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Articolo metodologico

Generazione di organoidi del cervello umano per la modellazione della malattia mitocondriale

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DOI:

10.3791/62756

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21 giugno 2021

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1Department of General Pediatrics, Neonatology and Pediatric Cardiology, Duesseldorf University Hospital, Medical Faculty, Heinrich Heine University, 2Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University, 3Berlin Institute for Medical Systems Biology (BIMSB), Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC), 4Seaver Autism Center for Research and Treatment, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Max Delbrueck Center for Molecular Medicine (MDC)

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo e il loro uso nella modellazione delle malattie mitocondriali.

Abstract

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo e sono attualmente incurabili. Queste malattie causano difetti dello sviluppo neurologico i cui meccanismi sottostanti rimangono da chiarire. Un importante ostacolo è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino la compromissione neuronale ad esordio precoce osservata nei pazienti. I progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) consentono la generazione di organoidi cerebrali tridimensionali (3D) che possono essere utilizzati per studiare l'impatto delle malattie sullo sviluppo e l'organizzazione del sistema nervoso. I ricercatori, compresi questi autori, hanno recentemente introdotto organoidi del cervello umano per modellare i disturbi mitocondriali. Questo documento riporta un protocollo dettagliato per la robusta generazione di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso nella profilazione bioenergetica mitocondriale e nelle analisi di imaging. Questi esperimenti consentiranno l'uso di organoidi cerebrali per studiare le disfunzioni metaboliche e dello sviluppo e possono fornire informazioni cruciali per sezionare la patologia neuronale delle malattie mitocondriali.

Introduzione

Le malattie mitocondriali rappresentano la più grande classe di errori congeniti del metabolismo1. Sono causati da mutazioni genetiche che interrompono diversi processi mitocondriali, tra cui la fosforilazione ossidativa (OXPHOS)2, l'assemblaggio della catena respiratoria, la dinamica mitocondriale e la trascrizione o la replicazione del DNA mitocondriale3. I tessuti con fabbisogno energetico sono particolarmente colpiti dalla disfunzione mitocondriale4. Di conseguenza, i pazienti con malattie mitocondriali sviluppano tipicamente manifestazioni neurologiche ad esordio precoce.

Attualmente non sono disponibili trattamenti per i bambini affetti da malattie mitocondriali5. Uno dei principali ostacoli allo sviluppo di farmaci per le malattie mitocondriali è la mancanza di modelli efficaci che ricapitolino il decorso della malattia umana6. Molti dei modelli animali attualmente studiati non presentano i difetti neurologici presenti nei pazienti7. Quindi, i meccanismi alla base della patologia neuronale delle malattie mitocondriali non sono ancora completamente compresi.

Studi recenti hanno generato iPSC da pazienti affetti da malattie mitocondriali e hanno utilizzato queste cellule per ottenere cellule neuronali specifiche del paziente. Ad esempio, è stato scoperto che i difetti genetici associati alla malattia mitocondriale, la sindrome di Leigh, causano aberrazioni nella bioenergetica cellulare8,9, nella sintesi proteica10 e nell'omeostasi del calcio9,11. Questi rapporti hanno fornito importanti indizi meccanicistici sulla compromissione neuronale che si verifica nelle malattie mitocondriali, aprendo la strada alla scoperta di farmaci per queste malattie incurabili12.

Le culture bidimensionali (2D), tuttavia, non consentono lo studio della complessità architettonica e dell'organizzazione regionale degli organi 3D13. A tal fine, l'uso di organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC specifiche del paziente14 può consentire ai ricercatori di ottenere ulteriori informazioni importanti e quindi aiutare a sezionare come le malattie mitocondriali influenzano lo sviluppo e la funzione del sistema nervoso15. Gli studi che impiegano organoidi cerebrali derivati da iPSC per studiare le malattie mitocondriali stanno iniziando a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali.

