In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.
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Articolo metodologico
Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il flusso del substrato mitocondriale è una caratteristica distintiva di ciascun tipo di cellula e i cambiamenti nei suoi componenti come trasportatori, canali o enzimi sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Il flusso del substrato mitocondriale può essere studiato utilizzando cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati. Lo studio delle cellule intatte incontra diversi problemi a causa dell'ossidazione simultanea di diversi substrati. Inoltre, diversi tipi di cellule contengono depositi interni di diversi substrati che complicano l'interpretazione dei risultati. Metodi come l'isolamento mitocondriale o l'uso di agenti permeabilizzanti non sono facilmente riproducibili. Isolare i mitocondri puri con membrane intatte in quantità sufficienti da piccoli campioni è problematico. L'uso di permeabilizzanti non selettivi provoca vari gradi di inevitabile danno alla membrana mitocondriale. La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come permeabilizzante più appropriato, grazie alla sua capacità di permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica senza compromettere l'integrità mitocondriale. Se utilizzato in combinazione con la respirometria a micropiastre, consente di testare il flusso di diversi substrati mitocondriali con abbastanza repliche all'interno di un esperimento utilizzando un numero minimo di cellule. In questo lavoro, il protocollo descrive un metodo per confrontare il flusso del substrato mitocondriale di due diversi fenotipi cellulari o genotipi e può essere personalizzato per testare vari substrati o inibitori mitocondriali.
Introduzione
La respirometria basata su micropiastre ha rivoluzionato la ricerca mitocondriale consentendo lo studio della respirazione cellulare di un campione di piccole dimensioni1. La respirazione cellulare è generalmente considerata un indicatore della funzione mitocondriale o "disfunzione", nonostante il fatto che la gamma di funzioni mitocondriali si estenda oltre la produzione di energia2. In condizioni aerobiche, i mitocondri estraggono l'energia immagazzinata in diversi substrati scomponendo e convertendo questi substrati in intermedi metabolici che possono alimentare il ciclo dell'acido citrico3 (
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Protocollo
1. Un giorno prima del test
- Preparazione di reagenti e substrati.
- Soluzione per saggio mitocondriale (MAS): preparare le soluzioni stock di tutti i reagenti come descritto nella Tabella 1. Riscaldare le scorte di mannitolo e saccarosio a 37 °C per sciogliere completamente. Mescolare i reagenti per preparare 2 MAS, quindi riscaldare la miscela a 37 °C. Regolare il pH con 5N KOH a 7,4 (~7 mL), quindi aggiungere acqua per portare il volume fino a 1 L. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
- Albumina sierica bovina (5% BSA): Sciogliere 5 g di BSA in 90 ml di acqua sterile preriscaldata su ....
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Risultati
Inizia normalizzando i risultati alla seconda misurazione della respirazione al basale per mostrare i valori come percentuale del tasso di consumo di ossigeno (OCR%). I risultati del test sono mostrati nelle Figure 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8. È importante assegnare i pozzetti di sfondo appropriati per ciascun gruppo e inattivare i pozzetti di sfondo di altri grupp.......
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Discussione
Questo protocollo è una modifica degli studi precedentemente pubblicati7,8,9,10 e della guida per l'utente del prodotto. A differenza del protocollo del produttore, viene utilizzato 2x MAS invece di 3x MAS, poiché 2× MAS è più facile da sciogliere e non forma precipitazioni dopo il congelamento. Le aliquote MAS congelate 2x possono essere conservate fino a sei mesi e mostrare risultati coerenti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i membri dello staff del Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Medicina di Hradec Králové e del Dipartimento di Fisiopatologia della Terza Facoltà di Medicina per l'aiuto con le sostanze chimiche e la preparazione dei campioni. Questo lavoro è stato supportato dai programmi di sovvenzione della Charles University PROGRES Q40/02, dalla sovvenzione del Ministero della Salute ceco NU21-01-00259, dalla sovvenzione della fondazione scientifica ceca 18-10144 e dal progetto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca e dall'Unione Europea.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Adenosina 5′ -difosfato sale monopotassico diidrato | Merck | A5285 | conservare a -20 ° C |
| Antimicina A | Merck | A8674 | negozio a -20 ° C |
| Albumina sierica bovina | Merck | A3803 | negozio a 2 - 8 gradi C |
| Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone | Merck | C2920 | conservare a -20 ° C |
| Dimetil solfossido Merck | D8418 | negozio presso RT | |
| D-mannitolo | Merck | 63559 | negozio presso RT |
| Dulbecco's soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 14190-144 | negozio presso RT |
| Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,acido tetraacetico | Merck | 03777 | negozio presso RT |
| HEPES | Merck | H7523 | negozio presso RT |
| L(-)Sale disodico dell'acido malico | Merck | M9138 | negozio presso RT |
| L-Glutammico sale sodico idrato | Merck | G5889 | negozio presso RT |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Merck | M2670 | negozio presso RT |
| Oligomicina | Merck | O4876 | negozio a -20 ° C |
| Palmitoil-DL-carnitina cloruro | Merck | P4509 | conservare a -20 ° C |
| Idrossido di potassio | Merck | 484016 | negozio presso RT |
| Fosfato di potassio monobasico | Merck | P5655 | negozio presso RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | negozio a -20 ° C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | Scarica da www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Tecnologie | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Tecnologie Agilent | 102416-100 | XFe96 cartucce per sensori e micropiastre per colture cellulari XF96 |
| Piruvato di sodio | Merck | P2256 | negozio a 2 - 8 gradi C |
| Sodio succinato bibasico esaidrato | Merck | S2378 | negozio presso RT |
| Saccarosio | Merck | S7903 | negozio presso RT |
| Water | Merck | W3500 | negozio presso RT |
| XF calibrante | Agilent technologies | 100840-000 | negozio presso RT |
| XF Permeabilizzatore a membrana al plasma | Agilent technologies | 102504-100 | Perfringolisina O ricombinante (rPFO) - Aliquotare e conservare a -20 gradi E |
Riferimenti
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondria....
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Ristampe e permessi
