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Articolo metodologico

Imaging intravitale longitudinale tramite finestre in silicone trasparente

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DOI:

10.3791/62757

⸱

5 gennaio 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Viene qui presentato un approccio per l'imaging intravitale a lungo termine utilizzando finestre in silicone otticamente chiare che possono essere incollate direttamente al tessuto / organo di interesse e alla pelle. Queste finestre sono più economiche e versatili di altre attualmente utilizzate sul campo e l'inserimento chirurgico provoca un'infiammazione e un disagio limitati agli animali.

Abstract

La microscopia intravitale (IVM) consente la visualizzazione del movimento, della divisione e della morte cellulare alla risoluzione di una singola cellula. L'IVM attraverso finestre di imaging inserite chirurgicamente è particolarmente potente perché consente l'osservazione longitudinale dello stesso tessuto per giorni o settimane. Le tipiche finestre di imaging comprendono una copertura di vetro in una struttura metallica biocompatibile suturata sulla pelle del topo. Queste finestre possono interferire con il libero movimento dei topi, suscitare una forte risposta infiammatoria e fallire a causa di vetri rotti o suture strappate, ognuna delle quali può richiedere l'eutanasia. Per risolvere questi problemi, sono state sviluppate finestre per l'imaging a lungo termine di organi addominali e ghiandole mammarie da un sottile film di polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico otticamente chiaro precedentemente utilizzato per le finestre di imaging cranico. Queste finestre possono essere incollate direttamente ai tessuti, riducendo il tempo necessario per l'inserimento. PDMS è flessibile, contribuendo alla sua durata nei topi nel tempo: sono stati testati fino a 35 giorni. L'imaging longitudinale è l'imaging della stessa regione tissutale durante sessioni separate. Una griglia in acciaio inossidabile è stata incorporata all'interno delle finestre per localizzare la stessa regione, consentendo la visualizzazione di processi dinamici (come l'involuzione della ghiandola mammaria) nelle stesse posizioni, a giorni di distanza. Questa finestra in silicone ha anche permesso il monitoraggio di singole cellule tumorali disseminate che si sviluppano in micro-metastasi nel tempo. Le finestre in silicone utilizzate in questo studio sono più semplici da inserire rispetto alle finestre in vetro con telaio metallico e causano un'infiammazione limitata dei tessuti ripresi. Inoltre, le griglie incorporate consentono un tracciamento diretto della stessa regione tissutale in ripetute sessioni di imaging.

Introduzione

La microscopia intravitale (IVM), l'imaging dei tessuti in animali anestetizzati, offre approfondimenti sulla dinamica degli eventi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare nei tessuti intatti. Le applicazioni di questa tecnica variano ampiamente, ma IVM è stato determinante nel campo della biologia del cancro per aiutare a chiarire come le cellule tumorali invadono i tessuti e metastatizzano, interagiscono con il microambiente circostante e rispondono ai farmaci 1,2,3. Inoltre, l'IVM è stata la chiave per far progredire la comprensione dei complessi meccanismi che governano le risposte immunitarie fornendo approfondimenti complementari agli approcci di profilazione ex vivo (ad esempio, citometria a flusso). Ad esempio, esperimenti di imaging intravitale hanno rivelato dettagli sulle funzioni immunitarie in relazione alla migrazione cellulare e al contatto cellula-cellula e hanno offerto una piattaforma per quantificare le dinamiche spazio-temporali in risposta a lesioni o infezioni 4,5,6,7. Molti di questi processi possono anche essere studiati attraverso la colorazione istologica, ma solo IVM consente il tracciamento dei cambiamenti dinamici. Infatti, mentre una sezione istologica offre un'istantanea del tessuto in un dato momento, l'imaging intravitale può tracciare eventi intercellulari e subcellulari all'interno dello stesso tessuto nel tempo. In particolare, i progressi nell'etichettatura della fluorescenza e lo sviluppo di reporter molecolari hanno permesso di correlare eventi molecolari con comportamenti cellulari, come la proliferazione, la morte, la motilità e l'interazione con altre cellule o la matrice extracellulare. La maggior parte delle tecniche IVM si basa sulla microscopia a fluorescenza, che a causa della diffusione della luce, rende difficile l'imaging di tessuti più profondi. Il tessuto di interesse, quindi, ha spesso bisogno di essere esposto chirurgicamente con una procedura spesso invasiva e terminale. Pertanto, a seconda del sito dell'organo, il tessuto può essere ripreso continuamente per un periodo che varia da pochi a 40 h8. In alternativa, l'inserimento chirurgico di una finestra di imaging permanente consente l'imaging dello stesso tessuto in sequenza per un periodo da giorni a settimane 7,9.

