Articolo metodologico

Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 agosto 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

Abstract

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Il flusso del substrato mitocondriale è una caratteristica distintiva di ciascun tipo di cellula e i cambiamenti nei suoi componenti come trasportatori, canali o enzimi sono coinvolti nella patogenesi di diverse malattie. Il flusso del substrato mitocondriale può essere studiato utilizzando cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati. Lo studio delle cellule intatte incontra diversi problemi a causa dell'ossidazione simultanea di diversi substrati. Inoltre, diversi tipi di cellule contengono depositi interni di diversi substrati che complicano l'interpretazione dei risultati. Metodi come l'isolamento mitocondriale o l'uso di agenti permeabilizzanti non sono facilmente riproducibili. Isolare i mitocondri puri con membrane intatte in quantità sufficienti da piccoli campioni è problematico. L'uso di permeabilizzanti non selettivi provoca vari gradi di inevitabile danno alla membrana mitocondriale. La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come permeabilizzante più appropriato, grazie alla sua capacità di permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica senza compromettere l'integrità mitocondriale. Se utilizzato in combinazione con la respirometria a micropiastre, consente di testare il flusso di diversi substrati mitocondriali con abbastanza repliche all'interno di un esperimento utilizzando un numero minimo di cellule. In questo lavoro, il protocollo descrive un metodo per confrontare il flusso del substrato mitocondriale di due diversi fenotipi cellulari o genotipi e può essere personalizzato per testare vari substrati o inibitori mitocondriali.

Introduzione

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La respirometria basata su micropiastre ha rivoluzionato la ricerca mitocondriale consentendo lo studio della respirazione cellulare di un campione di piccole dimensioni1. La respirazione cellulare è generalmente considerata un indicatore della funzione mitocondriale o "disfunzione", nonostante il fatto che la gamma di funzioni mitocondriali si estenda oltre la produzione di energia2. In condizioni aerobiche, i mitocondri estraggono l'energia immagazzinata in diversi substrati scomponendo e convertendo questi substrati in intermedi metabolici che possono alimentare il ciclo dell'acido citrico3 (Figura 1). Il flusso continuo di substrati è essenziale per il flusso del ciclo dell'acido citrico per generare "donatori di elettroni" ad alta energia, che forniscono elettroni alla catena di trasporto degli elettroni che genera un gradiente protonico attraverso la membrana mitocondriale interna, consentendo all'ATP-sintasi di fosforilare ADP in ATP4. Pertanto, un progetto sperimentale per analizzare la respirazione mitocondriale deve includere la natura del campione (cellule intatte, cellule permeabilizzate o mitocondri isolati) e substrati mitocondriali.

Le cellule mantengono una riserva di substrati indigeni5e i mitocondri ossidano diversi tipi di substrati contemporaneamente6,il che complica l'interpretazione dei risultati ottenuti da esperimenti eseguiti su cellule intatte. Un approccio comune per studiare la capacità mitocondriale di ossidare un substrato selezionato è quello di isolare i mitocondri o permeabilizzare le cellule studiate5. Sebbene i mitocondri isolati siano ideali per studi quantitativi, il processo di isolamento è laborioso. Affronta difficoltà tecniche come la necessità di grandi dimensioni del campione, la purezza della resa e la riproducibilità della tecnica5. Le cellule permeabilizzate offrono una soluzione per gli svantaggi dell'isolamento mitocondriale; tuttavia, gli agenti permeabilizzanti di routine di natura detergente non sono specifici e possono danneggiare le membrane mitocondriali5.

La perfringolisina ricombinante O (rPFO) è stata offerta come agente permeabilizzante selettivo della membrana plasmatica7ed è stata utilizzata con successo in combinazione con un analizzatore di flusso extracellulare in diversi studi7,8,9,10. Abbiamo modificato un protocollo che utilizza rPFO per lo screening del flusso del substrato mitocondriale utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare XFe96. In questo protocollo, vengono confrontate quattro diverse vie ossidanti del substrato in due fenotipi cellulari pur avendo repliche sufficienti e il controllo adeguato per ciascun materiale testato.

