Summary
Vi beskriver en dissektionsteknik, der bevarer arkitekturen i det neuromuskulære kryds og muliggør en detaljeret immuncytokemisk undersøgelse af motoriske neuroner i det voksne Drosophila-ben .
Abstract
Drosophila melanogaster repræsenterer en genetisk tractable model til at studere neuronal struktur og funktion, og efterfølgende ændringer i sygdomstilstande. Det godt karakteriserede larve neuromuskulære kryds bruges ofte til sådanne undersøgelser. Men, hurtig larve udvikling efterfulgt af muskel histolyse og nervesystem remodeling under metamorfose gør denne model problematisk for studiet af langsomme aldersafhængige degenerative ændringer som dem, der forekommer i amyotrofisk lateral sklerose. Alternativt lever voksne fluer i 90 dage, og det voksne ben kan bruges til at studere motoriske neuronændringer i løbet af voksenlevetiden ved hjælp af in vivo fluorescerende billeddannelse gennem neglebånd. Her beskriver vi en ben dissektionsteknik kombineret med immunocytokemi, som giver mulighed for undersøgelse af molekylære ændringer ved det neuromuskulære kryds af identificerede voksne benmotorneuroner. Disse teknikker kan kombineres med et utal af antistoffer, der mærker både præ- og postsynaptiske strukturer. Sammen disse procedurer giver mulighed for en mere fuldstændig karakterisering af langsomme aldersafhængige ændringer i voksne fluer og kan anvendes på tværs af flere motor neuron sygdom modeller.
Introduction
Motor neuron (MN) sygdomme omfatter en gruppe af heterogene tilstande, der omfatter progressiv degeneration fører til muskelsvind og lammelse som en primær klinisk fænotype1. Selv om det er sjældent med en global prævalens på 4,5 pr. 100.000, forventes denne prævalens at stige med en aldrende befolkning2. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er den mest almindelige MN-sygdom (MND) og er typisk dødelig inden for kort tid efter diagnosen uden eksisterende sygdomsmodificerende behandlinger til rådighed3. MND'er har fælles en langvarig presymptomatisk fase med tidlige molekylære biomarkørændringer og funktionelle billeddannelsesændringer set hos patienter4. Tidlig præymptomatisk cellulær patologi observeres også i ikke-menneskelige sygdomsmodeller5,6,7,8. Studiet af tidlige ændringer på neuromuskulære junction er vigtigt for at forstå MN sygdom patogenese og kan støtte i udviklingen af tidlig diagnostik og potentielle therapeutics.
Et væld af genetiske og molekylære værktøjer findes i Drosophila at dissekere strukturen og funktionen af neuromuskulære junction (NMJ, se9 for en gennemgang af godt karakteriseret larve NMJ). Disse værktøjer kombineret med en kort levetid gør Drosophila en fremragende model til at studere neurodegenerative ændringer på NMJ. Specifikt, MNs innervating voksne muskler er til stede i hele ~ 90-dages voksen levetid og er underlagt normale aldringsprocesser10,11,12,13. De voksne MNs giver derfor mulighed for at studere langsomme degenerative ændringer i modsætning til larve NMJs, som eksisterer for kun en kort ~ 1 uge periode før metamorfose14,15.
Her beskriver vi en dissektionsprocedure, der giver os mulighed for at foretage immuncytokemisk analyse af MN'er i voksenbenet. Hvert voksent ben er innerveret af ~ 50 MNs, som synapse på det tilhørende ben muskuløs til at drive bevægelse. Benanatomien, den mekaniske fysiologi og neurobiologien er blevet godt beskrevet16,17,18. Axon arbors af ben MNs har tidligere været karakteriseret ved billeddannelse gennem neglebånd i back-fyldt eller genetisk mærket cellepopulationer ved hjælp af bipartit Gal4/ UAS system og billeddannelse metoder er blevet offentliggjort tidligere19. Dissektionsmetoderne, der præsenteres her, bevarer axonforgreningmorphology og giver os mulighed for at udnytte en bred vifte af antistoffer til at mærke forskellige molekylære komponenter i NMJ. Vores tidligere arbejde har fokuseret på fremskrivninger af en defineret MN i metathoracic (3rd) ben, som innerverer skinnebenet levator muskel (tilm) og viser konsekvent arborization mønstre og bouton numre. Oprindeligt studerede vi aldersafhængige ændringer i Drosophila superoxid dismutase 1 (dsod1) mutanter og fandt ændringer i overensstemmelse med demontering af NMJ20. Disse dissektionsmetoder giver mulighed for bedre at karakterisere langsomme degenerative ændringer på NMJ for andre ALS-modeller, grundlæggende undersøgelser af aldring og andre MN-tilknyttede sygdomme.
