Detta protokoll beskriver ett förfarande för att konstruera kolfiber mikroelektrod matriser för kroniska och akut in vivo elektrofysiologiska inspelningar i mus (Mus musculus) och iller(Mustela putorius furo) från flera hjärnregioner. Varje steg, efter inköp av råa kolfibrer till mikroelektrod array implantation, beskrivs i detalj, med tonvikt på mikroelektrod matris konstruktion.
Flerkanaliga elektrodmatriser ger insikt i den arbetande hjärnan och tjänar till att klargöra neurala processer på encells- och kretsnivåer. Utveckling av dessa verktyg är avgörande för att förstå komplexa beteenden och kognition och för att främja kliniska tillämpningar. Det är dock fortfarande en utmaning att tätt registrera från cellpopulationer stabilt och kontinuerligt under långa tidsperioder. Många populära elektroder, såsom tetroder och kiselmatriser, har stora tvärdiametrar som orsakar skador vid insättning och framkallar kroniska reaktiva vävnadssvar i samband med neuronal död, vilket hindrar registrering av stabil, kontinuerlig neural aktivitet. Dessutom uppvisar de flesta trådbuntar brett avstånd mellan kanaler, vilket utesluter samtidig registrering från ett stort antal celler grupperade i ett litet område. De kolfibermikroelektrodmatriser som beskrivs i detta protokoll erbjuder en tillgänglig lösning på dessa problem. Studien ger en detaljerad metod för tillverkning av kolfibermikroelektrodmatriser som kan användas för både akuta och kroniska inspelningar in vivo. De fysiska egenskaperna hos dessa elektroder gör dem idealiska för stabila och kontinuerliga långsiktiga inspelningar vid höga celltätheter, vilket gör det möjligt för forskaren att göra robusta, otvetydiga inspelningar från enskilda enheter under månader.
Elektroder och elektrodmatriser är värdefulla verktyg för att förstå hur hjärnan bearbetar information på neuronal nivå. Medan elektrofysiologiska inspelningar har varit uppnåeliga i över två århundraden1, är det fortfarande inte möjligt att samtidigt mäta aktiviteten hos hela neurala kretsar vid den rumsliga och tidsmässiga upplösningen som krävs för att fånga spikning av enskilda nervceller. Även om icke-invasiva metoder, såsom elektroencefalografi2, positronutsläpp topografi3och funktionell magnetisk resonanstomografi4 möjliggör helhjärniga mätningar, kan de inte uppnå den rumsliga och tidsmässiga upplösning som krävs för att lösa aktiviteten hos neurala kretsar2,5. Däremot kan avbildningsmetoder som optisk avbildning med spänningskänsliga färgämnen eller genetiskt kodade kalciumindikatorer uppnå rumslig upplösning med en enhet, men de utgör problem som låg temporal upplösning och dålig selektivitet3,4,5,6. Elektriska inspelningar är ett kraftfullt alternativ till dessa metoder. Inspelningselektroder ger oöverträffad temporal upplösning och gör det möjligt för användaren att göra mätningar med spiktidsprecision i någon region i hjärnan7. Dessutom möjliggör kroniskt implanterade multielektrodmatriser (MEA) storskaliga (tiotals till hundratals celler), encellsinspelningar hos betedande djur under en period av dagar till månader8,9. Kiselsonder som registrerar vid högre densiteter har dock ett stort fotavtryck och är mycket invasiva, och kroniskt implanterade matriser genererar ofta ett inflammationssvar, vävnadsinkapsling och neuronal död10,11,12,13.
Begränsningarna hos befintliga elektroder har resulterat i nya innovationer som möjliggör stabila, högupplösta och långsiktiga inspelningar. Typiska elektroder består av en metallledare, såsom volfram eller platina-iridium, eller är kisel- eller polymerbaserade. Medan metallbaserade mikrotrådsmatriser kan upprätthålla långsiktiga, stabila inspelningar, har de ett mycket större fotavtryck, med en enda tråds diameter som sträcker sig från 10-200 μm14. Däremot ger kiselbaserade elektrodmatriser inspelningar med hög rumslig upplösning, men på grund av deras relativt styva design kan de vanligtvis inte upprätthålla signalen och spela in från samma nervceller under många månader15. Den senaste utvecklingen av kiselbaserade matriser har resulterat i elektroder som på ett tillförlitligt sätt kan utföra kroniska inspelningar, men dessa matriser kan inte användas för att spela in från djupa hjärnregioner hos större djur och är avsedda för linjära inspelningar9. Framsteg inom polymermatriser har resulterat i ökad flexibilitet och registreringsstabilitet för enskilda enheter och erbjuder potential för inspelningar med hög densitet inom en snar framtid men med begränsad tillgänglighet för närvarande8,16,17. Kolfibrer möjliggör inspelningar med högdensitetsinspelningar med färdiga material som beskrivs här.