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Protocollo

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1. Un giorno prima del test

  1. Preparazione di reagenti e substrati.
    1. Soluzione per saggio mitocondriale (MAS): preparare le soluzioni stock di tutti i reagenti come descritto nella Tabella 1. Riscaldare le scorte di mannitolo e saccarosio a 37 °C per sciogliere completamente. Mescolare i reagenti per preparare 2 MAS, quindi riscaldare la miscela a 37 °C. Regolare il pH con 5N KOH a 7,4 (~7 mL), quindi aggiungere acqua per portare il volume fino a 1 L. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
    2. Albumina sierica bovina (5% BSA): Sciogliere 5 g di BSA in 90 ml di acqua sterile preriscaldata su un agitatore magnetico ed evitare di agitare. Regolare il pH a 7,4 con 5 N KOH, quindi aggiungere acqua per portare il volume a 100 ml. Filtrare e conservare le aliquote a -20 °C fino al giorno della misurazione.
    3. Substrati mitocondriali: Preparare 1 M soluzioni stock di succinato di sodio, piruvato di sodio e glutammato di sodio in acqua sterile. Preparare 100 mM di soluzione madre di malato di sodio in acqua sterile e utilizzare acqua sterile preriscaldata per preparare una soluzione madre da 10 mM di palmitoil carnitina. Regolare il pH di ciascuna soluzione a 7,4 per 5 N KOH e sterilizzare con filtro. Conservare i substrati a 2-8 °C. Al momento dell'uso, riscaldare la palmitoil carnitina a 37 °C per sciogliere eventuali precipitati. Per un uso successivo, conservare le aliquote di tutti i substrati ad eccezione del piruvato a -20 °C.
    4. Inibitori mitocondriali: utilizzare il dimetilsolfossido (DMSO) per preparare soluzioni stock di 25 mM di oligomicina, 50 mM di carbonil cianuro 4-(trifluorometosi) fenilidrazone (FCCP), 20 mM di rotenone e 20 mM di antimicina A. Conservare le aliquote a -20 °C.
  2. Semina e trattamento delle cellule: come mostrato nella Figura 2, semina le celle nelle colonne 2-11. Le colonne 1 e 12 devono essere lasciate vuote per fungere da pozzetti di sfondo. In questo lavoro sono state utilizzate celle HepG2 e A549.
    1. Semina le cellule ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto. Utilizzare 50-80 μL di terreno di coltura cellulare per la semina.
    2. Riempire i pozzetti vuoti con un volume uguale di terreno di coltura cellulare e incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. Lasciare che le cellule si attacchino per 3-4 ore, quindi aggiungere 100 μL di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti.
    3. Con l'aggiunta finale del mezzo, applicare il trattamento nelle colonne 7-11. In questo lavoro, il gruppo sperimentale è stato trattato con 1 mM di metformina cloridrato per 16 ore e il gruppo di controllo è stato trattato con un volume uguale di acqua distillata sterile come controllo del veicolo.
  3. Idratazione dei sensori: pipettare 200 μL di acqua sterile per pozzo nella piastra di utilità, quindi restituire con attenzione la cartuccia del sensore durante l'immersione dei sensori in acqua. Incubare la cartuccia in un incubatore privo di CO2a 37 °C fino al giorno successivo.
  4. Il modello di protocollo di analisi: accendere l'analizzatore (vedere Tabella dei materiali)e l'unità di controllo. Avviare il software di controllo dello strumento e di acquisizione dati e progettare il protocollo di analisi come descritto nella Tabella 2. In Definizioni di gruppo, creare quattro strategie di iniezione in cui la porta A differisce in base al substrato iniettato ( Figura3). Assegna alle strategie il nome dei substrati o delle loro abbreviazioni.
  5. Alle porte B, C e D, assegnare rispettivamente i composti oligomicina, FCCP e rotenone/antimicina A. Create otto gruppi e denominateli come illustrato nella Figura 4. In Plate Map assegnare i gruppi ai pozzetti corrispondenti, quindi salvare il protocollo come modello pronto all'uso. Lasciare l'analizzatore acceso per consentire alla temperatura di stabilizzarsi durante la notte. Tenere l'analizzatore in un luogo con una temperatura stabile per evitare improvvisi sbalzi di temperatura.