Figur 1. Arbejdsgangsoversigt for dissekering af ben. Se protokollen for at få detaljerede trin. (A,B) Fluer vælges og bedøves. (C) Fluer overføres til methanol og vaskes med PBS. (D) Metathoracic ben fjernes i bunden af coxa mens visualiseret med en dissekering mikroskop (~ 30x forstørrelse); skalalinje = 500 μm. (E) Benene fastgøres derefter i 3,7% formaldehyd/PBS (FA) opløsning i 30 minutter i brønde på 24-brøndsplader, og derefter fjernes FA ved vask med PBS. (F, G, H) Ben overføres til silikone elastomer dissekering bakker og et stykke neglebånd fjernes fra den proksimale lårben ved hjælp af facet sammenkrump, mens visualiseret under en dissekering mikroskop på 80x; skalalinje = 50 μm. (I) Benene er post-dissektion fastsat i FA og vasket i PBS og derefter PBT (PBS + 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel). (J) Benene udsættes for immuncytokemisk farvning. (K, L) Ben overføres til en glasrutschebane, ryddes i monteringsmedier og dækkes med en coverlip indeholdende lerstykker; vægtstænger = 2 mm og 500 μm. (M) Benene er afbildet af konfokal mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Procedurerne for udarbejdelse af arbejdsløsninger, der anvendes sammen med denne protokol, er beskrevet i tabel 1.
| Reagens | Præparation | Oplagring | |||
| PBS | Lav et arbejdslager på 1x PBS fra en 10x PBS lagerløsning ved fortynding i destilleret vand. PH af den arbejdende PBS lager bør være 7,2- 7,4 | 4 °C i 1+ måneder, indtil bakteriel forurening er synlig. | |||
| PBT | 1x PBS-opløsning med 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel. | 4 °C i 1+ måneder, indtil bakteriel forurening er synlig. | |||
| FA | 3,7% formaldehydopløsning fremstillet af en 37% formaldehydbestand og fortyndet i 1x PBS. | Rumtemperatur. Lav frisk hver dag af dissektion | |||
| FORSIGTIG: Formaldehyd leveres som 37% lageropløsning er et potentielt kræftfremkaldende stof og bør fortyndes i en røghætte. | |||||
| 5% NGS | 5% normalt gedeserum fortyndet i PBT. Det anvendte serum skal svare til arten af det sekundære antistof, der skal anvendes. | 4 °C i flere uger, indtil bakteriel forurening er synlig | |||
Tabel 1. Løsninger til udførelse af immunocytokemi i det voksne Drosophila-ben .
1. Indledende fiksering af væv
- Vælg ca. 10 fluer for hver genotype og alder. Bedøve på en flyvepude under kuldioxid (figur 1A, B).
BEMÆRK: Begynd med flere fluer end nødvendigt for at sikre en stor nok prøvestørrelse efter dissektion. - Brug en pensel, overfør fluer til kold methanol i en glasbrønde eller skål i ca. 30 sekunder til 1 minut (Figur 1C). Methanolen opløser de cuticular kulbrinter og fluer kan nu nedsænkes i stedet for at flyde i vandige opløsninger.
- Med sammenkrerne overføres fluer omhyggeligt til PBS. Skyl 3x i iskold PBS for at fjerne overskydende methanol og hold fluer i PBS på is indtil dissektion og fiksering. På dette tidspunkt dissekerer fluer og repareres inden for den kortest mulige tid (<30 minutter).
- For at isolere ben, overføre fluer til en silikone elastomer dissektion parabol fyldt med kolde PBS, fjerne metathoracic ben på coxa ved hjælp af to par # 5 Dumont sammenkævninger eller skære benene med Vanna saks (Figur 1D). Overfør benene til en brønd i en plastik 24 brønd plade fyldt med 1 mL PBS og holde pladen på is, indtil alle ben er fjernet og overført til brønde.
BEMÆRK: Hver brønd kan holde mindst 20 ben. - Udskift PBS-opløsningen med 1 mL FA-opløsning, og roter på en nutator i 30 minutter (Figur 1E). Nutatorindstillingen skal indstilles med en medium hastighed (17 rpm). Sørg for, at benene er helt nedsænket i FA-opløsning i løbet af denne tid for tilstrækkelig fiksering.