Gli organoidi del midollo spinale portatori di mutazioni associate alla malattia mitocondriale, all'encefalopatia mitocondriale, all'acidosi lattica e alla sindrome da episodi simili a ictus (MELAS), hanno mostrato neurogenesi difettosa e differenziazione ritardata dei motoneuroni16. Gli organoidi corticali derivati da pazienti con malattia mitocondriale, sindrome di Leigh, hanno mostrato dimensioni ridotte, difetti nella generazione di gemme epiteliali neurali e perdita dell'architettura corticale17. Gli organoidi cerebrali dei pazienti con sindrome di Leigh hanno dimostrato che i difetti della malattia iniziano a livello delle cellule progenitrici neurali, che non possono impegnarsi nel metabolismo mitocondriale, causando aberranti ramificazioni neuronali e morfogenesi18. Pertanto, i progenitori neurali possono rappresentare un bersaglio terapeutico cellulare per le malattie mitocondriali e le strategie che promuovono la loro funzione mitocondriale possono supportare lo sviluppo funzionale del sistema nervoso.

L'uso di organoidi cerebrali potrebbe aiutare a scoprire i componenti dello sviluppo neurologico delle malattie mitocondriali. Le malattie mitocondriali sono considerate principalmente come neurodegenerazione ad esordio precoce5. Tuttavia, i difetti dello sviluppo neurologico sono presenti anche nei pazienti affetti da malattie mitocondriali, tra cui ritardo dello sviluppo e deterioramento cognitivo19. Gli organoidi cerebrali specifici del paziente possono aiutare ad affrontare questi aspetti e chiarire come le malattie mitocondriali possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello umano. La disfunzione mitocondriale potrebbe anche svolgere un ruolo patogenetico in altre malattie neurologiche più comuni, come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson e la malattia di Huntington4. Quindi, chiarire l'impatto dei difetti mitocondriali nel neurosviluppo usando organoidi cerebrali potrebbe anche essere strumentale per lo studio di tali malattie. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi cerebrali riproducibili che possono essere utilizzati per condurre la modellazione delle malattie mitocondriali.

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Protocollo

NOTA: L'uso di iPSC umani può richiedere un'approvazione etica. Le iPSC utilizzate in questo studio sono state derivate da individui sani di controllo a seguito dell'approvazione etica locale (# 2019-681). Tutte le procedure di coltura cellulare devono essere eseguite sotto un cappuccio sterile di coltura cellulare, disinfettando accuratamente tutti i reagenti e i materiali di consumo prima di trasferirli sotto il cofano. Le iPSC umane utilizzate per la differenziazione dovrebbero avere un numero di passaggio inferiore a 50 per evitare potenziali aberrazioni genomiche che possono verificarsi su colture estensive. Lo stato pluripotente delle cellule dovrebbe essere convalidato prima della generazione di organoidi, ad esempio monitorando l'espressione di marcatori associati alla pluripotenza come NANOG o OCT4. I test del micoplasma dovrebbero essere condotti settimanalmente per garantire colture prive di micoplasma.