Kolfiberregistrering av mikroelektroder har använts i årtionden, med de första kolfiberelektroderna bestående av en enda kolfiber som sätts in i en glasmikropipett. Dessa mikroelektroder användes för extracellulära inspelningar med en enhet, och även om signal-till-brus-förhållandet var jämförbart med de bästa volfram-i-glasmikrokerna, var de fördelaktiga på grund av deras flexibilitet, lägre impedansvärden och enkelhet att tillverka18,19. Arbetet med att utveckla kolfiberelektrodmatriser har nyligen accelererat på grund av kolfiberns biosensingsförmåga. Förutom deras ökade biokompatibilitet och exceptionella elektriska ledningsförmåga har de en unik uppsättning egenskaper, inklusive högtemperaturbeständighet, låg relativ densitet, hög draghållfasthet, låg böjstyvhet, hög detekteringskänslighet och ett litet tvärsnittsområde10,12. Alla dessa egenskaper har motiverat utvecklingen av kolfibermikroelektrodmatriser (CFEAs) som underlättar kroniska, stabila, högavkastande inspelningar av enstaka nervceller. Sådana CFEAs kan nu tillverkas för hand20,21 ( figur1), vilket ger mikroelektrodmatriser som kan hålla enstaka nervceller under månader. Beskrivs här är en tillgänglig byggprocess för CFEAs som har anpassats på två sätt för akuta och kroniska inspelningar av enskilda nervceller i två arter.
Detta protokoll beskriver varje steg som är nödvändigt för att konstruera en funktionell CFEA för både akut och kronisk användning. Den beskrivna processen är anpassningsbar till forskarens behov, vilket gör det till ett tillgängligt och billigt alternativ för övervakning av enskilda neuroner över månader. Protokollet visar möjligheten att registrera både robust en enhet aktivitet inom några minuter efter implantation i ett bedövad djur, och över fyra månader i ett vaken, beter sig djur, illustrerar potentialen hos dessa CFEAs att studera kortsiktiga och långsiktiga förändringar i neurala svar.
Stegen i det beskrivna protokollet har testats noggrant och förbättrats med tiden för att ge ett effektivt förfarande som kan slutföras snabbt, till en låg marginalkostnad (< $ 100.00), med förmågan att registrera otvetydiga enskilda enheter, tätt och stabilt över månader. Konstruktionsstegen kan slutföras på mindre än en dag och kommer att producera elektrofysiologiska signaler som är jämförbara med alla ledande kommersiella matriser. CFEAs har också ett mycket mindre fotavtryck (16-kanals bunt av fibrer har en diameter på ~ 26 μm) än liknande kommersiella matriser, och deras biokompatibilitet gör dem lämpliga för långvarig användning13. Viktigt är att det finns flera kritiska steg och instruktioner som måste följas för att producera en fungerande CFEA med jämförbar prestanda.
På grund av kolfibrernas bräcklighet måste de hanteras med största försiktighet. Hantering av dem med vassa tångar eller andra verktyg kan leda till att fibrerna bryts. Dessutom är det viktigt att konstruera CFEAs i ett utrymme med begränsad luftrörelse så att fibrerna inte blåser bort. Vid flamning av fibrernas bakre del behöver tändaren bara flyttas i en fram och tillbaka rörelse mycket kort, i cirka 1 s. Stegen efter denna borttagning av isolering är avgörande för att konstruera en elektrod med arbetskanaler. De flammande spetsarna ska matas in i jiggen utan ytterligare kontakt. Sedan, när du fyller bassängen med dentalcement, är det viktigt att cementet appliceras noggrant och fyller kanalerna och trattbassängen och stänger av öppningarna utan att fylla dem. Tandcementet ska sedan härdas helt med UV-ljus innan du fortsätter. När detta är klart ska silverfärg injiceras i varje kanal tills den är helt fylld men inte spilla ut. Detta är det mest varierande steget i processen. All överfyllning kan producera korstalk mellan kanaler, och otillräcklig fyllning kan leda till ett anslutningsfel. Om det inte går att injicera silverfärg med en 25 G-nål är det troligt att lösningen är för trögflytande och i detta fall kan en liten mängd färgförtunnande läggas till för att skapa en mer flytande lösning. När alla kanaler är fyllda och huvudtätkontakten är insatt är det viktigt att låta matrisen härda i 24 timmar innan du säkrar kontakten med tandcement. Vi fann att underlåtenhet att göra detta sänkte antalet anslutna kanaler. Att applicera en generös mängd tandcement är också viktigt så att kontakten inte kopplas bort vid gränssnitt med signalförvärvssystemet. Om de lossnar är det möjligt att försöka återansluta med upprepad fyllning av kanaler med silverfärg, men användaren bör testa CFEA: s impedansvärden för att bedöma antalet anslutna kanaler. Att låta tandcementet härda över natten bidrar också till att förhindra potentiell avskildhet.