- For at fjerne FA-opløsning skal du hurtigt vaske 1 mL PBS 3x efterfulgt af yderligere 3 vaske i 5 minutter hver i 1 mL PBS. Hold væv i 1 mL PBS på is før og under dissektionstrinnene beskrevet nedenfor.
2. Fjernelse af ben neglebånd og antistof farvning
- Fjernelse af ben neglebånd
- Dissekeringskræfterne er afgørende for succes. Introducer små parallelle bøjninger i begge ben i slutningen af # 5 super fine tang for at give en facet, der gør det muligt for kutikula at blive grebet overfladisk i stedet for at blive prikket, hvilket kan ødelægge vævet (Figur 1F, G).
BEMÆRK: Ben, der er bøjet parallelt, bør stadig komme i kontakt med hinanden i hele grenens længde, når de lukkes (figur 2). - Overfør ben til en silikone elastomer skål i PBS til dissektion. Orient et ben, så den forreste side vender op (se figur 3 for benanatomi og orienteringsoplysninger). Hold skinnebenet mod silikoneelastomerskålen ved hjælp af et par sammentak. Brug de andre sammenkrøpper holdt facet side ned, grab et stykke neglebånd på den distale ende af lårbenet og trække i den proksimale retning mod trochanter.
- Hold metodisk fjernelse af neglebånd, indtil den nøgne muskel er synlig i hele den proksimale ende af lårbenet (Figur 1F, G, H).
BEMÆRK: Lav kun overfladisk kontakt med benene ved hjælp af den skrå side af sammentrækningerne for at undgå at trække muskler. - Når alle ben er dissekeret, skal du udskifte PBS med FA for at post-fix ben i 30 minutter med rysten på en nutator ved medium hastighed (Figur 1I). Vask prøver i 1 mL PBS i 3 gange hurtigt og derefter 3 gange i 5 minutter hver i PBT (Figur 1J).
BEMÆRK: Hvis farvning med monoklonalt antistof NC82 (anti-bruchpilot) til at mærke aktive zoner, post-fix i 20 minutter, da dette antigen er følsomt over for længere fikseringer.
- Dissekeringskræfterne er afgørende for succes. Introducer små parallelle bøjninger i begge ben i slutningen af # 5 super fine tang for at give en facet, der gør det muligt for kutikula at blive grebet overfladisk i stedet for at blive prikket, hvilket kan ødelægge vævet (Figur 1F, G).
Figur 2. Modificerede sammentrækninger, der anvendes til dissekering af voksne ben. (A) Enderne af sammenkøjene bøjes og derefter fladtrykt i bunden (pilen) skabe en facet ved at indgive på en slibesten. (B) Derimod er ben af uændrede tang ikke bøjet. Skalalinje = 1 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
- Antistoffarvning
- Hvis du vil blokere væv for antistoffarvning, skal 1 mL PBT udskiftes med blokerende opløsning bestående af 1 mL 5% NGS fortyndet i PBT. Inkuber dissekerede ben i 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C, mens de vugger på en nutator ved medium hastighed (17 rpm). Under alle inkubationer skal du dække brønde med tætningstape ud over plastdækslet (figur 1J).
BEMÆRK: 24 brøndplader anvendes til immuncytokemi i stedet for 1,5 mL eller 2 mL mikrocentrifuge, fordi tidligere forsøg på at bruge mikrocentrifugerør resulterede i brækkede ben og beskadiget væv. - Fjern blokeringsopløsningen, og tilsæt 300 mL primære antistoffer fortyndet i frisk blokeringsopløsning. Den lille mængde antistof, der anvendes, skal være tilstrækkelig til at dække vævene. Forsegle brønde igen med laboratorieforseglingstape og plastlåg og inkuberes natten over ved 4 °C med rystelser på en nutator ved middel hastighed (figur 1J). De fungerende antistofreagensinformationer og koncentrationer, der anvendes i disse undersøgelser, er beskrevet i tabel 2.
- Vask primære antistoffer i 1 minut PBT i 3 gange kort og derefter 3 gange i 15 minutter hver (figur 1J).
BEMÆRK: Fortyndede primære antistoffer kan lagres og genbruges, hvis de opbevares ved 4 °C i op til 2 uger. - Bloker væv igen i 1 mL på 5% NGS i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 C (figur 1J).
- Fjern 5% NGS-blokeringsopløsningen og tilsæt 300 μL af de relevante fortyndede fluorescerende konjugerede sekundære antistoffer. Derudover tilsættes 1:2000 fortynding af fluorescens-konjugeret phalloidin at mærke muskel (Figur 1J).
- For sekundære antistof inkubationer, forsegle brønde med laboratorieforsegling tape og låg. Wrap plader i aluminiumsfolie for at beskytte fluorophores fra lys. Inkuberes i 6-8 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Vask sekundære antistoffer og fallloidin som beskrevet i trin 2.2.3 ovenfor. Dækplader med aluminiumsfolie i mellem vasker for at beskytte fluorophores fra lys.
- Hvis du vil blokere væv for antistoffarvning, skal 1 mL PBT udskiftes med blokerende opløsning bestående af 1 mL 5% NGS fortyndet i PBT. Inkuber dissekerede ben i 4 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C, mens de vugger på en nutator ved medium hastighed (17 rpm). Under alle inkubationer skal du dække brønde med tætningstape ud over plastdækslet (figur 1J).
3. Montering af ben
- Overfør ben til et dias ved hjælp af sammenkædning og orientere forreste side op. Dæk benene med monteringsmedier (Figur 1K, L).
BEMÆRK: De dissekerede ben kan aspireret med en P1000 pipettespids, hvis bundboringen udvides ved at skære med et barberblad. - Tilføj ler afstandsstykke til en 22x22 mm2 coverslip (# 1,5 tykkelse) ved at skrabe coverlip hjørner på tværs af en lille kugle af modellering ler. Hvert hjørne skal have en lille mængde ler 1-2 mm tyk (Figur 1K).
- For at dække diaset skal du tilføje coverlip med ler afstandsvæslerne mod diaset og forsigtigt skubbe på hjørnerne, indtil coverlip bare rører overfladen af lårbenet.
- For at undgå fordampning forsegles kanterne af dækslet med neglelak og tørres på et mørkt sted (ca. 10 minutter), før der opbevares ved 4 °C indtil billeddannelse.
4. Billeddannelse
- Billede efter konfokalt mikroskop (Figur 1M). Medtag en transmitteret lyskanal for bedre at vurdere kvaliteten af dissektionen, og prøver med synligt forstyrrede muskelfibre i interesseområdet bør kasseres.
- Begynd billeddannelse z-stakke med 20x forstørrelse med 2x zoom og en samlet billeddybde på ~ 40 mm svarende til tykkelsen af lårbenet. Til lysstofrørs signaldetektering skal du tage billeder ved opløsninger, der er i overensstemmelse med Nyquist-prøveudtagning (vi bruger 1024 x 1024 pixels med en borindstilling på 8-10 μs/pixel). Signalintensiteten skal være i det lineære område, som opnås ved at justere indstillingerne for højspændingsforøgelse. Når gain-indstillingerne er indstillet for en række prøver i et eksperiment, bør de ikke ændres, så signalintensiteterne kan sammenlignes mellem prøverne.
- For billeddannelse synaptiske boutons og andre subcellulære struktur, fange confocal billeder på ≥60x forstørrelse. Detektorindstillingerne skal være i det lineære område, mens pixeltætheden, boreindstillingerne og z-dybden skal være ens for billeder, der er taget ved lavere forstørrelse (trin 4.1).
Representative Results
Figur 4 viser et repræsentativt eksempel på et metathoracisk ben, der er plettet med anti-hrp, anti-dlg og fallloidin. For dissektioner, der fjerner neglebånd fra den proksimale del af lårbenet, stereotype arbors vil være synlige i nærheden af senen, som opdages let ved autofluorescence. Bemærk, at antistofindtrængning i benet forekommer i en kort afstand ud over det område, hvor kutikula er blevet fjernet (Figur 4A). Disse regioner kan afbildes effektivt, når der er et stærkt fluorescenssignal. Billeddannelse ved lav forstørrelse (20x med en 2x zoom) giver en nem bestemmelse af 1) hvor meget neglebånd er fjernet, og 2) om skaden opstod under dissektion. Øget forstørrelse (60x) viser stereotype fremskrivninger på tilmamen (Figur 4B). Vores arbejde har fokuseret på en MN, sandsynligvis stammer fra I-MN afstamning, som innervere tilmamen i den proksimale lårben (boks, Figur 4B og Figur 4C). Øget forstørrelse yderligere (100x med 2x zoom) giver mulighed for effektiv visualisering af synaptiske boutons (Figur 4D).