2. Il giorno del test

  1. Sostituzione dell'acqua con il calibrante: scartare l'acqua dalla piastra di utilità e dalla pipetta 200 μL di calibrante preribalizzato per pozzo nella piastra di utilità. Riportare la cartuccia all'incubatore privo di CO2fino al momento del test. Per evitare una rapida evaporazione del calibrante, mantenere una fonte di umidità all'interno dell'incubatore e spegnere o ridurre al minimo la velocità della ventola.
  2. Preparazione delle soluzioni di lavoro: iniziare riscaldando 2x MAS, 5% BSA e acqua sterile a 37 °C. Nel frattempo, consentire alle scorte di inibitori di raggiungere la temperatura ambiente. Utilizzare 2 MAS caldo e acqua distillata sterile per preparare 5 ml della concentrazione di lavoro dei substrati e degli inibitori come descritto nella Tabella 3.
  3. Caricamento delle porte di iniezione: come mostrato nella Figura 3, caricare 20 μL dei substrati nella porta A. Caricare la miscela di succinato/rotenone nella porta A delle file A e B. Caricare la miscela di piruvato/malato nella porta A delle file C e D. Caricare la miscela di glutammato/malato nella porta A delle file E e F. Caricare la miscela palmitoil carnitina/malato nella porta A delle file G e H. Per l'intera piastra, porta di carico B con 22 μL di preparazione di oligomicina, porta C con 25 μL di preparazione FCCP e porta D con 27 μL di miscela di rotenone/antimicina A.
  4. Avvio della fase di calibrazione: nella scheda Esegui test, fare clic su Avvia esecuzione per avviare il test. Inserire la cartuccia del sensore caricata e avviare la fase di calibrazione. Attendere il completamento della calibrazione prima di procedere al passaggio successivo.
  5. Preparazione del mezzo di saggio (MAS-BSA-rPFO): per preparare 20 mL del mezzo di analisi, mescolare 10 mL di 2x MAS, 9,2 mL di acqua sterile e 0,8 mL di BSA al 5% in un tubo da 50 mL. Aggiungere 2 μL di 10 μM rPFO per ottenere una concentrazione di 1 nM e risospesciare la miscela con un pipettaggio delicato. Evitare di agitare e non utilizzare un miscelatore a vortice per la miscelazione. Incubare il tubo a 37 °C fino al momento dell'uso.
  6. Lavare le cellule: lavare le cellule e i pozzetti vuoti vuoti due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza calcio e magnesio preriscaldata utilizzando una pipetta multicanale. Evitare di riutilizzare le stesse punte per scartare il terreno di coltura cellulare e aggiungere PBS. Eseguire questa fase al di fuori del flusso laminare per proteggere le celle dall'essiccazione da parte del flusso d'aria.
  7. Permeabilizzazione cellulare in mezzo di saggio: utilizzando una pipetta multicanale, scartare il PBS e sostituirlo con 180 μL del mezzo di saggio preriscaldato (MAS-BSA-rPFO).
  8. Avvio della misurazione: immediatamente dopo la permeabilizzazione, sostituire la piastra di utilità della cartuccia del sensore calibrata con la piastra cellulare e avviare la misurazione.

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Risultati

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Inizia normalizzando i risultati alla seconda misurazione della respirazione al basale per mostrare i valori come percentuale del tasso di consumo di ossigeno (OCR%). I risultati del test sono mostrati nelle Figure 5, Figura 6, Figura 7 e Figura 8. È importante assegnare i pozzetti di sfondo appropriati per ciascun gruppo e inattivare i pozzetti di sfondo di altri grupp...

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Discussione

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Questo protocollo è una modifica degli studi precedentemente pubblicati7,8,9,10 e della guida per l'utente del prodotto. A differenza del protocollo del produttore, viene utilizzato 2x MAS invece di 3x MAS, poiché 2× MAS è più facile da sciogliere e non forma precipitazioni dopo il congelamento. Le aliquote MAS congelate 2x possono essere conservate fino a sei mesi e mostrare risultati coerenti...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i membri dello staff del Dipartimento di Fisiologia della Facoltà di Medicina di Hradec Králové e del Dipartimento di Fisiopatologia della Terza Facoltà di Medicina per l'aiuto con le sostanze chimiche e la preparazione dei campioni. Questo lavoro è stato supportato dai programmi di sovvenzione della Charles University PROGRES Q40/02, dalla sovvenzione del Ministero della Salute ceco NU21-01-00259, dalla sovvenzione della fondazione scientifica ceca 18-10144 e dal progetto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca e dall'Unione Europea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Adenosina 5′ -difosfato sale monopotassico diidratoMerckA5285conservare a -20 ° C
Antimicina AMerckA8674negozio a -20 ° C
Albumina sierica bovinaMerckA3803negozio a 2 - 8 gradi C
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazoneMerckC2920conservare a -20 ° C
Dimetil solfossido MerckD8418negozio presso RT
D-mannitoloMerck63559negozio presso RT
Dulbecco's soluzione salina tamponata con fosfatoGibco14190-144negozio presso RT
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,acido tetraaceticoMerck03777negozio presso RT
HEPESMerckH7523negozio presso RT
L(-)Sale disodico dell'acido malicoMerckM9138negozio presso RT
L-Glutammico sale sodico idratoMerckG5889negozio presso RT
Cloruro di magnesio esaidratoMerckM2670negozio presso RT
OligomicinaMerckO4876negozio a -20 ° C
Palmitoil-DL-carnitina cloruroMerckP4509conservare a -20 ° C
Idrossido di potassioMerck484016negozio presso RT
Fosfato di potassio monobasicoMerckP5655negozio presso RT
RotenoneMerckR8875negozio a -20 ° C
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilentScarica da www.agilent.com
Seahorse XFe96 AnalyzerTecnologie
Seahorse XFe96 FluxPakTecnologie Agilent102416-100XFe96 cartucce per sensori e micropiastre per colture cellulari XF96
Piruvato di sodioMerckP2256negozio a 2 - 8 gradi C
Sodio succinato bibasico esaidratoMerckS2378negozio presso RT
SaccarosioMerckS7903negozio presso RT
WaterMerckW3500negozio presso RT
XF calibranteAgilent technologies100840-000negozio presso RT
XF Permeabilizzatore a membrana al plasmaAgilent technologies102504-100Perfringolisina O ricombinante (rPFO) - Aliquotare e conservare a -20 gradi E
Tecnologie Agilent

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
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  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

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