Lo sviluppo di nuove finestre di imaging è stato evidenziato come una necessità tecnologica per migliorare ulteriormente gli approcci di imaging intravitale10. La finestra di imaging intravitale prototipica è un anello metallico contenente una copertura di vetro fissata alla pelle con punti di sutura11. L'interferenza con la libera circolazione, l'accumulo di essudato e il danneggiamento del coperchio di vetro sono problemi comuni riscontrati con l'uso di tali finestre. Inoltre, la finestra prototipica richiede una produzione specializzata e la procedura chirurgica può richiedere una formazione approfondita. Per affrontare questi problemi, il polidimetilsilossano (PDMS), un polimero siliconico, che è stato precedentemente utilizzato nelle finestre craniche per l'imaging a lungo termine nel cervello12, è stato adattato per l'uso nell'imaging degli organi addominali e delle ghiandole mammarie. Qui, viene presentato un metodo dettagliato per generare finestre in silicone basate su PDMS, incluso come gettare la finestra attorno a una griglia in acciaio inossidabile per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali. Inoltre, viene descritta una procedura chirurgica semplice e priva di punti per l'inserimento della finestra sugli organi addominali o sulla ghiandola mammaria. Questo nuovo approccio supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate e aumenta l'accessibilità dell'imaging intravitale longitudinale.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida chirurgiche del laboratorio di Cold Spring Harbor ed erano state approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il laboratorio di Cold Spring Harbor.

1. Fusione della finestra in silicone

  1. Preparare il polimero siliconico (PDMS) mescolando l'elastomero di base e l'agente polimerizzante in un rapporto 10:1 (v/v).
  2. Getta una finestra depositando una piccola quantità di PDMS su una superficie sterile e liscia e regola il rapporto volume-area allo spessore desiderato.
    NOTA: l'utilizzo di 200 mg di soluzione polimerica per un cerchio di 22 mm di diametro sul coperchio di un coperchio a 24 piastre si traduce in un buon compromesso tra robustezza della finestra e chiarezza ottica.
  3. Opzionale: per fornire punti di riferimento per l'imaging ripetuto delle stesse regioni tissutali, premere leggermente una griglia in acciaio inossidabile nel silicone dopo che il PDMS si trova sulla superficie di fusione desiderata.
  4. Per rimuovere le bolle d'aria, posizionare la superficie rivestita in un essiccatore sottovuoto per 45 minuti per degassare il polimero.
  5. Polimerizzare le finestre in silicone in forno a 80 °C per 45 min.
  6. Segnare il polimero ai bordi dello stampo e staccare delicatamente le finestre indurite dalla superficie utilizzata per la fusione con pinza.
  7. Prima dell'intervento chirurgico, sterilizzare le finestre in autoclave.

