Articolo metodologico

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

DOI:

10.3791/62757

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5 gennaio 2022

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1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Abstract

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La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L'IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l'osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l'eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l'imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l'inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L'imaging longitudinale è l'imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all'interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l'involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un'infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.

Introduzione

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La microscopia intravitale (IVM), l'imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci 1,2,3. Inoltre, l'IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che go....

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Protocollo

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Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida chirurgiche del laboratorio di Cold Spring Harbor ed erano state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il laboratorio di Cold Spring Harbor.

1. Fusione della finestra in silicone

  1. Preparare il polimero siliconico (PDMS) mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 (v/v).
  2. Getta una finestra depositando una piccola quantità di PDMS su una superficie sterile e liscia e regola il rapporto volume-area allo spessore desiderato.
    NOTA: l'utilizzo di 200 mg ....

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Risultati

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L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging può essere utilizzato per osservare, tracciare e quantificare una vasta gamma di eventi cellulari e molecolari a risoluzione di una singola cellula per un periodo di ore o settimane. Le caratteristiche ideali per una finestra di imaging includono: a) impatto limitato sul benessere del topo e sulla fisiologia del tessuto; b) durata; c) semplicità di inserimento; e d) chiari punti di riferimento per l'imaging ripetuto della stessa regione. Il risultato è una finestra in .......

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Discussione

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Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l'inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l'accessibilità di questa tec.......

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Dichiarazioni

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M.E. è membro del comitato consultivo di ricerca per brensocatib per Insmed, Inc.; membro del comitato consultivo scientifico di Vividion Therapeutics, Inc.; un consulente per Protalix, Inc.; d.A.T. è co-fondatore di Mestag Therapeutics, ed è nel comitato consultivo scientifico e detiene azioni di Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology e Cygnal Therapeutics. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Rob Eifert per la sua assistenza nella progettazione e ottimizzazione delle griglie in acciaio inossidabile tagliate al laser. Questo lavoro è stato sostenuto dal CSHL Cancer Center (P30-CA045508) e dai fondi per M.E. del National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; la Thompson Family Foundation; Nuota attraverso l'America; e una sovvenzione della Simons Foundation a CSHL. M.S. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio 1F30CA253993-01. L.M. è supportat....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nastro chirurgico in panno morbido 3M MediporeSutura70200770819
4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP topiJackson Laboratory22974
Kit substrato AEC, perossidasi (HRP), (3-ammino-9-etilcarbazolo)Vector Laboratories SK-4200
Tamponi imbevuti di alcolBD 
sistema di anestesiaMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software e sensori BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) topiJackson Laboratory18549
C57BL/6J topiJackson Laboratory664
CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AnticorpoAbcamab125212
Spugne di garza Curity Covidien
Donkey Anti-capra IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Asino Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Asino Anti-Ratto IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Incapsulante in silicone MicroscopiaelettronicaScienze 24236-10Bicomponente, rapporto di miscelazione 10:1
Vetro di copertura rotondo, diametro 8 mm, spessore # 1,5Microscopia elettronica Scienze72296-08
Ender-3 Pro stampante 3DShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Coperta riscaldata a infrarossi lontaniKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji pacchettohttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carbossilato, 0,04µ m, giallo-verde (505/515)InvitrogenF8795
Sistema di iniezione:BIOPAC Systems Inc.L'insieme dei componenti consente di monitorare i parametri vitali del topo durante l'imaging e l'acquisizione di immagini di gating sulla respirazione del topo. Tutti sono stati acquisiti da BIOPAC systems.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Modulo, Serie C DA100C
Dual Gating Sys piccolo animaleDTU200 
MP160 per Windows - Sistemaanalisi MP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Cuscinetto a pressione TSD110 
GelfoamPfizer9031508Spugna di gelatina assorbibile
Forbici fini induriteFine Science Tools14090-11Due paia; acciaio inossidabile, punte affilate
, punta dritta, tagliente 26 mm
, lunghezza 11 cm
Anticorpo umano/topo Mieloperossidasi/MPOR& D SystemsAF3667
Sterilizzatore a perline caldeFine Science Tools18000-45Accendere circa 30 min
prima dell'uso; sterilizzare gli strumenti a >200
° C per 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Mezzo di immersione Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Siringhe da insulina con ago BD Ultra-Fine 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurano (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Pomodoro) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFPwww.mmrrc.org012039-MU
Pinza per micro dissezioneRobozRS-5135Seghettato, curva leggera, larghezza della punta 0,8 mm; lunghezza 4"
Pinza per microdissezioneRobozRS-51531 x 2 denti, curva leggera, larghezza punta
0,8 mm, lunghezza 4"
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsMacchina per prove materiali servoidraulica
Neutrophil Elastase 680 Sonda FASTPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
Fornituragenerale di saldatura dell'ossigeno Corp.
Filamento di acido polilatticoHatchbox1,75 mm
di diametro ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube unguento oftalmicoDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 clip per feriteRoboz SurgicalRS-9255
Griglia in acciaio inossidabileFotofabUna griglia ha un diametro di 0,200 pollici, con un totale di 52 quadrati di griglia individuali che sono 0,016 x 0,016 pollici. Ci sono 0,003 pollici di spazio tra ogni quadrato.  
Piastre per colture tissutali sterili trattate in superficieFisher ScientificFB012929Coperchio utilizzato come superficie di polimerizzazione per finestre di imaging
Microscopio multifotone TriM Scope LaVision BioTecImaging è stato eseguito su un microscopio verticale a 2 fotoni (Trimscope, LaVision BioTec) dotato di due laser Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) e di un oscillatore parametrico ottico. I seguenti beamsplitter dicroici passa-lungo (Chroma) sono stati utilizzati per dirigere il segnale verso quattro tubi fotomultipler:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro vetro di coperturaVWR VWR48404-453
in seta 3M 326895 trasparente di elaborazione delle immagini di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al.

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Microscopia intravitalefinestra di imaging in siliconeimaging longitudinalefinestra in polidimetilsilossanoimaging della ghiandola mammariaimaging degli organi addominalitracciamento delle cellule immunitarieimaging delle cellule tumoraliinserimento della finestra chirurgicavisualizzazione dei tessuti

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