For at studere morfologiske ændringer på den voksne NMJ over tid har vi tidligere brugt dsod1 mutanter som model af ALS. Bouton hævelse forekommer hos alderen dsod1H71Y mutanter i forhold til dsod1nulland dsod1 + (Figur 5A, B). Ved larven NMJ bruges monoklonale antistof NC82 ofte til at mærke aktive zoner, og dette kan disse strukturer let visualiseres på den voksne NMJ (Figur 5C). Svagt positive HRP axon grene er rigelige i dsod1H71Y mutanter og disse grene viser ofte svag og diffus BRP lokalisering (pile).
Vigtigt for neurodegeneration, kommercielt tilgængelige antistoffer kan opdage allestedsnærværende proteiner ofte findes i aggregater, og vi har opdaget allestedsnærværende aggregater i terminal axoner af MNs i alderen mutant dsod1 fluer samt inden for muskler (Figur 6A). Antistoffer, der mærker mitokondrier, kan også påvise morfologiske ændringer med alderen (Figur 6B).
For nogle præparater gør muskelskader under dissektionen prøven ubrugelig. I første omgang kan en sådan skade være en almindelig begivenhed, men forbedring sker med praksis. Eksempler på gode dissektioner er figur 7A, C, mens dårlige dissektioner er vist i figur 7B, D. Dårlige dissektioner forårsager uorganisering af muskelfibre som detekteret ved fasekontrastmikroskopi (Figur 7B) eller manglende muskelfibre visualiseret af fluorescerende konjugeret fallloidin (Figur 7D, pil). Kombinationen af at bruge phalloidin til at mærke muskel, og transmitterede lysbilleder kan bidrage til at opdage sådanne muskelskader, som måske ikke er synlige, når de ser under en dissekering mikroskop.
Figur 3. Drosophila-benets anatomi. (A) Diagram over den forreste side af et metathoracisk ben, karakteriseret ved tilstedeværelsen af børster i modsætning til den fremtrædende nøgne neglebånd til stede på den bageste side. Det segmenterede ben består af coxa (Cx), trochanter (Tr), lårben (Fe), skinneben (Ti), 5 tarsale segmenter (Ta1-5) og klo (Cl) i rækkefølge fra proksimalt (Pr) til distal (Di). Dorsale (D) og ventrale (V) sider af lårbenet er også angivet. Skalalinje =100 μm. (B) Diagram over lårbenet indeholder skinnebenet levator (tilm), skinneben depressor (tidm), lang sene muskel 2 (ltm2) og skinneben reductor (tirm) muskler og axon fremskrivninger i proksimale lårben innervating tilmamen. Disse stereotype axonal fremskrivninger formodes at være afledt af I-afstamning neuroblaster16, og den anden arborization er den nemmeste at få adgang til ved dissektion (boxed). Skalalinje = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Dissekerede metathoracic lårben afslørede stereotype MN arkitektur innervating tilmamen. Immuncytokemi blev brugt til at mærke neuroner (HRP), diske store (DLG) og muskel (phalloidin). Z-stakke blev fanget af konfokal mikroskopi billeddannelse gennem hele lårbenet og vist som en maksimal serie projektion. (A) En transmitteret lyskanal blev også inkluderet for at illustrere, at der ikke opstod påviselige muskelskader under dissektionen. Billedet blev taget ved 20x forstørrelse, skalalinje =50 μm. (B) Identificerede arbors, der er knyttet til tilmamen (bokseområde, i midten), skalalinje =20 μm og (C) ved 60x forstørrelse, skalastang = 20 μm. d) DLG omkringliggende boutons var tydelig hos vilde dyr, når de blev afbildet ved 100x forstørrelse med 2x zoom skalalinje = 2 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksempel på aldersafhængige ændringer i bouton morfologi, som kan detekteres ved hjælp af benet dissektion teknik. Bouton hævelse ses i alderen dsod1H71Y mutanter. (A) Repræsentative billeder af HRP farvede boutons fra unge (nyligt lukkede, dag 0 voksne) og gamle (dag 10) fluer, skala bar = 1 μm. (B) Bouton-størrelserne blev kvantificeret fra de respektive genotyper ved hjælp af målefunktionen i ImageJ. p<0.0001 (2-vejs ANOVA med post-hoc Tukey test). C) Aktive zoner inden for synaptiske boutoner mærket med monoklonalt antistof NC82 (anti-bruchpilot) skalalinje = 1 μm. Figur ændret fra20Påklik klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Almindelige markører forbundet med neurodegenerativ sygdom, der anvendes i Drosophila ben præparater. (A) Subcellulære