1. Generazione di organoidi cerebrali

  1. Cultura delle iPSC umane
    1. Coltivare iPSC umani in condizioni prive di alimentatore in mezzo iPSC (vedere la Tabella dei materiali) su piastre rivestite a 6 pozzetti e tenerle in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Il riporto delle cellule di alimentazione può ostacolare la differenziazione degli organoidi. Passare le cellule almeno una volta in condizioni prive di alimentatore.
    2. Passare le iPSC all'80% di confluenza utilizzando un mezzo di distacco privo di enzimi in rapporti che vanno da 1:4 a 1:12. Per aumentare la sopravvivenza cellulare, aggiungere 10 μM di inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) (Y27632) dopo ogni scissione.
  2. Dissociare le iPSC (confluenza dell'80%)-Giorno 0.
    1. Preparare il mezzo di differenziazione corticale I (CDMI) (Tabella 1). Media CDMI preriscaldata a temperatura ambiente (22-25 °C) prima di aggiungerlo alle celle.
    2. Lavare i pozzetti contenenti le iPSC con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere cellule morte e detriti.
    3. Aggiungere 500 μL di reagente A (Tabella dei materiali) preriscaldato a ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a 37 °C. Controllare al microscopio per garantire il distacco cellulare.
    4. Aggiungere 1 mL di mezzo iPSC per diluire il reagente A per neutralizzarne l'attività.
    5. Utilizzare una pipetta da 1000 μL per dissociare le cellule tubando su e giù e trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 15 mL.
    6. Centrifugare delicatamente le iPSC a 125 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (22-25 °C).
    7. Aspirare accuratamente il surnatante per evitare di disturbare il pellet cellulare.
    8. Risospesciare il pellet con 1 mL di CDMI per ottenere una sospensione a cella singola e contare il numero di cella.
    9. Preparare il terreno di semina con 9.000 iPSC per 100 μL in CDMI integrato con 20 μM di inibitore ROCK, 3 μM di inibitore WNT-catenina (IWR1) e 5 μM SB431542.
    10. Aggiungere 100 μL di terreno di semina per pozzetto a una piastra con fondo a V da 96 pozzetti.
    11. Conservare la piastra in un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 °C e al 5% di CO2.
  3. Generazione di neurosfere
    1. Il giorno 1, osserva che si stanno formando aggregati di cellule rotonde (neurosfere) con bordi lisci definiti. Si notino le cellule morte intorno agli aggregati. Continuare a coltivare nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
    2. Il giorno 3, agitare la piastra toccando i lati tre volte per staccare le cellule morte.
    3. Aggiungere 100 μL di CDMI integrati con 20 μM di inibitore ROCK, 3 μM IWR1 e 5 μM SB431542 a ciascun pozzetto.
    4. Riportare la piastra all'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
    5. Il giorno 6, rimuovere con attenzione 80 μL del mezzo surnatante da ciascun pozzetto. Evitare di toccare il fondo del pozzo.
    6. Aggiungere 100 μL di CDMI integrati con 3 μM IWR1 e 5 μM SB431542 a ciascun pozzetto. Riportare la piastra all'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
    7. Ripetere i passaggi 5 e 6 ogni 3 giorni fino al giorno 18.
  4. Trasferimento di neurosfere
    1. Il giorno 18, preparare Cortical Differentiation Medium II (CDMII) (Tabella 1) e aggiungere 10 ml a una piastra di coltura cellulare ad attacco ultra-basso da 100 mm.
    2. Utilizzare una pipetta da 200 μL con la punta tagliata per trasferire le neurosfere rotonde dalla piastra a 96 pozzetti alla piastra di coltura cellulare ad attacco ultra-basso da 100 mm.
      NOTA: Sii delicato per evitare di danneggiare le neurosfere assicurandoti che l'apertura della punta sia abbastanza ampia e che gli aggregati non vengano aspirati troppo rapidamente.
    3. Rimuovere 5 mL di mezzo dalla piastra contenente le neurosfere e aggiungere 5 mL di CDMII fresco.
      NOTA: Questa procedura aiuta a ridurre la quantità di supporto CDMI che potrebbe essere stata trasferita dal trasferimento delle neurosfere.
    4. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 giri/min all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: ispezionare visivamente le neurosfere il giorno successivo. Aumentare la velocità dello shaker orbitale se le neurosfere sono raggruppate insieme o attaccate al fondo della piastra.
    5. Ogni 3 giorni, aspirare accuratamente il mezzo surnatante e sostituirlo con CDMII fresco. Lasciare una piccola quantità del mezzo per evitare che le neurosfere si secchino.
    6. Il giorno 35, preparare Cortical Differentiation Medium III (CDMIII) (Tabella 1).
      NOTA: il componente della matrice deve essere sciolto in CDMIII freddo.
    7. Aspirare il mezzo dalla piastra e aggiungere 10 ml di CDMIII freddo.
      NOTA: È più efficace utilizzare il mezzo freddo in modo che il componente della matrice possa rivestire gli organoidi senza formare grumi.
    8. Dopo aver cambiato il mezzo, riposizionare la piastra su uno shaker orbitale a 70 giri / min all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate a 37 ° C e 5% di CO2.
    9. Cambia il mezzo ogni 3-5 giorni a seconda del tasso di crescita, come indicato dal colore del mezzo.
    10. Il giorno 70, preparare Cortical Differentiation Medium IV (CDMIV) (Tabella 1). Utilizzare il supporto CDMIV fino al raggiungimento dell'età desiderata degli organoidi. Durante questo periodo, tenere la piastra su uno shaker orbitale impostato a 70 giri / min all'interno di un incubatore di colture tissutali umidificate (37 ° C e 5% di CO2).
    11. Cambia il mezzo ogni 3-5 giorni, a seconda del tasso di crescita.