Mätning av elektrodens impedans ger en korrekt uppskattning av anslutna kanaler. Detta kan göras efter nedsänkning av mark- och referensledningarna och kolfiberspetsarna i PBS. Vi har observerat att en hög impedans (>15 MΩ) tyder på en öppen, oansluten kanal. Innan du injicerar ström och elektroplätering kan en ansluten kanal ha en rad impedansvärden som bör minska avsevärt med denna process. Det genomsnittliga antalet anslutna kanaler (impedans < 4 MΩ efter aktuell injektion) per 16-kanals elektrod var 12,96 ± 2,74 (genomsnittlig ± SD; N = 48 elektroder). Ett antal elektropläteringstider testades och 30 s gav överlägsen signalisolering bland inspelningsplatserna(figur 5). Även om det har varit välkänt att PEDOT-pTS12,24,25,26 och PEDOT-TFB21 ger tillförlitliga alternativ för att förbereda kolfiberinspelningsplatser, fann vi att plätering med guld, en beprövad och pålitlig metod för elektroplätering av elektroder för kronisk implantation27,28 , ökade lättheten i implantationen och hindrade elektrodspetsarna från att klumpa ihop sig. Vid produktion av slutliga impedansvärden på mindre än 0,2 MΩ i genomsnitt visar sig denna metod vara jämförbar med de värden som uppnåtts med PEDOT-TFB21 och PEDOT-pTS26.
Vid implantering av mikroelektrodmatrisen är det viktigt att visuellt följa införandet av kolfiberspetsarna under mikroskopet. Framgångsrik insättning bör vara uppenbar, utan böjning av fibrerna. Om fibrerna verkar buckling, är det osannolikt att de framgångsrikt kommer in i hjärnan. I detta fall bör sondens vinkel justeras för ett andra försök. Den här processen kan fortsätta tills införandet av avsökningen lyckas. När elektroden är på önskat djup har vi funnit att vänta minst 30 min gör det möjligt för sonden att nöja sig med optimal signalförvärv (akuta inspelningar).
CFEAs som beskrivs, förutom deras lilla fotavtryck och biokompatibilitet, erbjuder ett robust, anpassningsbart alternativ till kommersiella matriser på grund av deras enkla konstruktion och låga kostnad. Den största begränsningen för CFEAs som beskrivs i detta protokoll är deras skalbarhet. På grund av den manuella karaktären hos deras konstruktion kan det inte vara praktiskt att skala upp till mönster med hundratals inspelningsplatser. Dessutom kommer framsteg inom mikroelektrodmatristillverkning med hjälp av nanoteknik att möjliggöra storskaliga befolkningsregistreringar än de metoder som beskrivs här. Detta protokoll ger dock CFEA tillgänglighet till laboratorier som är intresserade av bänkskiva tillverkning av kolfiber elektroder. Vi observerade ingen förlust av stabilitet eller minskad robusthet i spik amplitud under varaktigheten av 120-dagars kroniska experiment, vilket indikeras av en representativ enda kanal som är typisk för våra observationer på den tidsskalan (figur 6A–E). Dessutom visar CFEA kapaciteten för ihållande enenhetsaktivitet, eftersom fyra enskilda enheter förblev urskiljbara 11 månader efter implantation i musen(figur 6G, H). Det är också möjligt att få stabila enenhetsinspelningar akut (figur 7), vilket ger en fördel jämfört med många andra kommersiella elektroder för studier av enskilda neuroner under korta tidsperioder. I framtiden kommer utvecklingen av sådana flexibla, biokompatibla sonder med minimala diametrar att möjliggöra studier av komplexa processer. Dessa verktyg kommer att ge betydande nytta i utvecklingen av neural teknik, inklusive applikationer i brain-machine interfaces (BMI), som kräver kontinuerlig, långsiktig stabilitet29.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Greg Guitchounts för vägledning med elektroddesign och konstruktion och Tim Gardner för att ha öppnat sitt labb och anläggningar för oss. Vi vill tacka Christos Michas för hans hjälp med PDS-användning vid kärnanläggningen Bio-Interface and Technology och Neil Ritter, Jon Spyreas och David Landesman för deras hjälp med att utforma tidiga versioner av den 16-kanaliga jiggen. Vi vill tacka Tim Cavanaugh för hans hjälp med SEM-avbildning vid Center for Harvard Nanoscale Systems vid Harvard.
#10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool – sharp-tipped |
30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Deionized water | Electroplating component | ||
Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
JRClust | Ferret spike sorting software | ||
Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
Sticky notes | Post-it | Building tool | |
Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |