Summary
La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.
Abstract
El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en las mujeres. El crecimiento de las células de cáncer de mama y su posterior metástasis es un factor clave para su progresión. Aunque los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento del cáncer de mama se han estudiado intensamente utilizando monocultivos de células de cáncer de mama como las células MCF-7, no se ha investigado en profundidad la contribución de otros tipos de células, como las células endoteliales vasculares y linfáticas que están íntimamente implicadas en el crecimiento tumoral. La interacción célula-célula juega un papel clave en el crecimiento y la progresión del tumor. La neoangiogénesis, o el desarrollo de vasos, es esencial para el crecimiento tumoral, mientras que el sistema linfático sirve como un portal para la migración de células cancerosas y la metástasis posterior. Estudios recientes proporcionan evidencia de que las células endoteliales vasculares y linfáticas pueden influir significativamente en el crecimiento de las células cancerosas. Estas observaciones implican la necesidad de desarrollar modelos in vitro que reflejen de manera más realista los procesos de crecimiento del cáncer de mama in vivo. Además, las restricciones en la investigación con animales requieren el desarrollo de modelos ex vivo para dilucidar mejor los mecanismos involucrados.
Este artículo describe el desarrollo de esferoides de cáncer de mama compuestos tanto por células de cáncer de mama (células MCF-7 con receptor de estrógeno positivo) como por células endoteliales vasculares y/o linfáticas. El protocolo describe un enfoque detallado paso a paso en la creación de esferoides de doble celda utilizando dos enfoques diferentes, gota colgante (estándar de oro y barato) y placas de fondo en U de 96 pocillos (caro). Se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo recoger delicadamente los esferoides formados para monitorear el crecimiento mediante el dimensionamiento microscópico y la evaluación de la viabilidad utilizando la tinción de células muertas y vivas. Además, se delinean procedimientos para fijar los esferoides para seccionar y teñir con anticuerpos específicos del crecimiento para diferenciar los patrones de crecimiento en los esferoides. Además, se proporcionan detalles para preparar esferoides con células transfectadas y métodos para extraer ARN para análisis molecular. En conclusión, este artículo proporciona instrucciones detalladas para preparar esferoides multicelulares para la investigación del cáncer de mama.
Introduction
El uso de animales para experimentos tiene limitaciones. Los estudios en animales no pueden imitar con precisión la progresión de la enfermedad en humanos, y los animales y los humanos no tienen respuestas idénticas a los patógenos. Además, las restricciones en la experimentación con animales debido a las preocupaciones por el sufrimiento animal y los problemas éticos1,2 restringen cada vez más los programas de investigación. In vitro se han desarrollado ampliamente sistemas para eludir el uso de animales; además, el uso de células humanas ha hecho in vitro modelos más relevantes para la investigación fisiopatológica y terapéutica. Los cultivos celulares monocapa convencionales (2D) son ampliamente utilizados porque imitan los tejidos humanos hasta cierto punto. Sin embargo, los monocultivos 2D no logran imitar los órganos humanos, y los monocultivos 2D no pueden simular el complejo microambiente de los órganos originales e imitar el in vivo situación3,4,5,6. Además, en cultivos celulares monocapa, los tratamientos farmacológicos podrían destruir / dañar fácilmente todas las células. Es importante destacar que algunas de estas limitaciones se pueden superar cambiando a cultivos celulares tridimensionales (3D) multicapa.7,8. De hecho, se ha demostrado que los modelos de cultivo 3D reflejan mejor la estructura celular, el diseño y la función de las células en los tejidos primarios. Estos cultivos 3D se pueden formar utilizando una variedad de