2. Immunocolorazione degli organoidi cerebrali

  1. Preparazione dei tessuti
    1. Preparare la soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) e metterla sotto un cappuccio di sicurezza.
      NOTA: Indossare dispositivi di sicurezza personali quando si maneggia PFA.
    2. Raccogliere gli organoidi cerebrali e trasferirli delicatamente con una pipetta Pasteur di plastica da 3 mL con punta smussata in una piastra a 6 pozzetti piena di PFA.
      NOTA: Utilizzare organoidi più vecchi di 40 giorni per consentire la visualizzazione di strutture con maggiore complessità cellulare.
    3. Conservare gli organoidi nella soluzione di PFA per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere con cura il PFA con una pipetta Pasteur in plastica da 3 ml e lavare gli organoidi fissi tre volte utilizzando PBS.
    5. Conservare gli organoidi fissi a 4 °C in PBS fino a nuovo utilizzo.
  2. Preparazione di fette di organoidi cerebrali
    1. Preparare una soluzione di agar al 3% e riscaldare lentamente fino a quando non si è liquefatto.
    2. Posizionare lo stampo (l'estremità tagliata di una siringa da 10 ml) su un pezzo di carta da filtro assorbente (lato liscio verso l'alto). Metti una goccia di agar su di esso.
    3. Estrarre rapidamente un singolo organoide dalla piastra a 6 pozzetti con una spatola e rimuovere l'eccessivo PBS con carta da filtro.
      NOTA: Fare attenzione a non toccare l'organoide direttamente con carta da filtro.
    4. Posizionare l'organoide sulla goccia di agar.
    5. Ripetere questa procedura con un massimo di tre organoidi.
      NOTA: lavorare velocemente per evitare la solidificazione dell'agar durante questo passaggio.
    6. Riempire lo stampo con l'agar fino a quando tutti gli organoidi sono completamente coperti.
    7. Attendere che l'agar inizi a solidificarsi, quindi trasferire delicatamente l'intero stampo contenente gli organoidi, compresa la carta da filtro assorbente, su un elemento di raffreddamento.
      NOTA: Se un elemento di raffreddamento non è disponibile, conservare gli organoidi per alcuni minuti in frigorifero a 4 °C.
    8. Nel frattempo, prepararsi per la procedura di affettamento: posizionare una lama di rasoio (pulita con acetone e lavata con acqua a doppio distillato) nel supporto del vibratoma, montare sul bagno e riempirla con PBS.
    9. Rimuovere lo stampo dall'agar (solidificato) e utilizzare un bisturi per tagliarlo per formare un cubo.
    10. Attaccare il cubo di agar contenente gli organoidi sulla piastra portante del vibratoma con gel adesivo (vedi la Tabella dei materiali) e posizionarlo nella vasca da bagno contenente PBS.
    11. Regolare il vibratoma (vedere la Tabella dei materiali) per tagliare le fette ad uno spessore di 150 μm.
      NOTA: le impostazioni del vibratoma (angolo, ampiezza, frequenza e velocità corretti della lama) possono essere simili a quelle utilizzate per affettare il tessuto cerebrale fisso derivato dai primi animali postnatali. Tuttavia, le impostazioni ideali dipendono fortemente dal tipo di vibratoma e devono essere determinate in una prima fase per evitare distorsioni o addirittura strappi del tessuto durante il taglio.
    12. Avviare la procedura di taglio. Utilizzare una pipetta di vetro o una spatola per trasferire delicatamente ogni fetta appena tagliata in una piastra a 24 pozzetti riempita con PBS.
    13. Conservare la piastra contenente le fette a 4 °C (fino a un certo giorno) fino a un'ulteriore lavorazione.
    14. Trasferire le fette fuori dalla piastra con una pipetta di vetro o una spatola su vetrini per microscopio. Utilizzare un minimo di 2 fette per diapositiva.