2. Preparare il mouse per l'inserimento della finestra in silicone

  1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando il 4% (v/v) di isoflurano. Spostare il mouse su un cuscinetto riscaldante sul tavolo chirurgico, posizionare il mouse nella maschera nasale per anestesia e abbassare la concentrazione di isoflurano al 2% per il mantenimento durante l'intervento chirurgico.
  2. Controllare la profondità dell'anestesia pizzicando le dita dei piedi degli arti posteriori. Non procedere fino a quando il mouse non è inattivo e non mostra la risposta riflessa al pizzico della punta.
  3. Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino e prevengano traumi.
  4. Somministrare analgesia preventiva (buprenorfina 0,05 mg/kg) per via sottocutanea.
  5. Rasare il sito chirurgico e rimuovere completamente i peli con una crema depilatoria.
  6. Applicare la soluzione di povidone-iodio (10% v/ v) ed etanolo (70% v / v) consecutivamente 3 volte per prevenire l'infezione del sito chirurgico.

3. Inserimento di una finestra ventrale per l'imaging nel fegato; adattabile per altri organi addominali (Figura 1)

  1. Posizionare il mouse in posizione supina.
  2. Fai un'incisione di 10 mm a partire da 3 mm verso il basso dal processo xifoide usando forbici e pinze sterili.
  3. Rimuovere una sezione di pelle di 1-1,5 cm2 lungo la linea mediana.
  4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
  5. Opzionale: per visualizzare una porzione più grande del fegato, utilizzare tamponi di cotone sterili inumiditi con soluzione salina sterile per spingere il fegato verso il basso dal diaframma rivelando il legamento falciforme che collega il fegato al diaframma. Tagliare il legamento facendo attenzione a non tagliare la vena cava inferiore.
  6. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da visualizzare. Questo adesivo crea un sigillo circolare, lasciando intatta l'area centrale per l'imaging.
    ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso. Non è necessario asciugare il tessuto prima di applicare l'adesivo.
    NOTA: qualsiasi adesivo a base di cianoacrilato può essere utilizzato con successo per questa procedura. L'adesivo chirurgico garantisce la sterilità. Per le procedure terminali, le super colle per tutti gli usi producono buoni risultati.
  7. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
  8. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
  9. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
  10. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
    NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare di tessuto epatico deve ora essere visibile attraverso la finestra.
  11. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.
    ATTENZIONE: Se la procedura viene eseguita utilizzando tecniche chirurgiche sterili e la finestra viene sterilizzata prima dell'inserimento, è sufficiente sigillare la ferita con adesivo chirurgico per evitare infezioni. Tuttavia, la mancata osservanza di tecniche asettiche adeguate durante l'inserimento chirurgico o la chiusura imperfetta può portare a infezioni evidenti o subcliniche e all'essiccazione del tessuto.

4. Inserimento di una finestra laterale per l'imaging nel fegato; compatibile con l'iniezione concomitante di cellule tumorali nella vena porta (Figura 2)

