Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.
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Articolo metodologico
Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L'IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l'osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l'eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l'imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l'inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L'imaging longitudinale è l'imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all'interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l'involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un'infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.
Introduzione
La microscopia intravitale (IVM), l'imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci 1,2,3. Inoltre, l'IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che go....
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Protocollo
Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida chirurgiche del laboratorio di Cold Spring Harbor ed erano state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il laboratorio di Cold Spring Harbor.
1. Fusione della finestra in silicone
- Preparare il polimero siliconico (PDMS) mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 (v/v).
- Getta una finestra depositando una piccola quantità di PDMS su una superficie sterile e liscia e regola il rapporto volume-area allo spessore desiderato.
NOTA: l'utilizzo di 200 mg ....
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Risultati
L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging può essere utilizzato per osservare, tracciare e quantificare una vasta gamma di eventi cellulari e molecolari a risoluzione di una singola cellula per un periodo di ore o settimane. Le caratteristiche ideali per una finestra di imaging includono: a) impatto limitato sul benessere del topo e sulla fisiologia del tessuto; b) durata; c) semplicità di inserimento; e d) chiari punti di riferimento per l'imaging ripetuto della stessa regione. Il risultato è una finestra in .......
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Discussione
Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l'inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l'accessibilità di questa tec.......
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Dichiarazioni
M.E. è membro del comitato consultivo di ricerca per brensocatib per Insmed, Inc.; membro del comitato consultivo scientifico di Vividion Therapeutics, Inc.; un consulente per Protalix, Inc.; d.A.T. è co-fondatore di Mestag Therapeutics, ed è nel comitato consultivo scientifico e detiene azioni di Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology e Cygnal Therapeutics. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Rob Eifert per la sua assistenza nella progettazione e ottimizzazione delle griglie in acciaio inossidabile tagliate al laser. Questo lavoro è stato sostenuto dal CSHL Cancer Center (P30-CA045508) e dai fondi per M.E. del National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; la Thompson Family Foundation; Nuota attraverso l'America; e una sovvenzione della Simons Foundation a CSHL. M.S. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio 1F30CA253993-01. L.M. è supportat....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nastro chirurgico in panno morbido 3M Medipore | Sutura | 70200770819 | |
| 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2 | Ethicon | N267H | |
| ACTB-ECFP topi | Jackson Laboratory | 22974 | |
| Kit substrato AEC, perossidasi (HRP), (3-ammino-9-etilcarbazolo) | Vector Laboratories | SK-4200 | |
| Tamponi imbevuti di alcol | BD | ||
| sistema di anestesia | Molecular Imaging Products Co. | ||
| Acqknowledge software e sensori | BIOPAC | ACK100W, ACK100M, TSD110 | |
| Betadine spray | LORIS | 109-08 | |
| c-fms-EGFP (MacGreen) topi | Jackson Laboratory | 18549 | |
| C57BL/6J topi | Jackson Laboratory | 664 | |
| CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11) | Invitrogen | 14-0451-82 | |
| CD68 Anticorpo | Abcam | ab125212 | |
| Spugne di garza Curity | Covidien | ||
| Donkey Anti-capra IgG H& L (HRP) | Abcam | ab6885 | |