    15. Rimuovere con cautela l'agar e il PBS in eccesso con una siringa.
    16. Lasciare asciugare le fette fino a quando non aderiscono alle diapositive.
      NOTA: Mentre i vetrini per microscopio possono essere conservati in camere di plastica riempite con PBS a 4 °C, devono essere colorati il prima possibile dopo la procedura di affettamento.
  3. Colorazione immunoistochimica
    1. Preparare la soluzione di blocco (Tabella 1).
    2. Utilizzare una penna PAP per disegnare un bordo idrofobo attorno alle fette sulla diapositiva per mantenere tutte le soluzioni sulle diapositive.
    3. Aggiungere con attenzione la soluzione bloccante sul vetrino e incubare per 1 ora a temperatura ambiente (22-25 °C). Per evitare di distruggere il tessuto, non aggiungere la soluzione direttamente sopra le fette.
    4. Aspirare la soluzione bloccante e applicare l'anticorpo primario desiderato diluito nella soluzione bloccante.
    5. Incubare il vetrino durante la notte in una camera umidificata a 4 °C.
    6. Risciacquare la diapositiva tre volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno.
    7. Incubare le fette con l'anticorpo secondario specifico diluito nella soluzione bloccante ed eseguire la colorazione Hoechst (1:2.500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
      NOTA: Ricordarsi di eseguire controlli negativi per confermare che non ci siano legami non specifici o autofluorescenza.
    8. Risciacquare tre volte con 1x PBS per 10 minuti ciascuno al buio.
    9. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio alla fetta, posizionare una copertura sul bordo della goccia e posare lentamente la slitta verso la fetta per evitare bolle d'aria.
    10. Lasciare riposare lo scivolo durante la notte a temperatura ambiente. Applicare lo smalto sul bordo della copertina per sigillare ulteriormente la diapositiva. Per la conservazione a lungo termine, conservare a 4 °C.
  4. Documentazione della colorazione
    1. Per scansionare immagini di grandi dimensioni per cucire, utilizzare un microscopio a campo largo verticale motorizzato dotato di (vedi la Tabella dei materiali per i dettagli) un obiettivo di alta qualità; Set di filtri DAPI (ad esempio, eccitazione (EX): 340-380 nm, specchio dicroico (DM): 400 nm, filtro barriera (BA): 435-485 nm); set di filtri isotiocianati di fluoresceina (ad esempio, EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Set di filtri Alexa594 (ad esempio, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); fotocamera digitale; software di acquisizione ad alte prestazioni che consente operazioni automatizzate di stitches e stack.
    2. Per la gestione delle immagini, utilizzare un programma di elaborazione delle immagini in grado di generare file tif a 8 bit, ritagliare punti, regolare il contrasto e la luminosità, unire i canali (ad esempio, blu, verde e rosso) e aggiungere barre di scala.
    3. Per scansionare i dettagli, utilizzare un microscopio a scansione laser confocale motorizzato dotato di un obiettivo di alta qualità, un laser UV (EX: 408 nm), un laser Argon (EX: 488 nm), un laser elio-neon (EX: 543), software di imaging per un microscopio confocale.
    4. Per la gestione delle immagini dei dettagli, utilizzare un programma di elaborazione delle immagini in grado di generare proiezioni di massima intensità di z-stack confocali (ad esempio, sezioni ottiche di 0,6 μm ciascuna), generare file tif a 8 bit, regolare contrasto e luminosità, unire i canali (ad esempio, blu, verde e rosso), aggiungere barre di scala.
    5. Usa un editor grafico per disporre le figure.