líneas celulares, similares a un órgano funcional. De hecho, hay dos modelos de culturas 3D. Un modelo produce esferoides de células agregadas que forman grupos y los reorganizan en esferas (modelos sin andamios). El segundo produce organoides, que tienen una estructura más compleja y consisten en combinaciones de múltiples células específicas de órganos, que se consideran como una versión en miniatura de los órganos.9,10. Debido a esto, los sistemas de cultivo 3D representan una tecnología innovadora con muchas aplicaciones biológicas y clínicas. Por lo tanto, los esferoides y organoides tienen numerosas aplicaciones para el modelado de enfermedades y estudios relacionados con la medicina regenerativa, la detección de drogas y los estudios toxicológicos.6,11,12,13,14,15. Los esferoides cancerígenos, derivados de la tecnología 3D, recrean la morfología y el fenotipo de los tipos de células relevantes, imitan el in vivo microambiente tumoral y modelar las vías de comunicación y señalización de las células que están operativas durante el desarrollo del tumor16,17,18. Además, para mejorar la comprensión de la biología del cáncer, los esferoides/organoides tumorales también se pueden usar para identificar una posible terapia contra el cáncer específica del paciente (personalizada) y evaluar su eficacia, toxicidad y efectos a largo plazo.19,20,21,22. Los esferoides han abierto oportunidades prominentes para investigar la fisiopatología, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos debido a su capacidad para preservar la arquitectura de tejidos celulares y tridimensionales, la capacidad de imitar la in vivo situación, y las interacciones célula-célula. Sin embargo, también se deben ser conscientes de las limitaciones de este sistema, como la falta de componente vascular / sistémico, sistema inmunológico o nervioso funcional, y el sistema representa un enfoque reduccionista en comparación con los modelos animales. De hecho, a diferencia de los modelos animales, las estructuras 3D proporcionan solo una aproximación de la biología dentro de un cuerpo humano. Comprender las limitaciones del método 3D puede ayudar a los investigadores a diseñar procesos más refinados y válidos para producir esferoides que representen mejor un órgano a mayor escala.23,24,25.
El cáncer es la principal causa de muerte en todo el mundo, y el cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres26,27,28. Para imitar el complejo microambiente del cáncer de mama, los esferoides del cáncer de mama deben cultivarse utilizando células que desempeñan un papel destacado en los tumores de mama, es decir, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos y / o células inmunes. Además, para un esferoide que representa el cáncer de mama, también se debe considerar la expresión de los receptores de hormonas femeninas (receptores de estrógeno / progesterona), la capacidad de conservar el estado histológico tumoral del paciente y la capacidad de imitar la respuesta a la terapia. Los estudios han demostrado que los sistemas de cocultivo 3D tienen una organización celular similar a la del tejido primario in vivo,tienen la capacidad de reaccionar en tiempo real a los estímulos y tienen receptores andrógenos funcionales29,30,31,32. Por lo tanto, un enfoque similar podría ser útil para imitar un tumor de mama in vitro. El propósito del protocolo actual es establecer un nuevo método de generación de esferoides de cáncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 con receptores de estrógeno positivos (una línea celular humana inmortalizada de células epiteliales) y células endoteliales vasculares (HUVEC) o células endoteliales linfáticas (HMVEC-DNeo) para crear un modelo que imita o refleja de cerca las interacciones entre estas células dentro de un tumor. Aunque MCF-7 (sensible al estrógeno) y las células endoteliales se han utilizado para desarrollar esferoides en el presente estudio, otras células como los fibroblastos que representan ~ 80% de la masa tumoral de mama, también podrían combinarse en el futuro para representar e imitar mejor el tumor de mama.