  1. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale sinistro
  2. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco destro 3 mm sotto l'arco costale usando forbici e pinze sterili.
  3. Rimuovere una sezione di pelle di 1 cm2 .
  4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
  5. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del fegato attorno ai bordi dell'area da visualizzare.
    ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
    NOTA: qualsiasi adesivo a base di cianoacrilato può essere utilizzato con successo per questa procedura. L'adesivo chirurgico garantisce la sterilità. Per le procedure terminali, le super colle per tutti gli usi producono buoni risultati.
  6. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il fegato fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
  7. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
  8. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
  9. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
    NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare di tessuto epatico deve ora essere visibile attraverso la finestra.
  10. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.
  11. Se è necessaria un'iniezione di vena porta:
    1. Posizionare il mouse in posizione supina.
    2. Fai un'incisione di 10 mm partendo dal processo xifoide nella pelle.
    3. Usando un secondo paio di forbici sterili e pinze, fare un'incisione di 10 mm nel peritoneo.
    4. Immergere due tamponi di cotone in soluzione salina sterile.
    5. Utilizzare i tamponi di cotone per tirare delicatamente l'intestino su una garza sterile inumidita con soluzione salina sterile, facendo attenzione a non torcere o comunque sconvolgere l'orientamento.
    6. Continuare a spostare l'intestino dalla cavità addominale fino a quando la vena porta è visibile sul lato destro dell'addome.
    7. Inserire un ago da 31-33 G 5-7 mm caudale al punto di ingresso della vena porta nel fegato, assicurandosi di procedere all'interno del vaso sanguigno e non attraverso di esso.
    8. Iniettare lentamente le cellule tumorali (risospese in 100 μL di PBS sterile).
      NOTA: Per questo esperimento la linea cellulare del cancro pancreatico amurina (ad esempio, KPC-BL/6-1199) può essere coltivata in mezzi DMEM completi e 1 x 105 cellule iniettate in 100 μL di PBS sterile.
    9. Per prevenire il sanguinamento, immediatamente dopo aver ritirato l'ago, applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un piccolo pezzo di spugna chirurgica per 1-2 minuti.
    10. Dopo che la pressione è stata rilasciata, monitorare il sito per 1-2 minuti per garantire l'emostasi.
    11. Utilizzando tamponi di cotone inumiditi, riportare l'intestino nella cavità addominale seguendo l'orientamento fisiologico dell'organo.
    12. Usando una pinza sterile, inserire la finestra immediatamente sotto il peritoneo, sul lato sinistro della cavità addominale del mouse.
    13. Sutura con suture di seta 4-0 e pinzatura dell'incisione della linea mediana con clip avvolte in acciaio inossidabile da 7 mm.
    14. Spostare il mouse in posizione di decubito laterale sinistro
    15. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco destro 3 mm sotto l'arco costale attraverso la pelle usando forbici e pinze sterili.
    16. Rimuovere una sezione di 1 cm2 di pelle intorno all'incisione.
    17. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
    18. Tirare la finestra in posizione sopra il fegato prima di incollarla in posizione, come descritto nei passaggi 4.8-4.10.

5. Inserimento della finestra per l'imaging nel pancreas (Figura 3)

  1. Posizionare il mouse sulla posizione del decubito laterale destro.
  2. Fai un'incisione di 10 mm sul fianco sinistro 3 mm sotto l'arco costale usando forbici e pinze sterili.
  3. Rimuovere una sezione di 1 cm2 di pelle intorno all'incisione.
  4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili e pinze per rimuovere una sezione del peritoneo leggermente più piccola della sezione di pelle.
  5. Utilizzando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile, tirare delicatamente la milza per visualizzare il pancreas. Procedere al riposizionamento del pancreas con i tamponi di cotone inumiditi per rendere più visibile la superficie attraverso l'incisione.
    NOTA: A questo punto, le cellule tumorali pancreatiche possono essere iniettate ortotopicamente nel pancreas se fa parte del progetto sperimentale.
  6. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie del pancreas attorno ai bordi dell'area da fotografare.
    ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
  7. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro il pancreas fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
  8. Piegare i bordi della finestra sotto il peritoneo.
  9. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora si trovano sotto il peritoneo. Spingere verso il basso sul peritoneo con una pinza per fissarlo alla finestra.
  10. Allo stesso modo, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sul peritoneo prima di spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissarla al peritoneo.
    NOTA: Se eseguita correttamente, un'area circolare del tessuto pancreatico dovrebbe ora essere visibile attraverso la finestra.
  11. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.