3. Profilazione bioenergetica degli organoidi cerebrali

  1. Preparazione di organoidi per la profilazione bioenergetica
    1. Preparare la soluzione di papaina e DNasi seguendo il protocollo del produttore.
    2. Trasferire 3-5 organoidi in una piastra a 6 pozzetti. Lavali due volte con PBS prebellico.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione di papaina attivata preriscaldata contenente DNasi. Usando una lama, tagliare gli organoidi in piccoli pezzi.
    4. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale impostato a 27 rpm all'interno di un incubatore di colture cellulari (a 37 °C, 5% DI CO2) e incubare per 15-20 min.
      NOTA: Il tempo di incubazione dipende dallo stadio organoide. Gli organoidi in fase iniziale possono essere usati così come sono. Per gli organoidi di età superiore a 3 mesi, si consiglia di tagliare gli organoidi in 2-3 pezzi prima della dissociazione e incubare i pezzi a una velocità di oscillazione impostata a 27 giri / min per 15-20 minuti a 37 ° C. Questa procedura può aiutare a rimuovere il tessuto necrotico che può essere presente negli organoidi in fase successiva.
    5. Raccogliere i tessuti digeriti in un tubo da 15 ml e aggiungere 5 mL di terreno di coltura organoide CDMIV (Tabella 1).
    6. Triturare il tessuto con una pipetta di plastica da 10 ml tubando su e giù 10-15 volte. Lasciare che il tessuto non dissociato si depositi sul fondo del tubo.
    7. Trasferire con cura la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml, evitando qualsiasi pezzo di tessuto non dissociato. Filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 40 μm (ad esempio, tubi a fondo tondo in polistirene con tappi del filtro cellulare).
    8. Pellet le celle mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    9. Valuta il numero e la qualità delle celle usando il tripano blu.
    10. Placcare il numero desiderato (~ 20.000 / pozzetto) di cellule su micropiastre rivestite a 96 pozzetti. Cambiare il mezzo 6-8 ore dopo la placcatura in mezzo neuronale (Tabella 1).
    11. Incubare la micropiastra rivestita a 96 pozzetti in un incubatore a CO2 (37 °C, 5% CO2) per 4 giorni.
  2. Profilazione bioenergetica
    1. Il giorno 3 dopo aver ripavimentato le cellule dissociate, aggiungere 200 μL di soluzione di calibrazione in ciascun pozzetto della parte inferiore della micropiastra a 96 pozzetti e posizionare la cartuccia del sensore verde superiore sulla micropiastra idratata.
      NOTA: posizionare la cartuccia del sensore sulla parte superiore della micropiastra nell'orientamento corretto e assicurarsi che la soluzione calibrante copra tutti i sensori.
    2. Incubare la micropiastra idrata a 96 pozzetti in un incubatore non a CO2 a 37 °C durante la notte.
    3. Accendere l'analizzatore per consentire allo strumento di stabilizzarsi a 37 °C durante la notte.