Existen varios métodos para formar esferoides, tales como: 1) el método de gotas colgantes que emplea la gravedad33,34; 2) el método de levitación magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expuestas a un imán externo35,y 3) el método de microplaca esferoide que se realiza mediante la siembra de células en placas de baja unión36,37. Sobre la base de los métodos existentes, que utilizan un solo tipo de célula, el presente protocolo se ha optimizado utilizando células epiteliales y endoteliales para imitar mejor las condiciones de crecimiento de los tumores de cáncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método se puede lograr fácilmente en el laboratorio a un bajo costo y con requisitos mínimos de equipo. Sobre la base de la necesidad / objetivos del laboratorio, se utilizaron diferentes enfoques para formar esferoides y obtener material celular relevante a partir de estos esferoides. En este contexto, para el análisis de ADN, ARN o proteínas, los esferoides 3D se producen mediante el cocultivo de células endoteliales y epiteliales con el método de gota colgante. Sin embargo, para estudios funcionales, por ejemplo, para monitorear el crecimiento celular después de una transfección de interferencia corta (siRNA) y / o tratamiento hormonal, los esferoides se generan utilizando placas de fondo en U.
El propósito de este protocolo técnico es proporcionar una descripción detallada paso a paso para 1) la formación de esferoides de tipo multicelular del cáncer de mama, 2) la preparación de muestras para la tinción histológica y 3) la recolección de células para la extracción de ARN, ADN y proteínas. Tanto el método de gota colgante de bajo costo como las placas de fondo en U más caras se utilizan para formar esferoides. Aquí, se proporciona un protocolo para preparar (fijar) esferoides para el seccionamiento y la posterior inmunotinción con marcadores para evaluar la proliferación celular, la apoptosis y la distribución de las células epiteliales y endoteliales dentro de un esferoide. Además, este protocolo muestra un análisis completo paso a paso de los datos histológicos utilizando el software ImageJ. La interpretación de los datos biológicos varía según el tipo de experimento y los anticuerpos utilizados. El seccionamiento de esferoides fijos y la posterior tinción de las secciones fue realizado por un laboratorio de patología de rutina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)
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Protocol
1. Cultivo celular
NOTA: Realizar el manejo celular en condiciones estériles.
- Subcultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)
- Cubra 75 cm2 matraces con colágeno (5 μg/cm2) (cola de rata) durante la noche (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 h a 37 °C, enjuague con agua y deje que el matraz se seque.
- Cultivar HUVEC en medio de crecimiento (EBM-2, Medio Basal Endotelial-2) suplementado con glutamina (1x = 2 mM), solución antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina y 0,025 μg/mL de anfotericina B), LSGS (2% v/v FCS, 1 μg/mL de hidrocortisona, 10 ng/mL de Factor de Crecimiento Epidérmico humano, 3 ng/mL de Factor de Crecimiento de Fibroblastos básico humano, 10 μg/mL de heparina) y 10% FCS (Fetal Calf Serum) en condiciones estándar de cultivo de tejidos (37 °C, 5% CO2). Cambie el medio cada 2 días hasta que las células alcancen el 70% -80% de confluencia.
- Lavar los cultivos subconfluentes con 5 mL de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)y añadir 3 mL de tripsina (0,25% diluido en HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)).
NOTA: HBSS también se puede reemplazar con PBS. - Incubar las células a 37 °C durante 2 min (comprobar microscópicamente si las células están desprendidas y redondeadas hacia arriba) y detener la reacción de desprendimiento añadiendo 6 mL de medio FCS al 10% (DMEM-F12 o EBM-2, 10% FCS).
- Centrifugar la suspensión celular a 250 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante.
- Suspender las células en medio de crecimiento y sembrar en 75 cm2 matraces o platos de cultivo.
- Subcultivo de la Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7, células de adenocarcinoma mamario humano)
- Cultivar líneas celulares de cáncer de mama humano en matraces de 75 cm2 en medio de crecimiento (medio DMEM/F12 suplementado con glutamina comercial (1x), solución antibiótico-antimicótica (AA; 100 μg/mL de estreptomicina, 100 μg/mL de penicilina y 0,025 μg/mL de anfotericina B) y 10% de FCS en condiciones estándar de cultivo tisular (37 °C, 5% CO2). Cambie el medio cada 2-3 días.