6. Inserimento della finestra per l'imaging nella ghiandola mammaria (Figura 4)

  1. Posizionare il mouse sulla posizione supina.
  2. Fai un'incisione mediale di 10 mm su uno dei capezzoli inguinali usando forbici e pinze sterili.
  3. Rimuovere una sezione di pelle di 0,5 cm2 sopra la ghiandola mammaria.
  4. Utilizzare un secondo paio di forbici sterili per separare con cura la ghiandola mammaria dalla pelle allargando le forbici tra le due superfici per interrompere l'aderenza.
    NOTA: Per facilitare l'imaging dell'area della ghiandola mammaria inguinale, fare attenzione a sezionare una porzione di pelle sopra la ghiandola mammaria ma superiore alla zampa posteriore, in modo che la finestra non limiti la mobilità del topo.
  5. Prelevare l'adesivo chirurgico con una siringa da 31 G, applicarne una piccola quantità sulla superficie della ghiandola mammaria attorno ai bordi dell'area da visualizzare.
    ATTENZIONE: Limitare l'adesivo a piccole goccioline che formano un motivo circolare attorno all'area di imaging. Il tessuto immediatamente a contatto con l'adesivo non può essere ripreso.
  6. Posizionare la finestra con una pinza e tenerla saldamente contro la ghiandola mammaria fino a quando l'adesivo non si è asciugato (~2 min).
    NOTA: Un'area circolare di tessuto della ghiandola mammaria dovrebbe ora essere visibile attraverso la finestra se eseguita correttamente.
  7. Piegare i bordi della finestra sotto la pelle.
  8. Con una siringa, depositare una piccola quantità di adesivo chirurgico sui bordi della finestra che ora sono sotto la pelle. Spingere verso il basso sulla pelle con una pinza per fissare la pelle alla finestra.
  9. Applicare la colla intorno ai bordi della finestra per creare un bordo che aiuterà a prevenire la crescita della pelle sopra la finestra.

7. Recupero post-chirurgico

  1. Posizionare il mouse in una gabbia di recupero pulita con ampio materiale di nidificazione, assicurandosi che parte della gabbia sia appoggiata su una piastra riscaldante.
  2. Monitorare continuamente il mouse fino a quando non è cosciente e mobile.
  3. Se necessario, fornire una dose aggiuntiva di analgesico 12 ore dopo la dose preventiva.
    NOTA: l'analgesia aggiuntiva è generalmente inutile, ma consultare un veterinario se il topo mostra segni di angoscia (come schiena curva, pelliccia trasandata o perso interesse per il cibo). Monitorare il topo ogni giorno per i primi 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per segni di infezione o altri effetti avversi. Meno del 2% dei topi richiede cure veterinarie o eutanasia, in genere a causa del distacco parziale della finestra. È importante notare che per i topi maschi con finestre di imaging del fegato ventrale, il combattimento tra topi può comportare il distacco delle finestre. Questo viene evitato alloggiando i topi separatamente.

8. Imaging attraverso la finestra

  1. Anestetizzare il mouse in una camera di induzione utilizzando il 4% (v/v) di isoflurano.
  2. Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino e prevengano traumi.
  3. Spostare il mouse dalla camera di induzione allo stadio del microscopio. Posizionare il topo nella maschera nasale per anestesia e abbassare la concentrazione di isoflurano a circa l'1-1,5% per l'anestesia di mantenimento durante la procedura di imaging.
  4. Posizionare un sensore di pressione sotto il mouse per monitorare la frequenza respiratoria e fissare il mouse allo stadio utilizzando un nastro chirurgico morbido.
  5. Inserire un termometro rettale per monitorare la temperatura corporea durante la sessione di imaging.
  6. Accendere il pad riscaldato, monitorando attentamente il mouse per assicurarsi che la temperatura corporea non superi i 37 °C.
  7. Utilizzare il software per monitorare la frequenza respiratoria del mouse. La velocità ottimale è ~ 1 respiro / secondo. Regolare l'anestesia come richiesto.
  8. Prima di ogni sessione di imaging, pulire la finestra da qualsiasi mezzo di immersione residuo della lente e detriti pulendola delicatamente con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).
  9. Quando si utilizza una lente ad immersione in acqua, applicare il gel ad ultrasuoni alla finestra, evitando le bolle.
    NOTA: l'acqua distillata può anche essere utilizzata, ma potrebbe richiedere una riapplicazione durante l'imaging.
  10. Per trovare la profondità ottimale per l'imaging, in primo luogo, individuare la griglia e metterla a fuoco.
  11. Determinare la profondità approssimativa dell'imaging tissutale impostando la parte inferiore della griglia su 0. Queste informazioni sono necessarie per individuare il piano z corrispondente nelle sessioni di imaging successive.
  12. Per identificare la stessa posizione in più sessioni di imaging, utilizzare i quadrati sulla griglia come punto di riferimento. Durante l'imaging, annotare l'orientamento della griglia e la posizione all'interno della griglia di ciascun campo visivo ripreso (ad esempio,2a riga dall'alto, 4° quadrato da sinistra).
  13. Durante le sessioni di imaging successive, utilizzare la griglia per tornare a specifiche aree della griglia e quindi campi di imaging.
  14. Dopo ogni sessione di imaging, rimuovere eventuali residui di immersione della lente e detriti pulendo delicatamente la finestra con un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% (v / v).