polyubiquitinerede aggregater påvises i terminalakser og muskler af alderen dsod1H71Y fluer. Immuncytokemi ved hjælp af anti-polyubiquitin (FK2) registrerer punktta (pile) i alderen dsod1H71Y/H71Y, skalalinje = 20 μm (venstre) og 5 μm (højre). (B) Opsvulmet mitokondrier kan påvises ved hjælp af anti-ATP5A, skala bar = 1 μm. Figur ændret fra20Påklik klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Eksempler på gode og dårlige dissektioner. (A) Dissektion, som ikke forstyrrede den underliggende muskelarkitektur. (B) Et eksempel på en dårlig dissektion, som viste flossede muskelfibre (pil) og ikke kunne bruges til analyse. Begge prøver blev afbildet ved fase-kontrast mikroskopi. Skalalinje = 50 μm. (C) Eksempel på en god dissektion afbildet ved konfokal mikroskopi med HRP (grøn) og phalloidin (blå). (D) En dårlig dissektion mangler rygmuskelfibre af TILM mangler (pil). Skalalinje = 50 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
| Antistof/plet | Fortynding* |
| Anti-ATP5A | 1:500 |
| Anti-bruchpilot (nc82) | 1:20 |
| Anti-cystein streng protein (ab49) | 1:50 |
| Store anti-diske (4F3) | 1:200 |
| Anti-hrp | 1:550 |
| Anti-polyubiquitin (FK2) | 1:1000 |
| Anti-repo (8D12) | 1:5 |
| Ged anti-mus sekundært antistof | 1:800 |
| Phalloidin | 1:2000 |
| * Fortynd i 5% NGS |
Tabel 2. Antistoffer og fortyndinger. De kommercielle leverandører af de antistoffer, der anvendes i disse undersøgelser, er opført på materialelisten.
Discussion
Drosophila voksenbenet er en ideel model til at studere neurodegeneration givet relativ enkelhed med velkaraktererede MNs kortlagt fra neuroblast slægter og stereotype arborization mønstre. Flere rapporter har tidligere brugt ben MNs til undersøgelse af neurodegenerativ sygdom21,22. Disse undersøgelser udnyttede GFP-udtrykke linjer kombineret med mosaik analyse med en undertrykkelig celle markør (MARCM) til billede gennem neglebånd og dokumenteret en række morfologiske ændringer. Imaging voksne NMJs af immunocytochemistry med resected kutikula muliggør yderligere karakterisering med evnen til at spore komplekse molekylære ændringer ved hjælp af en værktøjskasse af antistoffer til rådighed.
Immunocytomidelen af denne protokol er relativt standard og kan implementeres uafhængigt af genotype (se23 for en fremragende beskrivelse af generelle antistoffarvningsmetoder til brug med Drosophila). Desuden kan parametre som fluorescensintensitet, axongrenlængde og boutonnumre og størrelse bestemmes ved hjælp af en række tilgængelige ImageJ-makroer, når billederne er taget, og der er offentliggjort detaljerede metoder til kvantitativ analyse (f.eks. se 24,25,26). Således dissektion teknik er den vigtigste innovation beskrevet her. Før dissektion nedsænkes fluer i en alkohol for at fjerne cuticular kulbrinter. Både ethanol og methanol er almindeligt anvendt til dette formål; Vi har dog kun brugt methanol. Afgørende for dissektion succes er flere faktorer: For det første, ved hjælp af modificerede sammenkædninger med en facet giver mulighed for meget overfladisk kontakt med neglebånd. For det andet ved hjælp af en dissekering mikroskop i stand til 60-100x samlede forstørrelse, således at overfladen af neglebånd er tydeligt synlig. For mikroskoper med lavere maksimal forstørrelse er 2x mål tilgængelige for de fleste almindelige mærker og bør være tilstrækkelige, når de kombineres med eksisterende linser. For det tredje gør det første fikseringstrin neglebånd skørt og lettere at trække væk uden at beskadige muskler nedenunder. Overfiksering på dette trin gør hele benet for stiv til effektiv dissektion. Derfor bør den oprindelige fiksering begrænses til 30 minutter. Formaldehyd fikseringsmiddel vil ikke trænge nok til effektivt at krydse det underliggende væv i løbet af denne korte periode, og dermed en anden fiksering skridt er nødvendig. Før den anden fiksering skal væv opbevares på is for at forhindre nedbrydning og ændringer i morfologien. For det fjerde har vi fundet dissekere prøver, mens kulde er også vigtigt, sandsynligvis af lignende grunde i, at neglebånd er skør og et lille stykke kan lettere fjernes.