    4. Il giorno 4 dopo la ripaccatura, ispezionare la coltura organoide dissociata sulla micropiastra a 96 pozzetti al microscopio per assicurarsi che le cellule appaiano come un monostrato confluente.
    5. Preparare il mezzo di analisi (Tabella 1).
    6. Rimuovere Neuronal Medium da tutti i pozzetti con una pipetta senza toccare il fondo del pozzo per prevenire danni cellulari. In alternativa, capovolgere con cura l'intero piatto e quindi asciugarlo su carta pulita. Lavora rapidamente per evitare la morte cellulare.
    7. Lavare le cellule due volte con 200 μL preriscaldati di Assay Medium. Aggiungere Assay Medium a un volume finale di 180 μL per pozzetto. Incubare la micropiastra a 96 pozzetti in un incubatore non a CO2 a 37 °C per 1 ora.
    8. Preparare soluzioni da 10 μM di inibitori mitocondriali in mezzo di analisi. Si noti che la concentrazione finale dopo l'iniezione è di 1 μM.
    9. Caricare la cartuccia del sensore posta nella micropiastra idrata con 10x soluzioni degli inibitori mitocondriali.
      1. Aggiungere 18 μL di inibitore mitocondriale 1 nella porta A.
      2. Aggiungere 19,8 μL di inibitore mitocondriale 2 nella porta B.
      3. Aggiungere 21,6 μL di inibitore mitocondriale 2 nella porta C.
      4. Aggiungere 23,4 μL di inibitore mitocondriale 3 nella porta D.
    10. Posizionare la cartuccia caricata nella micropiastra idrata in un incubatore non a CO2 a 37 °C fino all'inizio del test.
    11. Impostare un protocollo in esecuzione nel software dello strumento (Tabella 2).
    12. Premere START. Prelevare la cartuccia caricata dall'incubatore non a CO2 e inserirla nell'analizzatore per la calibrazione.
      NOTA: Assicurarsi che la piastra sia inserita nell'orientamento corretto e senza coperchio.
    13. Una volta terminata la fase di calibrazione, rimuovere la piastra di calibrazione. Prendere la micropiastra a 96 pozzetti dall'incubatore non a CO2 e inserirla nell'analizzatore. Fare clic su CONTINUA per avviare le misurazioni.
    14. Al termine della corsa, rimuovere la micropiastra di coltura cellulare a 96 pozzetti dall'analizzatore e raccogliere il mezzo da tutti i pozzetti senza disturbare le cellule.
      NOTA: Il mezzo può essere conservato a -20 °C e utilizzato successivamente per misurare la quantità di lattato rilasciata dalle cellule nel mezzo utilizzando un kit di analisi del lattato appropriato.
    15. Lavare le cellule con 200 μL di 1x PBS in ogni pozzetto.
    16. Dopo aver rimosso il PBS, congelare la piastra a -20 °C.
      NOTA: La piastra congelata può essere utilizzata per quantificare cellule, proteine o DNA in ciascun pozzetto della micropiastra. Questa quantificazione sarà necessaria per normalizzare i tassi bioenergetici ottenuti. Seguire le istruzioni del produttore per i test di quantificazione di cellule, proteine o DNA.