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Risultati

L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging può essere utilizzato per osservare, tracciare e quantificare una vasta gamma di eventi cellulari e molecolari a risoluzione di una singola cellula per un periodo di ore o settimane. Le caratteristiche ideali per una finestra di imaging includono: a) impatto limitato sul benessere del topo e sulla fisiologia del tessuto; b) durata; c) semplicità di inserimento; e d) chiari punti di riferimento per l'imaging ripetuto della stessa regione. Il risultato è una finestra in ...

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Discussione

Le finestre di imaging intravitale sono strumenti importanti per visualizzare direttamente i processi fisiologici e patologici a risoluzione cellulare mentre si svolgono nel tempo. La nuova procedura descritta per la fusione e l'inserimento di finestre di imaging flessibili in silicone nei mouse supera alcuni dei problemi più comuni con le finestre di imaging attualmente utilizzate (essudato, rottura e interferenza con la normale mobilità), fornisce ulteriore sicurezza per il mouse e aumenta l'accessibilità di questa tec...

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Dichiarazioni

M.E. è membro del comitato consultivo di ricerca per brensocatib per Insmed, Inc.; membro del comitato consultivo scientifico di Vividion Therapeutics, Inc.; un consulente per Protalix, Inc.; d.A.T. è co-fondatore di Mestag Therapeutics, ed è nel comitato consultivo scientifico e detiene azioni di Mestag Therapeutics, Leap Therapeutics, Surface Oncology e Cygnal Therapeutics. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo Rob Eifert per la sua assistenza nella progettazione e ottimizzazione delle griglie in acciaio inossidabile tagliate al laser. Questo lavoro è stato sostenuto dal CSHL Cancer Center (P30-CA045508) e dai fondi per M.E. del National Institutes of Health (NIH) (1R01CA2374135 e 5P01CA013106-49); CSHL e Northwell Health; la Thompson Family Foundation; Nuota attraverso l'America; e una sovvenzione della Simons Foundation a CSHL. M.S. è stato supportato dal National Institute of General Medical Sciences Medical Scientist Training Program Training Award (T32-GM008444) e dal National Cancer Institute del NIH con il numero di premio 1F30CA253993-01. L.M. è supportato da una James S. McDonnell Foundation Postdoctoral Fellowship. J.M.A. ha ricevuto una Cancer Research Institute/Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI Award #3435). D.A.T. è sostenuto dal Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer Research e dalla Thompson Family Foundation. I cartoni animati sono stati creati con Biorender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nastro chirurgico in panno morbido 3M MediporeSutura70200770819
4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP topiJackson Laboratory22974
Kit substrato AEC, perossidasi (HRP), (3-ammino-9-etilcarbazolo)Vector Laboratories SK-4200
Tamponi imbevuti di alcolBD 
sistema di anestesiaMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledge software e sensori BIOPACACK100W, ACK100M, TSD110
Betadine spray LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) topiJackson Laboratory18549
C57BL/6J topiJackson Laboratory664
CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 AnticorpoAbcamab125212
Spugne di garza Curity Covidien
Donkey Anti-capra IgG H& L (HRP) Abcamab6885
Asino Anti-Coniglio IgG H& L (HRP) Abcamab97064
