dissociazione. Risciacquare le DOP con mezzo fresco e filtrare attraverso un filtro cellulare da 40 μm (vedi Tabella dei materiali).
   4. Contare il numero di celle utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare (vedere Tabella dei materiali).
   5. Trasferire la sospensione PDO in un serbatoio e miscelare utilizzando un pipettor multicanale. Aggiungere la sospensione DOP in pozzetti a 5 x 10⁴ celle/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti. Ogni pozzo contiene un volume finale di 100 μL. Quindi, posizionare la piastra in un armadio di sicurezza biologica a circa 25 °C per 30 minuti.
   6. Trasferire la piastra allo strumento in un incubatore a CO₂ a 37 °C. Registrare le variazioni nei segnali di impedenza ogni 15 minuti come indice della cella.
   7. Scongelare le cellule NK a bagnomaria a 37 °C lo stesso giorno della semina DOP. Trasferire le cellule dal flaconcino a un tubo da 15 mL contenente 10 mL di terreno per celle NK (vedere Tabella dei materiali)e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a circa 25 °C. Scartare il surnatante e risospesere il pellet cellulare in 10 ml di terreno fresco. Dopo il conteggio delle cellule, regolare la densità cellulare a 1 x^{10 6} celle/mL e trasferirla in un pallone da 75 cm^2. Coltivare le cellule NK in un incubatore a CO₂ al 5% a 37 °C.
   8. Il giorno 2, preparare le soluzioni anticorpali (soluzione salina tamponata con fosfato) a 10 volte la concentrazione finale in piastre sterili a 96 pozzetti con fondo a V.
   9. Rimuovere 60 μL di mezzo da ciascun pozzetto e aggiungere 10 μL di trastuzumab o soluzione di cetuximab (10 μg/mL, 1 μg/mL e 0,1 μg/mL) alle DOP. Trasferire le piastre allo strumento in un'incubatrice e registrare l'indice cellulare per 1 ora.
   10. Trasferire la sospensione della cella NK in un tubo da 50 ml e contare il numero di cella. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min e regolare la densità della cella NK a 1 x^{10 6} celle/mL e 2 x^{10 6} celle/mL con il mezzo per le DOP.
   11. Aggiungere 50 μL di sospensione di cellule NK alle cellule effettrici (NK) in corrispondenza di un rapporto cellulare target (RLUN007) di 1:1 o 2:1. Le concentrazioni finali degli anticorpi sono 1 μg/mL, 0,1 μg/mL e 0,01 μg/mL. Tenere la piastra a circa 25 °C per 15 minuti e restituire le piastre allo strumento.
2. Raccolta e analisi dei dati
   1. Convertire l'indice cellulare in percentuali di valori di citolisi utilizzando un software di analisi (vedere Tabella dei materiali).
   2. La percentuale di citolisi si riferisce alla percentuale di cellule bersaglio uccise dalle cellule NK rispetto alle cellule bersaglio (DOP) da sole come controllo. Sottrarre gli indici cellulari dei pozzetti contenenti solo cellule NK dall'indice dei pozzetti campione in ogni punto temporale. Normalizzare ogni valore all'indice cellulare immediatamente prima dell'aggiunta di anticorpi. Convertire l'indice cellulare normalizzato in citolisi percentuale utilizzando la seguente equazione: % citolisi = (1 - indice cellulare normalizzato [pozzetti campione]) / indice cellulare normalizzato (pozzetti bersaglio da soli) x 100.

Un HTS altamente accurato è stato sviluppato utilizzando DOP e micropiastre a 384 pozzetti per valutare gli agenti antitumorali, e lo sviluppo di un HTS per ogni DOP è stato precedentemente riportato10,11, 12,13. Le prestazioni dell'HTS sono state valutate calcolando i CV e il fattore Z. Il fattore Z è un metodo ampiamente accettato per la convalida della qualità e delle prestazioni del saggio e il test è adatto per HTS se questo valore è >0,514. I punti di Riferimento di controllo nel test della piastra a 384 pozzetti utilizzando RLUN007 hanno mostrato poca variabilità, con valori CV del 5,8% e fattori Z calcolati di 0,83, come mostrato nella Figura 4. Questi risultati indicano che questo test ha prestazioni elevate per HTS. Per studiare la sensibilità delle DOP agli agenti antitumorali utilizzando HTS, l'inibizione della crescita è stata valutata utilizzando RLUN007 trattato con otto agenti antitumorali, in particolare, inibitori del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib e rociletinib) e paclitaxel, che sono trattamenti clinici standard per il carcinoma polmonare non a piccole cellule e mitomicina C come controllo positivo. I valori IC50 e AUC degli agenti antitumorali per ciascuna DOP sono mostrati nella Figura 4. RLUN007 ha mostrato un'elevata sensibilità (IC50 < 2 μM, AUC < 282) per tutti gli inibitori dell'EGFR e altri agenti antitumorali. Le curve sigmoidi calcolate per tutti i dati indicavano che l'attività inibitoria della crescita degli agenti antitumorali poteva essere misurata con precisione.

