Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

La respirometria basata su micropiastre ha rivoluzionato la ricerca mitocondriale consentendo lo studio della respirazione cellulare di un campione di piccole dimensioni¹. La respirazione cellulare è generalmente considerata un indicatore della funzione mitocondriale o "disfunzione", nonostante il fatto che la gamma di funzioni mitocondriali si estenda oltre la produzione di energia². In condizioni aerobiche, i mitocondri estraggono l'energia immagazzinata in diversi substrati scomponendo e convertendo questi substrati in intermedi metabolici che possono alimentare il ciclo dell'acido citrico³ (Figura 1). Il flusso continuo di substrati è essenziale per il flusso del ciclo dell'acido citrico per generare "donatori di elettroni" ad alta energia, che forniscono elettroni alla catena di trasporto degli elettroni che genera un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna, consentendo all'ATP-sintasi di fosforilare ADP in ATP⁴. Pertanto, un progetto sperimentale per analizzare la respirazione mitocondriale deve includere la natura del campione (cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati) e substrati mitocondriali.

Le cellule mantengono una riserva di substrati indigeni⁵e i mitocondri ossidano diversi tipi di substrati contemporaneamente^6,il che complica l'interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti eseguiti su cellule intatte. Un approccio comune per studiare la capacità mitocondriale di ossidare un substrato selezionato è quello di isolare i mitocondri o permeabilizzare le cellule studiate⁵. Sebbene i mitocondri isolati siano ideali per studi quantitativi, il processo di isolamento è laborioso. Affronta difficoltà tecniche come la necessità di grandi dimensioni del campione, la purezza della resa e la riproducibilità della tecnica⁵. Le cellule permeabilizzate offrono una soluzione per gli svantaggi dell'isolamento mitocondriale; tuttavia, gli agenti permeabilizzanti di routine di natura detergente non sono specifici e possono danneggiare le membrane mitocondriali⁵.

La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come agente permeabilizzante selettivo della membrana plasmatica⁷ed è stata utilizzata con successo in combinazione con un analizzatore di flusso extracellulare in diversi studi^7,8,9,10. Abbiamo modificato un protocollo che utilizza rPFO per lo screening del flusso del substrato mitocondriale utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XFe96. In questo protocollo, vengono confrontate quattro diverse vie ossidanti del substrato in due fenotipi cellulari pur avendo repliche sufficienti e il controllo adeguato per ciascun materiale testato.

1. Un giorno prima del test

1. Preparazione di reagenti e substrati.
   1. Soluzione per saggio mitocondriale (MAS): preparare le soluzioni stock di tutti i reagenti come descritto nella Tabella 1. Riscaldare le scorte di mannitolo e saccarosio a 37 °C per sciogliere completamente. Mescolare i reagenti per preparare 2 MAS, quindi riscaldare la miscela a 37 °C. Regolare il pH con 5N KOH a 7,4 (~7 mL), quindi aggiungere acqua per portare il volume fino a 1 L. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
   2. Albumina sierica bovina (5% BSA): Sciogliere 5 g di BSA in 90 ml di acqua sterile preriscaldata su un agitatore magnetico ed evitare di agitare. Regolare il pH a 7,4 con 5 N KOH, quindi aggiungere acqua per portare il volume a 100 ml. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
   3. Substrati mitocondriali: Preparare 1 M soluzioni stock di succinato di sodio, piruvato di sodio e glutammato di sodio in acqua sterile. Preparare 100 mM di soluzione madre di malato di sodio in acqua sterile e utilizzare acqua sterile preriscaldata per preparare una soluzione madre da 10 mM di palmitoil carnitina. Regolare il pH di ciascuna soluzione a 7,4 per 5 N KOH e sterilizzare con filtro. Conservare i substrati a 2-8 °C. Al momento dell'uso, riscaldare la palmitoil carnitina a 37 °C per sciogliere eventuali precipitati. Per un uso successivo, conservare le aliquote di tutti i substrati ad eccezione del piruvato a -20 °C.
   4. Inibitori mitocondriali: utilizzare il dimetilsolfossido (DMSO) per preparare soluzioni stock di 25 mM di oligomicina, 50 mM di carbonil cianuro 4-(trifluorometosi) fenilidrazone (FCCP), 20 mM di rotenone e 20 mM di antimicina A. Conservare le aliquote a -20 °C.
2. Semina e trattamento delle cellule: come mostrato nella Figura 2, semina le celle nelle colonne 2-11. Le colonne 1 e 12 devono essere lasciate vuote per fungere da pozzetti di sfondo. In questo lavoro sono state utilizzate celle HepG2 e A549.
   1. Semina le cellule ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto. Utilizzare 50-80 μL di terreno di coltura cellulare per la semina.
   2. Riempire i pozzetti vuoti con un volume uguale di terreno di coltura cellulare e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO_2. Lasciare che le cellule si attacchino per 3-4 ore, quindi aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti.
   3. Con l'aggiunta finale del mezzo, applicare il trattamento nelle colonne 7-11. In questo lavoro, il gruppo sperimentale è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore e il gruppo di controllo è stato trattato con un volume uguale di acqua distillata sterile come controllo del veicolo.
3. Idratazione dei sensori: pipettare 200 μL di acqua sterile per pozzo nella piastra di utilità, quindi restituire con attenzione la cartuccia del sensore durante l'immersione dei sensori in acqua. Incubare la cartuccia in un incubatore privo di CO₂a 37 °C fino al giorno successivo.
4. Il modello di protocollo di analisi: accendere l'analizzatore (vedere Tabella dei materiali)e l'unità di controllo. Avviare il software di controllo dello strumento e di acquisizione dati e progettare il protocollo di analisi come descritto nella Tabella 2. In Definizioni di gruppo, creare quattro strategie di iniezione in cui la porta A differisce in base al substrato iniettato ( Figura3). Assegna alle strategie il nome dei substrati o delle loro abbreviazioni.
5. Alle porte B, C e D, assegnare rispettivamente i composti oligomicina, FCCP e rotenone/antimicina A. Create otto gruppi e denominateli come illustrato nella Figura 4. In Plate Map assegnare i gruppi ai pozzetti corrispondenti, quindi salvare il protocollo come modello pronto all'uso. Lasciare l'analizzatore acceso per consentire alla temperatura di stabilizzarsi durante la notte. Tenere l'analizzatore in un luogo con una temperatura stabile per evitare improvvisi sbalzi di temperatura.

2. Il giorno del test

1. Sostituzione dell'acqua con il calibrante: scartare l'acqua dalla piastra di utilità e dalla pipetta 200 μL di calibrante preribalizzato per pozzo nella piastra di utilità. Riportare la cartuccia all'incubatore privo di CO₂fino al momento del test. Per evitare una rapida evaporazione del calibrante, mantenere una fonte di umidità all'interno dell'incubatore e spegnere o ridurre al minimo la velocità della ventola.
2. Preparazione delle soluzioni di lavoro: iniziare riscaldando 2x MAS, 5% BSA e acqua sterile a 37 °C. Nel frattempo, consentire alle scorte di inibitori di raggiungere la temperatura ambiente. Utilizzare 2 MAS caldo e acqua distillata sterile per preparare 5 ml della concentrazione di lavoro dei substrati e degli inibitori come descritto nella Tabella 3.
3. Caricamento delle porte di iniezione: come mostrato nella Figura 3, caricare 20 μL dei substrati nella porta A. Caricare la miscela di succinato/rotenone nella porta A delle file A e B. Caricare la miscela di piruvato/malato nella porta A delle file C e D. Caricare la miscela di glutammato/malato nella porta A delle file E e F. Caricare la miscela palmitoil carnitina/malato nella porta A delle file G e H. Per l'intera piastra, porta di carico B con 22 μL di preparazione di oligomicina, porta C con 25 μL di preparazione FCCP e porta D con 27 μL di miscela di rotenone/antimicina A.
4. Avvio della fase di calibrazione: nella scheda Esegui test, fare clic su Avvia esecuzione per avviare il test. Inserire la cartuccia del sensore caricata e avviare la fase di calibrazione. Attendere il completamento della calibrazione prima di procedere al passaggio successivo.
5. Preparazione del mezzo di saggio (MAS-BSA-rPFO): per preparare 20 mL del mezzo di analisi, mescolare 10 mL di 2x MAS, 9,2 mL di acqua sterile e 0,8 mL di BSA al 5% in un tubo da 50 mL. Aggiungere 2 μL di 10 μM rPFO per ottenere una concentrazione di 1 nM e risospesciare la miscela con un pipettaggio delicato. Evitare di agitare e non utilizzare un miscelatore a vortice per la miscelazione. Incubare il tubo a 37 °C fino al momento dell'uso.
6. Lavare le cellule: lavare le cellule e i pozzetti vuoti vuoti due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio preriscaldata utilizzando una pipetta multicanale. Evitare di riutilizzare le stesse punte per scartare il terreno di coltura cellulare e aggiungere PBS. Eseguire questa fase al di fuori del flusso laminare per proteggere le celle dall'essiccazione da parte del flusso d'aria.
7. Permeabilizzazione cellulare in mezzo di saggio: utilizzando una pipetta multicanale, scartare il PBS e sostituirlo con 180 μL del mezzo di saggio preriscaldato (MAS-BSA-rPFO).
8. Avvio della misurazione: immediatamente dopo la permeabilizzazione, sostituire la piastra di utilità della cartuccia del sensore calibrata con la piastra cellulare e avviare la misurazione.

Inizia normalizzando i risultati alla seconda misurazione della respirazione al basale per mostrare i valori come percentuale del tasso di consumo di ossigeno (OCR%). I risultati del test sono mostrati nelle Figure 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8. È importante assegnare i pozzetti di sfondo appropriati per ciascun gruppo e inattivare i pozzetti di sfondo di altri gruppi. La Figura 5 mostra che il gruppo trattato ha un più alto tasso di respirazione indotta da succinato. La risposta delle cellule A549 al trattamento con metformina (Figura 5A) è stata superiore a quella delle cellule HepG2 (Figura 5B). I pozzetti di controllo di fondo erano solo quelli delle stesse file del gruppo confrontato, in questo caso i pozzi A1, B1, A12 e B12. La Figura 6 mostra i cambiamenti nella respirazione indotta da piruvato/malato. La Figura 7 mostra i cambiamenti nella respirazione indotta da glutammato/malato e la Figura 8 mostra i cambiamenti nella respirazione indotta da palmitoil carnitina/malato.

Figura 1: Una rappresentazione schematica del ciclo dell'acido citrico. I substrati utilizzati per testare il flusso del substrato mitocondriale sono in rosso. Il malato non è usato da solo, ma usato in combinazione con piruvato, palmitoil carnitina e glutammato. Il ruolo del malato nella respirazione indotta da piruvato/malato e palmitoil carnitina/malato è quello di fornire ossalacetato attraverso l'azione dell'enzima malato deidrogenasi. Nella respirazione indotta da glutammato/malato, il malato prende parte alla navetta malato-aspartato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione del piano di semina cellulare nella micropiastra di coltura cellulare. I pozzetti vuoti nelle colonne 1 e 12 devono essere lasciati vuoti senza celle. Le colonne 7-11 sono usate per trattare il gruppo sperimentale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Illustrazione della strategia di iniezione. La porta A delle file A e B viene caricata con miscela di succinato/rotenone. La porta A delle file C e D è caricata con miscela piruvato/malato. La porta A delle file E e F è caricata con miscela di glutammato/malato. La porta A delle file G e H è caricata con una miscela palmitoil carnitina/malato. Per l'intera piastra, le porte B, C e D sono caricate rispettivamente con oligomicina, FCCP e rotenone / antimicina A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Nomi dei gruppi e mappa delle piastre. Ogni gruppo è nominato in base al fenotipo (controllo o trattato) e al substrato utilizzato per indurre la respirazione. (S), respirazione indotta da succinato. (P/M), respirazione indotta da piruvato/malato. (G/M), respirazione indotta da glutammato/malato. (CP/M), respirazione indotta da palmitoil carnitina/malato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Respirazione indotta da succinati. (A) A549 e (B) HepG2. Il gruppo testato è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore. Solo i pozzetti di sfondo A1, B1, A12 e B12 vengono utilizzati per la correzione. I risultati sono mostrati come OCR% medio ± SD. Il grafico e la griglia della piastra sono stati creati ed esportati come file di immagine dal software di progettazione del saggio, analisi dei dati e gestione dei file. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Respirazione indotta da piruvato/malato. (A) A549 e (B) HepG2. Il gruppo testato è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore. Solo i pozzetti di sfondo C1, D1, C12 e D12 vengono utilizzati per la correzione. I risultati sono mostrati come OCR% medio ± SD. Il grafico e la griglia della piastra sono stati creati ed esportati come file di immagine dal software di progettazione del saggio, analisi dei dati e gestione dei file. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Respirazione indotta da glutammato/malato. (A) A549 e (B) HepG2. Il gruppo testato è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore. Solo i pozzetti di sfondo E1, F1, E12 e F12 vengono utilizzati per la correzione. I risultati sono mostrati come OCR% medio ± SD. Il grafico e la griglia della piastra sono stati creati ed esportati come file di immagine dal software di progettazione del saggio, analisi dei dati e gestione dei file. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Respirazione indotta da palmitoil carnitina/malato. (A) A549 e (B) HepG2. Il gruppo testato è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore. Solo i pozzetti di fondo G1, H1, G12 e H12 vengono utilizzati per la correzione. I risultati sono mostrati come OCR% medio ± SD. Il grafico e la griglia della piastra sono stati creati ed esportati come file di immagine dal software di progettazione del saggio, analisi dei dati e gestione dei file. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Soluzione per saggio mitocondriale. Mescolare il volume indicato di ciascuna soluzione madre di ingredienti per preparare (2x MAS). Riscaldare la soluzione a 37 °C, quindi regolare il pH con 5 N KOH a 7,4. Aggiungere acqua distillata per portare il volume a 1 L. Filtrare e quindi conservare le aliquote a -20 °C. Preparare il mezzo di saggio e le soluzioni di lavoro di substrati e inibitori mitocondriali utilizzando 2x MAS.

Tabella 2: Comandi del protocollo di analisi.

Tabella 3: Elenco dei substrati mitocondriali e degli inibitori da caricare nelle porte di iniezione delle cartucce del sensore, come discusso in precedenza nella Figura 3. Mescolare i volumi indicati da soluzioni stock, 2x MAS e acqua distillata per preparare i 5 ml della concentrazione di lavoro di ciascun substrato o miscela inibitore. La concentrazione finale si ottiene nei pozzetti dopo il processo di iniezione.

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.