Asino Anti-Ratto IgG H& L (HRP) Abcamab102182
Dow SYLGARD 184 Incapsulante in silicone MicroscopiaelettronicaScienze 24236-10Bicomponente, rapporto di miscelazione 10:1
Vetro di copertura rotondo, diametro 8 mm, spessore # 1,5Microscopia elettronica Scienze72296-08
Ender-3 Pro stampante 3DShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
Coperta riscaldata a infrarossi lontaniKent ScientificRT-0520
Fc Receptor BlockerInnovex BiosciencesNB309
Fiji pacchettohttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheres carbossilato, 0,04µ m, giallo-verde (505/515)InvitrogenF8795
Sistema di iniezione:BIOPAC Systems Inc.L'insieme dei componenti consente di monitorare i parametri vitali del topo durante l'imaging e l'acquisizione di immagini di gating sulla respirazione del topo. Tutti sono stati acquisiti da BIOPAC systems.
Acqknowledge software ACK100W, ACK100M
Diff. Amp. Modulo, Serie C DA100C
Dual Gating Sys piccolo animaleDTU200 
MP160 per Windows - Sistemaanalisi MP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V; 015000 
Cuscinetto a pressione TSD110 
GelfoamPfizer9031508Spugna di gelatina assorbibile
Forbici fini induriteFine Science Tools14090-11Due paia; acciaio inossidabile, punte affilate
, punta dritta, tagliente 26 mm
, lunghezza 11 cm
Anticorpo umano/topo Mieloperossidasi/MPOR& D SystemsAF3667
Sterilizzatore a perline caldeFine Science Tools18000-45Accendere circa 30 min
prima dell'uso; sterilizzare gli strumenti a >200
° C per 30 s
Imaris Bitplanewww.bitplane.com
Mezzo di immersione Immersol W 2010Zeiss444969-0000-000 
Siringhe da insulina con ago BD Ultra-Fine 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
Isoflurano (Fluriso)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (Pomodoro) Lectina (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFPwww.mmrrc.org012039-MU
Pinza per micro dissezioneRobozRS-5135Seghettato, curva leggera, larghezza della punta 0,8 mm; lunghezza 4"
Pinza per microdissezioneRobozRS-51531 x 2 denti, curva leggera, larghezza punta
0,8 mm, lunghezza 4"
MTS MiniBionix II 808MTS SystemsMacchina per prove materiali servoidraulica
Neutrophil Elastase 680 Sonda FASTPerkinElmerNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
Fornituragenerale di saldatura dell'ossigeno Corp.
Filamento di acido polilatticoHatchbox1,75 mm
di diametro ProLong Diamond Antifade MountantInvitrogenP36970
Puralube unguento oftalmicoDechra NDC17033-211-38
Reflex 7 clip per feriteRoboz SurgicalRS-9255
Griglia in acciaio inossidabileFotofabUna griglia ha un diametro di 0,200 pollici, con un totale di 52 quadrati di griglia individuali che sono 0,016 x 0,016 pollici. Ci sono 0,003 pollici di spazio tra ogni quadrato.  
Piastre per colture tissutali sterili trattate in superficieFisher ScientificFB012929Coperchio utilizzato come superficie di polimerizzazione per finestre di imaging
Microscopio multifotone TriM Scope LaVision BioTecImaging è stato eseguito su un microscopio verticale a 2 fotoni (Trimscope, LaVision BioTec) dotato di due laser Ti:Sapphire (Mai Tai e InSight, Spectra-Physics) e di un oscillatore parametrico ottico. I seguenti beamsplitter dicroici passa-lungo (Chroma) sono stati utilizzati per dirigere il segnale verso quattro tubi fotomultipler:
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWR micro vetro di coperturaVWR VWR48404-453
in seta 3M 326895 trasparente di elaborazione delle immagini di

Riferimenti

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