Il sistema di prelievo e imaging cellulare viene utilizzato quando i dati variano in modo significativo utilizzando la metodologia di cui sopra. Il sistema di prelievo e imaging cellulare, che seleziona accuratamente i cluster di cellule senza danneggiarli, consente test HTS accurati allineando le dimensioni del cluster cellulare per escludere i detriti cellulari dal sistema di analisi. Quando il sistema non è stato utilizzato, il valore CV era 26,0% e il valore del fattore Z era 0,23 (dati non mostrati). Tuttavia, i valori del fattore CV e Z sono stati migliorati rispettivamente al 6,4% e allo 0,81, utilizzando il sistema.

Per studiare la citolisi delle DOP con attività ADCC utilizzando lo strumento di misurazione dell'impedenza elettrica, che monitora il numero, la morfologia e l'attaccamento delle cellule per una lunga durata, i cambiamenti nei segnali di impedenza sono stati valutati utilizzando RLUN007 trattato con gli anticorpi (trastuzumab e cetuximab) e le cellule NK come cellule effettrici in una piastra a 96 pozzetti. Rispetto al controllo costituito solo da cellule bersaglio, la percentuale di citolisi è aumentata nel tempo. Ha raggiunto il 45% o il 75% dopo 6 ore con un rapporto E:T di 1:1(Figura 5A,C)o 2:1(Figura 5B,D)senza gli anticorpi. La citolisi cellulo-mediata NK con trastuzumab è stata di circa il 60% e il 90% con un rapporto di1:1 (Figura 5A,1 μg/mL) e 2:1(Figura 5B,1 μg/mL), rispettivamente, a 6 h. Al contrario, cetuximab ha avuto un impatto dose-dipendente sulla citolisi cellulo-mediata da NK (Figura 5C,D). Alla più alta concentrazione di cetuximab, RLUN007 sono stati distrutti al 90% e al 100% con un rapporto di 1:1 e 2:1, rispettivamente (Figura 5C, D). L'effetto di trastuzumab è stato più debole di quello di cetuximab, con solo il 60% di citotossicità. Questi risultati indicano che il sistema di analisi PDO può valutare l'attività dell'ADCC utilizzando la tecnologia basata sull'impedenza in tempo reale.

Figura 1: Punti critici per la cultura DOP. (A) Cambiamento di colore nel mezzo. (B) Misurazione della quantità di DOP dalla dimensione del pellet rivestendo un tubo di centrifuga contenente le DOP con tubi contrassegnati a livelli per 50-200 μL. (C) Densità DOP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Riepilogo del protocollo utilizzato per creare un sistema di analisi ad alta produttività utilizzando micropiastre a 384 pozzetti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Riepilogo del protocollo per il saggio ad alto rendimento dell'attività ADCC. ADCC, citotossicità cellulare anticorpo-dipendente; NK, killer naturale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Sistema di analisi ad alto rendimento per l'inibizione della crescita con agenti antitumorali. Curva dose-risposta di RLUN007 agli agenti antitumorali. Le DOP tritate sono state seminate in lastre da 384 pozzetti. Questi sono stati trattati per 6 giorni con dieci diverse concentrazioni di agenti antitumorali (tra 10 μM e 1,5 nM). I dati rappresentano la deviazione media ± standard degli esperimenti triplicati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Saggio ad alto rendimento per l'attività ADCC. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Un rapporto 1:1 tra RLUN007 e cellule effettrici. (B,D) Citolisi con un rapporto di RLUN007: cellule effettrici di 1:2. L'attività è stata misurata 12 ore dopo l'aggiunta delle cellule effettrici. I dati sono presentati come la deviazione media ± standard di tre campioni replicati. ADCC, citotossicità cellulare anticorpo-dipendente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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