Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate
13 agosto 2021
In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.
Perché testa il flusso del substrato mitocondriale che può essere influenzato da diverse patologie o trattamenti. Ad esempio, oggi lo useremo per rivelare la risposta delle cellule tumorali al trattamento con metformina. Richiede un numero minimo di celle pur avendo repliche sufficienti e un controllo appropriato per ogni materiale distinto.
L'analizzatore è solo per uso di ricerca. Questa tecnica può identificare errori nel metabolismo mitocondriale e può essere utilizzata per valutare i farmaci guerrieri che colpiscono i mitocondri. A dimostrare la procedura sarà Karolina Vaneckova una studentessa universitaria e tecnico di ricerca del mio laboratorio.
Per iniziare a seminare cellule A549 ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto in colonne, da due a 11 di una micro-piastra di coltura cellulare XF 96 di cavalluccio marino. Lasciando le colonne uno e 12 vuote come pozzetti di sfondo. Riempire i pozzetti vuoti con un volume uguale del terreno di coltura cellulare, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per l'attacco cellulare.
Dopo tre o quattro ore, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare nei pozzi. Trattare le colonne del gruppo sperimentale da sette a 11 con una metformina millimolare e il gruppo di controllo con un volume uguale di acqua distillata sterile, quindi restituire la piastra all'incubatore. Per idratare i sensori, pipettare 200 microlitri di acqua sterile per pozzo nella piastra di utilità.
Quindi restituire con attenzione la cartuccia del sensore durante l'immersione del sensore in acqua. Incubare la cartuccia in un incubatore privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino al giorno successivo. Accendere l'analizzatore e l'unità di controllo.
Avviare il software di controllo dello strumento e di acquisizione dati e progettare il protocollo di analisi come descritto nel manoscritto di testo. Nelle definizioni di gruppo, creare quattro strategie di iniezione in cui la porta A differisce in base al substrato iniettato e denominare le strategie dopo i substrati o le abbreviazioni. Assegnare Oligomicina alla porta B, FCCP alla porta C e Rotenone Antimicina A miscela alla porta D.Creare e nominare otto gruppi, sotto la mappa della piastra, assegnare gruppi ai pozzi corrispondenti.
Quindi salvare il protocollo come modello pronto all'uso. Lasciare l'analizzatore acceso per consentire alla temperatura di stabilizzarsi durante la notte. Il giorno successivo, scartare l'acqua dalla piastra di utilità e aggiungere 200 microlitri del calibrante preriscaldato per pozzetto nella piastra di utilità.
Riportare la cartuccia nell'incubatore privo di anidride carbonica fino al momento del test. Mantenere una fonte di umidità all'interno dell'incubatore e spegnere o ridurre al minimo la velocità della ventola, per evitare una rapida evaporazione del calibrante. Preparare cinque millilitri della soluzione di lavoro dei substrati e degli inibitori con soluzione di saggio mitocondriale preriscaldata due volte, 5% BSA e acqua sterile come descritto nel manoscritto di testo.
Quindi, caricare le porte dell'iniettore con substrato e inibitori come descritto nel manoscritto fiscale. Per la calibrazione nella scheda Esegui test, fare clic su Avvia esecuzione per avviare il test. Inserire la cartuccia di censura caricata e attendere il completamento della calibrazione.
Preparare un mezzo di saggio da 20 millilitri, mescolando due volte la soluzione di saggio mitocondriale, acqua sterile e 5% BSA in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere due microlitri di 10 micromolari ricombinanti perfringolisina O, per ottenere una concentrazione di un nanomolare. E ri-sospendere la miscela con un delicato pipettaggio, evitando scuotimenti e vortici.
Incubare il tubo a 37 gradi Celsius fino all'uso. Utilizzare una pipetta multicanale per lavare le celle e i pozzetti vuoti vuoti due volte, utilizzando una soluzione PBS priva di calcio e magnesio preriscaldata. Scartare il PBS e aggiungere 180 microlitri del mezzo di saggio preriscaldato per la permeabilizzazione cellulare.
Immediatamente dopo la permeabilizzazione sostituire la piastra di utilità della cartuccia del sensore calibrato con la piastra cellulare contenente celle permeabilizzate e avviare la misurazione. Il gruppo di trattamento aveva un più alto tasso di respirazione indotta da succinato. La risposta delle cellule A549 al trattamento con metformina è stata superiore a Hep G2. Per la respirazione indotta da piruvato malato, le cellule A549 hanno mostrato un aumento dell'induzione rispetto alle cellule Hep G2 tra cinque e 15 minuti.