| Asino Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) | Abcam | ab97064 | |
| Asino Anti-Ratto IgG H& L (HRP) | Abcam | ab102182 | |
| Dow SYLGARD 184 Incapsulante in silicone Microscopia | elettronica | Scienze 24236-10 | Bicomponente, rapporto di miscelazione 10:1 |
| Vetro di copertura rotondo, diametro 8 mm, spessore # 1,5 | Microscopia elettronica Scienze | 72296-08 | |
| Ender-3 Pro stampante 3D | Shenzhen Creality 3D Technology Co., LTD | ||
| Coperta riscaldata a infrarossi lontani | Kent Scientific | RT-0520 | |
| Fc Receptor Blocker | Innovex Biosciences | NB309 | |
| Fiji pacchetto | https://imagej.net/software/fiji/ | ||
| FluoroSpheres carbossilato, 0,04µ m, giallo-verde (505/515) | Invitrogen | F8795 | |
| Sistema di iniezione: | BIOPAC Systems Inc. | L'insieme dei componenti consente di monitorare i parametri vitali del topo durante l'imaging e l'acquisizione di immagini di gating sulla respirazione del topo. Tutti sono stati acquisiti da BIOPAC systems. | |
| Acqknowledge software | ACK100W, ACK100M | ||
| Diff. Amp. Modulo, Serie C | DA100C | ||
| Dual Gating Sys piccolo animale | DTU200 | ||
| MP160 per Windows - Sistema | analisi MP160WSW | ||
| MouseOx Plus 120V | MOX-120V; 015000 | ||
| Cuscinetto a pressione | TSD110 | ||
| Gelfoam | Pfizer | 9031508 | Spugna di gelatina assorbibile |
| Forbici fini indurite | Fine Science Tools | 14090-11 | Due paia; acciaio inossidabile, punte affilate , punta dritta, tagliente 26 mm , lunghezza 11 cm |
| Anticorpo umano/topo Mieloperossidasi/MPO | R& D Systems | AF3667 | |
| Sterilizzatore a perline calde | Fine Science Tools | 18000-45 | Accendere circa 30 min prima dell'uso; sterilizzare gli strumenti a >200 ° C per 30 s |
| Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
| Mezzo di immersione Immersol W 2010 | Zeiss | 444969-0000-000 | |
| Siringhe da insulina con ago BD Ultra-Fine 6mm x 31G 1 mL/cc | BD | 324912 | |
| Isoflurano (Fluriso) | VetOne | 502017 | |
| Lycopersicon Esculentum (Pomodoro) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594 | Vector Laboratories | DL-1177-1 | |
| LysM-eGFP | www.mmrrc.org | 012039-MU | |
| Pinza per micro dissezione | Roboz | RS-5135 | Seghettato, curva leggera, larghezza della punta 0,8 mm; lunghezza 4" |
| Pinza per microdissezione | Roboz | RS-5153 | 1 x 2 denti, curva leggera, larghezza punta 0,8 mm, lunghezza 4" |
| MTS MiniBionix II 808 | MTS Systems | Macchina per prove materiali servoidraulica | |
| Neutrophil Elastase 680 Sonda FAST | PerkinElmer | NEV11169 | |
| Nitrogen | General Welding Supply Corp. | ||
| Fornitura | generale di saldatura dell'ossigeno Corp. | ||
| Filamento di acido polilattico | Hatchbox | 1,75 mm | |
| di diametro ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen | P36970 | |
| Puralube unguento oftalmico | Dechra | NDC17033-211-38 | |
| Reflex 7 clip per ferite | Roboz Surgical | RS-9255 | |
| Griglia in acciaio inossidabile | Fotofab | Una griglia ha un diametro di 0,200 pollici, con un totale di 52 quadrati di griglia individuali che sono 0,016 x 0,016 pollici. Ci sono 0,003 pollici di spazio tra ogni quadrato. | |
| Piastre per colture tissutali sterili trattate in superficie | Fisher Scientific | FB012929 | Coperchio utilizzato come superficie di polimerizzazione per finestre di imaging |
| Microscopio multifotone TriM Scope | LaVision BioTec | Imaging è stato eseguito su un microscopio verticale a 2 fotoni (Trimscope, LaVision BioTec) dotato di due laser Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) e di un oscillatore parametrico ottico. I seguenti beamsplitter dicroici passa-lungo (Chroma) sono stati utilizzati per dirigere il segnale verso quattro tubi fotomultipler: T560LP T665LPXXR T495lxpr | |
| Vetbond | 3M | 70200742529 | |
| VWR micro vetro di copertura | VWR VWR | 48404-453 |
Riferimenti
- Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
- Haeger, A., et al.
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Ristampe e permessi
Tag
Microscopia intravitalefinestra di imaging in siliconeimaging longitudinalefinestra in polidimetilsilossanoimaging della ghiandola mammariaimaging degli organi addominalitracciamento delle cellule immunitarieimaging delle cellule tumoraliinserimento della finestra chirurgicavisualizzazione dei tessuti