- Lavar los cultivos celulares subconfluentes (70%-80% de confluencia) con 5 mL de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+)y añadir 3 mL de tripsina (0,5% diluido en HBSS (sin Ca 2+ y Mg2+) a37°C durante 5 min (verificar microscópicamente que las células están desprendidas).
NOTA: HBSS también se puede reemplazar con PBS. - Agregue 8 ml de medio FCS al 10% para detener la reacción de desprendimiento, centrífuga a 250 x g durante 5 minutos en RT y deseche el sobrenadante.
- Suspenda el pellet en medio de crecimiento y placa en 75 cm2 matraces o platos de cultivo.
2. Formación de esferoides
- Placa 5 x 105 células/ml (HUVECs y MCF-7) en plato redondo de 3,5 cm y cultivo durante 48 h.
- Tratar o transfectar las células chapadas durante 24 horas o como se desee.
- Paso opcional realizado en placa de fondo en U de 96 pocillos: Lave las células con 1 ml de HBSS (Ca2+ y Mg2+)y manche los HUVEC con un tinte azul (0,5 μg/mL) y las células MCF-7 con un colorante verde (0,5 μM) diluido en el medio de crecimiento respectivo y colóquelos en una incubadora de 37 °C y 5% de CO2 durante 30-40 min.
- Lave las células con 1 ml de HBSS (sin Ca2+ y Mg2+),agregue 1 ml de reactivo de desprendimiento enzimático (tripsina al 0,25% para HUVEC y tripsina al 0,5% para MCF-7) a cada plato redondo con una pipeta P1000, y luego incube durante 2-5 minutos hasta que las células se separen.
- Recoja cada tipo de célula por separado en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml y agregue 1 ml de medio FCS al 10% utilizando una pipeta P1000 para detener la reacción enzimática. Centrifugar las suspensiones celulares a 250 x g durante 5 min.
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y suspenda las células en 1 ml de medio libre de esteroides (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicótico, 0.4% FCS sf (carbon-stripped)).
NOTA: El medio libre de esteroides se puede reemplazar con un medio de crecimiento normal. - Utilice 100 μL de cada suspensión celular diluida con 10 mL de Diluyente II (ver Tabla de Materiales)para determinar el número total de células y calcular la cantidad de medio de tratamiento (EBM-2, glutamina, antibiótico-antimicótico, 0,4% FCS sf, vehículo/Tratamiento) necesario para obtener una suspensión celular de 5 x 103 células/ml o 3,4 x 105 células/ml por tipo de célula.
- Recuento de celdas
- Encienda la máquina y enjuague presionando los botones Función e Inicio (configuración S3), con la solución Diluent II en un vial de contador de celdas.
- Utilice la configuración de S4 y pulse Inicio para medir el espacio en blanco con una solución diluyente II fresca.
- Cambie el vial de centelleo con 100 μL de suspensión celular en 10 ml de solución de Diluent II y mida las muestras: configure S4 y presione Inicio.
- Anote el número de celdas por ml en la pantalla digital.
NOTA: El conteo de células también se puede realizar utilizando otros sistemas manuales o automáticos: líneas de cuadrícula de hemocitómetro, tecnología de conteo de células de dispersión de luz, impedancia eléctrica, sistemas basados en imágenes que utilizan tinción celular, por ejemplo, azul de tripano.
- Placas de fondo en U de 96 pocillos
- Preparar 5 mL de cada suspensión celular (5 x 103 celdas/mL) y mezclarlos para obtener un volumen final de 10 mL en la proporción de 1:1.
- Use una pipeta de repetición manual para pipetear 100 μL de la suspensión celular en cada pozo de las placas de fondo en U de 96 pocillos.
- Coloque la placa en una incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos y verifique la formación de esferoides después de 48 h.
- Paso opcional: Tome imágenes de los esferoides (40x) usando un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
NOTA: Este método genera 96 esferoides (un esferoide/pozo) después de 48 h (área 1-2 píxel2),y generalmente se usa para estudios de crecimiento.