Risultati simili sono stati ottenuti per la respirazione indotta da glutammato malato e la respirazione indotta da palmitoilcarnitina malato. Per raggiungere la giusta concentrazione di substrato e inibitori. Il volume giusto deve essere caricato nella porta giusta.
Quando viene identificato un cambiamento in una via metabolica di un determinato substrato, sarà necessario valutare la funzione degli enzimi e dei trasportatori coinvolti in tale percorso.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo modificato per la valutazione del flusso dei substrati respiratori mitocondriali mediante perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. La ricerca evidenzia l'impatto della metformina sulla respirazione mitocondriale in due linee cellulari tumorali distinte, A549 e Hep G2.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Metabolismo mitocondriale
- Risposta cellulare ai trattamenti farmacologici
- Oncologia e ricerca sul cancro
Sfondo
- L'importanza della funzione mitocondriale in varie patologie
- Come farmaci come la metformina influenzano il metabolismo delle cellule tumorali
- Metodi precedenti per valutare la respirazione mitocondriale
Metodi Utilizzati
- Respirometria basata su microtiter
- Linee cellulari tumorali A549 e Hep G2
- Perfringolisina O ricombinante per la permeabilizzazione
Risultati principali
- Il trattamento con metformina ha aumentato la respirazione indotta da succinato nelle cellule A549 rispetto alle cellule Hep G2.
- Miglioramenti simili osservati nella respirazione indotta da piruvato malato e da glutammato malato.
- I risultati confermano il potenziale degli assay sulla respirazione mitocondriale nell'indagare gli effetti dei farmaci nella ricerca sul cancro.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un nuovo metodo per valutare gli effetti dei farmaci sulla funzione mitocondriale nelle cellule tumorali.
- Questo potrebbe facilitare ulteriori ricerche sul targeting metabolico in oncologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Questo metodo consente una misurazione precisa del flusso dei substrati mitocondriali in cellule permeabilizzate, supportando la validazione degli obiettivi nella scoperta di farmaci antitumorali. Utilizzando la perfringolisina O ricombinante con la respirometria in micropiastre, permette una valutazione ad alto rendimento e riproducibile delle risposte metaboliche a composti come la metformina, riducendo il rumore biologico e migliorando l'affidabilità predittiva nei test di screening precoce.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche collegando le variazioni del flusso dei substrati mitocondriali ai meccanismi d'azione dei farmaci.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale di bersagli con un numero minimo di cellule e un'elevata capacità di replicazione.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio identificando composti che modulano specifici percorsi metabolici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi cellulari standardizzati e permeabilizzati per misurazioni riproducibili del flusso di substrato.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità e la scalabilità del saggio in formati a multi-pozzetto.
- Valore strategico: Permette uno screening affidabile di composti isolando la respirazione mitocondriale dalle interferenze citosoliche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando il malfunzionamento mitocondriale nei fenotipi tumorali.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso letture quantitative dei flussi metabolici.
- Valore predittivo: Guida un avanzamento proporzionato al rischio rilevando precoci modificazioni metaboliche predittive della risposta terapeutica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dal test dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del composto guida, in particolare per programmi oncologici incentrati sul metabolismo.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi misurando le variazioni di flusso in risposta a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Screening: Garantisce la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di permeabilizzazione e iniezione specifica per il substrato.
- Analisi: Produce letture quantitative del tasso di consumo di ossigeno (OCR) che permettono il confronto tra condizioni e la deconvoluzione dei percorsi metabolici.
- Ricerca traslazionale: Si collega al lavoro preclinico fornendo firme metaboliche allineate ai biomarcatori nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma riutilizzabile per valutare diversi inibitori e attivatori mitocondriali in progetti differenti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica negli effetti farmacologici mitocondriali.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante permeabilizzazione controllata e iniezioni definite di substrati/inibitori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di prosecuzione/cessazione collegando i fenotipi metabolici alla risposta al farmaco, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio basata su soglie di risposta del flusso e specificità del percorso metabolico.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in fisiologia mitocondriale e nell'utilizzo dell'analizzatore Seahorse XF.
- È subordinato all'accesso a strumentazione per la respirometria in microplacca e al reagente ricombinante perfringolisina O.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei substrati e dei tempi di iniezione.
- Richiede considerazioni di adattamento qualora si estenda l'applicazione a cellule primarie o modelli tridimensionali con efficienza di permeabilizzazione variabile.
- È limitato dalla necessità di concentrazioni ottimizzate dei substrati per evitare effetti non specifici, come indicato nel protocollo.