Med praksis finder vi ~ 50% af dissektioner vil være anvendelige inden for ingen mærkbar vævsskade. Selv om denne procentdel kan synes lav i forhold til nogle andre væv, dissektion procedure er hurtig, og mange ben kan behandles i 30- 60 minutter. Derfor, selv om succesraterne er lave i første omgang, er det muligt at opnå 4-5 gode prøver for hver eksperimentel gruppe. En begrænsning kan dog være antallet af fluer, der er tilgængelige på et givet tidspunkt, hvis genotyper og/eller alder resulterer i betydelig dødelighed.
En anden begrænsning er, at vi ikke har været i stand til at dissekere andre områder af benet ud over den proksimale region af lårbenet på grund af størrelse. Således kan vi studere identificeret MN arbors innervating TILM pålideligt, og det er muligt at dissekere kutikula over skinnebenet depressor muskel med små ændringer i den måde, benet er orienteret ved dissekering. Men adgang til andre regioner i benet har vist sig vanskeligere uden at forstyrre axonal arkitektur under dissektion.
Her præsenterer vi dissektionsmetoder til at opdage ændringer på den voksne NMJ for definerede NM'er innervering af tilm ved hjælp af immuncytokemi. Benet er nyttigt som et simpelt system, innerveret af kun ~ 50 MNs og indeholder 14 muskler med velbeskrevet anatomi. Den dissekerede ben forberedelse kan bruges på tværs af genotyper og en suite af antistoffer er tilgængelige for NMJ visualisering uden behov for at opbygge genotypically komplekse lagre af reporter genkonstruktioner i mutant baggrunde. Denne tilgang vil muliggøre en mere detaljeret karakterisering af ændringer på NMJ for MN-sygdomme og andre aldersrelaterede tilstande.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Eric Roberts for rådgivning om billeddannelse. Vi vil også gerne takke Information Technology Services på Rhode Island College og især Michael Caine og Jake Douglas for videografi. Monoklonale antistoffer mod dlg og anti-brp blev udviklet af henholdsvis UC-Berkeley og Universitaetsklinikim Wuerzburg, og blev fremstillet fra Developmental Studies Hybridoma Bank, skabt af NICHD af NIH og opretholdt på The University of Iowa, Department of Biology, Iowa City, IA 52242, USA. Den forskning, der rapporteres her, blev støttet fuldt ud af Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence fra National Institute of General Medical Sciences fra National Institutes of Health under tilskudsnummer [P20GM103430].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP3991 | |
| 24 well plates | Corning | 3473 | Hydrophobic, ultra-low attachment surface |
| 2x objective accessory | Olympus | 110AL2X | Screw-on attachment |
| Anti-ATP5A primary antibody | Abcam | ab14748 | Mouse monoclonal |
| Anti-bruchpilot primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Mouse monoclonal |
| Anti-discs large primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | Mouse monoclonal |
| Anti-hrp primary antibody | Jackson Immuno Research | 123-605-021 | Alexa Fluor 647 conjugated polyclonal |
| Anti-polyubiquitin (FK2) primary antibody | Millipore Sigma | 04-263 | Mouse monoclonal |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Objectives (NA): 10x (0.4), 20x (0.85), 40x (1.20), 60x (1.42), 100x (1.40) |
| Coverslips | Corning | 285022 | 160-190 mm thickness |
| Dissecting forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Dumont #5SF |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | 37% stock stabilized with methanol |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Jackson Immuno Research | 115-545-146 | Alexa Fluor 488 conjugated |
| Goat Serum | Novus Biologicals | NB036768 | 0.2 mm filtered |
| Laboratory sealing tape | Fisher Scientific | 03-448-254 | Parafilm M |
| Methanol | Fisher Scientific | A413 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-123 | 76mm x 25mm |
| Mounting media | Molecular Probes | S36972 | Slowfade Diamond mounting media |
| Nonionic surfactant | Acros Organics | 215680010 | Triton-X 100 |
| Nutator | Fisher Scientific | S06622 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Alexa Fluor 555- conjugated |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| Silicone elastomer | Electron Microscopy Sciences | 2423610 | Sylgard 184 |
References
- McDermott, C. J., Shaw, P. J. Diagnosis and management of motor neurone disease. BMJ. 336 (7645), 658-662 (2008).