- Gota colgante
- Mezcle las suspensiones celulares (3.4 x 105 celdas/ml) en una proporción de 1:1 para obtener un volumen final de 2 ml.
- Use una pipeta P20 para sembrar la mezcla celular en forma de gotas de 15 μL en la tapa invertida de una placa de Petri de 10 cm.
- Invierta la tapa con las gotas y agregue 5 ml de medio base (EBM-2) en la parte inferior del plato para evitar la evaporación de las gotas.
NOTA: Este método genera un esferoide/gota después de 48 h. Asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente separadas entre sí, para que no se fusionen al cambiar la tapa. Use más de una placa de Petri de 10 cm si es necesario.
- Recuento de celdas
3. Estudio de crecimiento de esferoides
- Placa 100 μL de HUVEC y mezcla de células MCF-7 (5 x 102 células/pozo) en placas de fondo en U de 96 pocillos y colóquelas en la incubadora.
- 48 h después del recubrimiento, verifique la formación de esferoides con un microscopio invertido (campo brillante). Tome fotografías (al menos seis imágenes por tratamiento, 40x) a 96 h de cultivo.
- Abra las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes y procese la imagen a 300 píxeles / pulgada y guarde la imagen como un archivo tiff.
- Descargue el software ImageJ y ábralo. Haga clic en la opción Archivo y vaya a Abrir.
- Convierta las áreas de interés en áreas negras saturadas de manera uniforme para tener una imagen binaria (blanco y negro). Para ello, seleccione la opción Imagen, elija Tipo | 8 bits. Ahora, la imagen es en blanco y negro.
- Utilice la herramienta de selección a mano alzada para dibujar el borde de los esferoides.
- Para calcular el área de interés y separar el objeto o los píxeles en primer plano de los píxeles de fondo, utilice la función de umbral: Seleccione la opción Imagen, elija Ajustar y haga clic en Umbral.
- Ahora se abrirá una ventana emergente umbral. La barra superior indica el valor de umbral mínimo: establezca el valor en cero. La barra inferior indica el valor umbral máximo: mueva la barra hasta que el área de interés se vuelva completamente roja.
NOTA: Si el color no es rojo, seleccione Rojo en la ventana Umbral. - Ir a Analizar | Establezca Medidas y seleccione Área y perímetro.
- Para medir el área de interés, seleccione la opción Analizar y utilice la herramienta Analizar partículas. En la ventana Analizar partículas, establezca el Tamaño a medir (0.00003-Infinity o 3-Infinity, dependiendo del tamaño de los esferoides), seleccione Resumir y Mostrar resultados. Luego, haga clic en Aceptar.
- Los resultados aparecerán en un gráfico. Copie las mediciones en una hoja de cálculo para analizar los datos.
NOTA: El área se calcula como el número de píxeles totales; utilice el Área total para el cálculo.
4. Estudio de inmunohistoquímica esferoide
- Preparación de muestras
- Placa la mezcla celular de HUVEC y MCF-7 (5 x 103 celdas/pozo) en placas de fondo en U de 96 pocillos en medio de crecimiento HUVEC durante 96 h.
- Recolectar aproximadamente 50 esferoides en un tubo de 1,5 ml con una punta cortada de una pipeta P200 μL; deje que se asienten en el fondo del tubo por gravedad y luego deseche el sobrenadante.
- Fijar los esferoides con 500 μL de PFA al 4% durante 1 h, RT.
- Hervir la solución de agar Nobel al 2% en PBS utilizando una placa caliente con un agitador magnético durante 3-5 min para disolver completamente el polvo de agarosa y enfriar hasta alrededor de 60 ° C.
- Retire el PFA con una pipeta P1000, lave los esferoides con 500 μL de PBS y deje que se sedimenten. Deseche el sobrenadante.