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Risultati

Il protocollo qui descritto facilita la robusta generazione di organoidi rotondi (Figura 1A). Gli organoidi generati contengono neuroni maturi che possono essere visualizzati utilizzando marcatori proteici specifici per assoni (SMI312) e dendriti (proteina 2 associata a microtubuli (MAP2)) (Figura 1B). Gli organoidi maturi contengono non solo cellule neuronali (MAP2-positive) ma anche cellule gliali (ad esempio,...

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Discussione

Questo articolo descrive la generazione riproducibile di organoidi cerebrali umani derivati da iPSC e il loro uso per la modellazione della malattia mitocondriale. Il protocollo qui descritto viene modificato sulla base di un lavoro pubblicato in precedenza20. Uno dei principali vantaggi del presente protocollo è che non richiede l'incorporamento manuale di ciascun organoide in una matrice di impalcatura. Infatti, la soluzione della matrice viene semplicemente disciolta nel terreno di coltura cell...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari o non finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo Miriam Bünning per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 ad A.P.), Spark and Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds to A.P.), della United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), dell'University Hospital Duesseldorf (Forschungskommission UKD to A.P.) e del Ministero Federale Tedesco dell'Istruzione e della Ricerca (BMBF) (e: Bio giovane investigatore concede AZ 031L0211 ad A.P.). Il lavoro nel laboratorio del C.R.R. è stato sostenuto dal DFG (FOR 2795 "Synapses under stress", Ro 2327/13-1).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-mercaptoetanoloGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdSoftware di layout; Editor di grafica vettoriale
Alexa Fluor 488 asino anti-porcellino d'IndiaSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 asino anti-topoThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimicina ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulina III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Laser ad argonMelles GriotQualsiasi altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 488 va bene, anche
ascorbicoSigmaA92902
B-27 con vitamina AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% in PBS, conservare la soluzione a -20 ° C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star coltura cellulare piastra a 6 pozzettiGreiner-Bio-One657160
Concentrato lipidico chimicamente definitoGibco11905031
Microscopio a scansione laser confocale C1Nikon MicroscopioSoluzioni Microscopio confocale modulare Corning
Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basale, senza rosso fenolo, senza LDEVComponente della matriceCorning356231
Kit per il saggio di proliferazione cellulare CyQUANTThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Asino anti-capra Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Asino anti-topo Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Asino anti-coniglio Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc fotocameraNikon Microscopio
Microscopio verticale Eclipse 90i MicroscopioNikon Soluzioni
Microscopio verticale Eclipse E 600FNMicroscopio Nikon Solutions
Microscopio invertito Eclipse Ts2Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsSoftware di imaging per microscopio confocale
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Siero bovino fetaleGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Pipetta in vetro PasteurMarca747715Glutamax invertito
Gibco35050-061
Laser elio-neonMelles GriotOgni altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 594 va bene, anche
EparinaMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatoreThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Immagine J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthSoftware di elaborazione delle immagini
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Knockout Siero di RicambioGibco10828010
Laser (407 nm)CoerenteQualsiasi altro laser, ad esempio i laser a diodi che emettono 407, va bene, anche
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusProteina Stemcell Technology85850iPSC medium
Centrifuga Multifuge X3RThermo Scientific10325804
Kit di rilevamento del micoplasma MycoAlertLonza# LT07-218
N2 SupplementoGibco17502-048
Ago per uso singolo (23G x 1" TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonImaging software
Oligomicina ASigma Aldrich75351
Agitatore orbitale Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EAPer disegnare una barriera idrofobica sui vetrini.
Kit del sistema di dissociazione della papainaWorthingtonLK003150
ParaformaldeideMerck8187154% in PBS, conservare la soluzione a -20 ° C
Pipetta Pasteur 7mLVWR612-1681Graduata fino a 3 mL
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 aria DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsObiettivo per microscopio a secco
Plan Apo VC 60x / 1.40 olio DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Soluzioni per microscopioNikonMicroscopio a immersione in olio Obiettivo
Piastra di Petri in polistirene (100 mm)Greiner Bio-One664161
Tubo in polistirene a fondo tondo con tappo per filtro cellulare (5 mL)Falcon352235
Cloruro di potassioRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Carta da filtro qualitativaVWR516-0813
Inibitore di rocciaMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Lame per bisturiHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Bicarbonato di sodioMerck/Sigma31437-1kg-M
Cloruro di sodioRoth 3957
Sodio diidrogeno fosfatoApplichem131965
Sodium PiruvatoGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase Reagente di dissociazione cellulareGibco/StemProA1110501Reagente A
Super Glue GelUHU63261adesivo
SuperFrost PlusVWR631-0108
Siringa per uso singolo (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Piastra a 24 pozzettiSarstedt83.3922
Piastra TC a 6 pozzettiSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Cappaper coltura tissutaleThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo Scientific Productionterminato, anche qualsiasi altro microtomo regolabile va bene.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonista IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 analizzatore di flusso extracellulareCavalluccio marinoBioscience 100737-101
XF Assay DMEMCavalluccio marinoBioscience 103680-100
Soluzione calibrante XFCavalluccio marino Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (micropiastra a 96 pozzetti)Cavalluccio marinoBioscience 102416-100
acido Soluzioni gel medio

Riferimenti

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