- Global Collaborators, G. B. D. M. N. D. Global, regional, and national burden of motor neuron diseases 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (12), 1083-1097 (2018).
- Foster, L. A., Salajegheh, M. K. Motor Neuron Disease: Pathophysiology, Diagnosis, and Management. American Journal of Medicine. 132 (1), 32-37 (2019).
- Bede, P., Pradat, P. F. Editorial: Biomarkers and Clinical Indicators in Motor Neuron Disease. Frontiers in Neurology. 10, 1318 (2019).
- Clark, J. A., Southam, K. A., Blizzard, C. A., King, A. E., Dickson, T. C. Axonal degeneration, distal collateral branching and neuromuscular junction architecture alterations occur prior to symptom onset in the SOD1(G93A) mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Chemical Neuroanatomy. 76, 35-47 (2016).
- Martineau, E., Di Polo, A., Van de Velde, C., Robitaille, R. Dynamic neuromuscular remodeling precedes motor-unit loss in a mouse model of ALS. Elife. 7, (2018).
- Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
- Tremblay, E., Martineau, E., Robitaille, R. Opposite Synaptic Alterations at the Neuromuscular Junction in an ALS Mouse Model: When Motor Units Matter. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8901-8918 (2017).
- Harris, K. P., Littleton, J. T. Transmission, Development, and Plasticity of Synapses. Genetics. 201 (2), 345-375 (2015).
- Beramendi, A., Peron, S., Casanova, G., Reggiani, C., Cantera, R. Neuromuscular junction in abdominal muscles of Drosophila melanogaster during adulthood and aging. Journal of Comparative Neurology. 501 (4), 498-508 (2007).
- Banerjee, S., et al. Miniature neurotransmission is required to maintain Drosophila synaptic structures during ageing. Nature Communications. 12 (1), 4399 (2021).
- Liao, S., Broughton, S., Nassel, D. R. Behavioral Senescence and Aging-Related Changes in Motor Neurons and Brain Neuromodulator Levels Are Ameliorated by Lifespan-Extending Reproductive Dormancy in Drosophila. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 111 (2017).
- Mahoney, R. E., Rawson, J. M., Eaton, B. A. An age-dependent change in the set point of synaptic homeostasis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2111-2119 (2014).
- Fernandes, J. J., Keshishian, H.
- Truman, J. W. Metamorphosis of the central nervous system of Drosophila. Journal of Neurobiology. 21 (7), 1072-1084 (1990).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and birth date specify motor neuron targeting and dendritic architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Enriquez, J., et al. Specification of individual adult motor neuron morphologies by combinatorial transcription factor codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Soler, C., Daczewska, M., Da Ponte, J. P., Dastugue, B., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Guan, W., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Mann, R. S., Enriquez, J. Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle. Journal of Visualized Experiments. (140), e58365 (2018).
- Agudelo, A., et al. Age-dependent degeneration of an identified adult leg motor neuron in a Drosophila SOD1 model of ALS. Biology Open. 9 (10), (2020).
- Fernius, J., Starkenberg, A., Thor, S. Bar-coding neurodegeneration: identifying subcellular effects of human neurodegenerative disease proteins using Drosophila leg neurons. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 1027-1038 (2017).
- Sreedharan, J., Neukomm, L. J., Brown, R. H., Freeman, M. R. Age-Dependent TDP-43-Mediated Motor Neuron Degeneration Requires GSK3, hat-trick, and xmas-2. Current Biology. 25 (16), 2130-2136 (2015).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods in Cell Biology. 44, 445-487 (1994).
- Guirado, R., Carceller, H., Castillo-Gomez, E., Castren, E., Nacher, J. Automated analysis of images for molecular quantification in immunohistochemistry. Heliyon. 4 (6), 00669 (2018).
- Castells-Nobau, A., et al. Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology. Journal of Visualized Experiments. (123), e55395 (2017).
- Brown, J. R., Phongthachit, C., Sulkowski, M. J. Immunofluorescence and image analysis pipeline for Drosophila motor neurons. Biology Methods and Protocols. 4 (1), (2019).