- Pipetee cuidadosamente 600 μL de solución de agarosa en el tubo de 1,5 ml con esferoides y coloque el tubo inmediatamente en una centrífuga con un rotor horizontal a 177 x g durante 2 min.
- Agregue una cuerda corta en el medio de la solución de agarosa para quitar fácilmente el tapón del tubo.
- Solidificar el tapón de agarosa sobre hielo o a 4 °C. Agregue 500 μL de PBS en el tubo de 1.5 ml para evitar que se seque el pellet.
NOTA: Las muestras están listas para la deshidratación posterior, la incrustación de parafina, la seccionamiento, la transferencia a los portaobjetos del microscopio y la tinción de IHC (realizada por Sophistolab).
- Adquisición y procesamiento de imágenes
- Adquirir imágenes de secciones esferoides utilizando un estereomicroscopio.
- Guarde tres imágenes para cada muestra como archivos .jpg.
- Abra el software ImageJ. Abra la imagen JPEG, haga clic en Archivo y luego en Abrir.
- Seleccione Color y Deconvolución de color en la opción Imagen.
- Seleccione los vectores H DAB en la ventana Deconvolución de color 1.7 y aparecerán las tres imágenes.
NOTA: Las tres imágenes son: El color 1 representa solo la tinción de hematoxilina (azul / púrpura), y el color 2 representa solo la tinción DAB (marrón). El color 3 no es necesario para el análisis de imágenes con dos tinciones. - Seleccione la ventana Color 1 y establezca el Umbral: vaya a imagen | Ajuste y haga clic en Umbral. Aparecerá la ventana Umbral.
- Deje el valor de umbral mínimo establecido en cero y ajuste el valor de umbral máximo para eliminar la señal de fondo sin influir en la señal verdadera. Haga clic en Aplicar.
- Medición de área
- Haga clic en Analizar, elija Establecer medición. Seleccione Área, Valor gris medioy Valor gris mínimo y máximo y haga clic en Aceptar para confirmar.
- Mida el tamaño del núcleo mediante la opción Analizar y, a continuación, seleccione Medir.
NOTA: La ventana Resultados proporciona el nombre de la imagen (Etiqueta), el tamaño de la imagen (Área), la intensidad media de píxeles de la imagen IHC (Media) y los valores de gris mínimo y máximo (Mín, Máx.). Utilice el valor medio para el cálculo. - Repita los pasos 4.2.6-4.7.1.2 para la ventana Color 2 (y Color 3 si hay doble tinción).
- Cuantificación celular
- Haga clic en Procesar,elija la opción Binario y seleccione Cuenca para separar las celdas.
- Vaya a Analizar y haga clic en Analizar partículas. En la ventana emergente Analizar partículas, establezca el tamaño de las celdas para excluir partículas no específicas. A continuación, en la opción Mostrar, haga clic en el cuadro desplegable y seleccione Contornos. Luego, haga clic en Aceptar.
- Repita los pasos 4.2.6-4.2.7 y los pasos de cuantificación de celdas (sección 4.2.7.2) para la ventana Color 2 (y Color 3 si hay doble tinción).
NOTA: Ahora aparecerán tres ventanas: 1) Resultados de resumen (número de celdas contadas, área total, tamaño promedio, % de área y media), 2) Resultados (correspondientes a las celdas que se cuentan) y 3) Ventana de dibujo (imagen representada de las celdas que se cuentan).
- Medición de área
5. Tinción viva/muerta en esferoides
- Preparar soluciones madre de 4 mM de Calceína AM en DMSO (tiñe células vivas de verde) y 2 mM de homodímero de Etidio en DMSO (tiñe de glóbulos muertos de rojo) en tubos de 1,5 mL.
- Calcule la cantidad de solución necesaria para agregar 10 μL/pocillo de una mezcla de Calceína AM y homodímero de Etidio diluido 1:50 en EBM-2.
