Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

Perché testa il flusso del substrato mitocondriale che può essere influenzato da diverse patologie o trattamenti. Ad esempio, oggi lo useremo per rivelare la risposta delle cellule tumorali al trattamento con metformina. Richiede un numero minimo di celle pur avendo repliche sufficienti e un controllo appropriato per ogni materiale distinto.

L'analizzatore è solo per uso di ricerca. Questa tecnica può identificare errori nel metabolismo mitocondriale e può essere utilizzata per valutare i farmaci guerrieri che colpiscono i mitocondri. A dimostrare la procedura sarà Karolina Vaneckova una studentessa universitaria e tecnico di ricerca del mio laboratorio.

Per iniziare a seminare cellule A549 ad una densità di 20.000 cellule per pozzetto in colonne, da due a 11 di una micro-piastra di coltura cellulare XF 96 di cavalluccio marino. Lasciando le colonne uno e 12 vuote come pozzetti di sfondo. Riempire i pozzetti vuoti con un volume uguale del terreno di coltura cellulare, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per l'attacco cellulare.

Dopo tre o quattro ore, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura cellulare nei pozzi. Trattare le colonne del gruppo sperimentale da sette a 11 con una metformina millimolare e il gruppo di controllo con un volume uguale di acqua distillata sterile, quindi restituire la piastra all'incubatore. Per idratare i sensori, pipettare 200 microlitri di acqua sterile per pozzo nella piastra di utilità.

Quindi restituire con attenzione la cartuccia del sensore durante l'immersione del sensore in acqua. Incubare la cartuccia in un incubatore privo di anidride carbonica a 37 gradi Celsius fino al giorno successivo. Accendere l'analizzatore e l'unità di controllo.

Avviare il software di controllo dello strumento e di acquisizione dati e progettare il protocollo di analisi come descritto nel manoscritto di testo. Nelle definizioni di gruppo, creare quattro strategie di iniezione in cui la porta A differisce in base al substrato iniettato e denominare le strategie dopo i substrati o le abbreviazioni. Assegnare Oligomicina alla porta B, FCCP alla porta C e Rotenone Antimicina A miscela alla porta D.Creare e nominare otto gruppi, sotto la mappa della piastra, assegnare gruppi ai pozzi corrispondenti.

Quindi salvare il protocollo come modello pronto all'uso. Lasciare l'analizzatore acceso per consentire alla temperatura di stabilizzarsi durante la notte. Il giorno successivo, scartare l'acqua dalla piastra di utilità e aggiungere 200 microlitri del calibrante preriscaldato per pozzetto nella piastra di utilità.

Riportare la cartuccia nell'incubatore privo di anidride carbonica fino al momento del test. Mantenere una fonte di umidità all'interno dell'incubatore e spegnere o ridurre al minimo la velocità della ventola, per evitare una rapida evaporazione del calibrante. Preparare cinque millilitri della soluzione di lavoro dei substrati e degli inibitori con soluzione di saggio mitocondriale preriscaldata due volte, 5% BSA e acqua sterile come descritto nel manoscritto di testo.

Quindi, caricare le porte dell'iniettore con substrato e inibitori come descritto nel manoscritto fiscale. Per la calibrazione nella scheda Esegui test, fare clic su Avvia esecuzione per avviare il test. Inserire la cartuccia di censura caricata e attendere il completamento della calibrazione.

Preparare un mezzo di saggio da 20 millilitri, mescolando due volte la soluzione di saggio mitocondriale, acqua sterile e 5% BSA in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere due microlitri di 10 micromolari ricombinanti perfringolisina O, per ottenere una concentrazione di un nanomolare. E ri-sospendere la miscela con un delicato pipettaggio, evitando scuotimenti e vortici.

Incubare il tubo a 37 gradi Celsius fino all'uso. Utilizzare una pipetta multicanale per lavare le celle e i pozzetti vuoti vuoti due volte, utilizzando una soluzione PBS priva di calcio e magnesio preriscaldata. Scartare il PBS e aggiungere 180 microlitri del mezzo di saggio preriscaldato per la permeabilizzazione cellulare.

Immediatamente dopo la permeabilizzazione sostituire la piastra di utilità della cartuccia del sensore calibrato con la piastra cellulare contenente celle permeabilizzate e avviare la misurazione. Il gruppo di trattamento aveva un più alto tasso di respirazione indotta da succinato. La risposta delle cellule A549 al trattamento con metformina è stata superiore a Hep G2. Per la respirazione indotta da piruvato malato, le cellule A549 hanno mostrato un aumento dell'induzione rispetto alle cellule Hep G2 tra cinque e 15 minuti.

Risultati simili sono stati ottenuti per la respirazione indotta da glutammato malato e la respirazione indotta da palmitoilcarnitina malato. Per raggiungere la giusta concentrazione di substrato e inibitori. Il volume giusto deve essere caricato nella porta giusta.

Quando viene identificato un cambiamento in una via metabolica di un determinato substrato, sarà necessario valutare la funzione degli enzimi e dei trasportatori coinvolti in tale percorso.