- Agregue la mezcla de tinción a los esferoides y coloque la placa en la incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos durante 30-60 min.
- Adquiera imágenes (40x) utilizando el microscopio estereoscópico de fluorescencia.
6. Aislamiento de proteínas y ARN de esferoides
- Prepare suspensiones celulares a 3.4 x 105 células/ ml por tipo de célula, mézclelas en una proporción de 1: 1 y selle la mezcla celular usando una pipeta P20 en forma de gotas de 15 μL en la tapa de una placa de Petri de 10 cm. Invierta la tapa y colóquela en la incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos durante 96 h.
- Use 5-6 ml de PBS para recolectar esferoides en un tubo de poliestireno de fondo redondo de 15 ml utilizando pipetas de poliestireno estériles de 5 ml.
NOTA: También es posible utilizar tubos cónicos de 15 ml. - Centrifugar la suspensión de los esferoides a 250 x g durante 5 min, y luego aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
- Añadir 500 μL de tripsina (100%) y pipetear hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta P1000 durante 30 s para desagregar los esferoides, consiguiendo una suspensión celular.
- Neutralizar la tripsina con medio FCS al 10%, centrifugar los tubos a 250 x g durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
- De acuerdo con el protocolo del fabricante (kit específico para el aislamiento de ARN libre de ADN), use 300 μL de tampón de lisis de ARN para lisar el gránulo celular.
NOTA: El tampón de lisis también se puede agregar directamente a los esferoides intactos (no se requiere un paso de tripsina) para extraer el ARN. Agregue 300 μL del tampón de lisis a los esferoides granulados, coloque tubos en hielo y triture 10 veces con una pipeta P200. Posteriormente, aísle el ARN como se mencionó anteriormente. La disociación esferoide puede ser necesaria si la recuperación del ARN es baja debido a la interferencia de la matriz. - Alternativamente, use 70 μL del tampón de lisis para el aislamiento de proteínas. Homogeneizar para 2-4 s por sonicación y determinar la concentración de proteínas de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando un kit de ensayo BCA.
NOTA: Para el aislamiento de proteínas, los esferoides granulados se pueden lisar directamente en el tampón de lisis seguido de sonicación. Use 25 μg de proteína total para realizar western blot.
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Representative Results
El modelo de esferoides que utiliza cocultivos epiteliales y endoteliales es necesario para imitar de cerca las condiciones in vivo de los tumores de mama para experimentos in vitro. El esquema de la Figura 1 representa el protocolo para formar esferoides con células epiteliales de cáncer de mama y células endoteliales vasculares o linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula se siembra por separado en un plato redondo de 3,5 cm y se trata con estimuladores/ inhibidores del crecimiento o se transfecta con oligonucleótidos utilizando lipofectamina. Las monocapas confluentes de células epiteliales o endoteliales se cosechan después de la tripsinización, se lavan y se mezclan en una proporción de 1: 1. Posteriormente, las células se enchapan en placas de fondo en U de 96 pocillos(Figura 1A)o en la tapa invertida de una placa de cultivo redonda de 10 cm de diámetro para facilitar el cultivo de gota colgante(Figura 1B). Poco después de la siembra, las células aparecen como láminas planas y densas de células en el fondo de cada pozo o gota, y, posteriormente, se agregan con el tiempo (24-48 h), formando así esferoides intactos a las 48 h. Para evitar cualquier daño a los agregados celulares poco formados, las placas no deben ser perturbadas durante al menos 24 h.
En las placas U-bottom, la siembra de células MCF-7, pero no de células endoteliales o linfáticas, dio lugar a la formación de esferoides después de 48 h(Figura 2A,B,respectivamente). Además, la siembra de MCF-7 más células endoteliales o células linfáticas en una proporción de 1: 1 también resultó en la formación de esferoides(Figura 2C,D,respectivamente). Para validar los esferoides como modelo para estudiar el crecimiento tumoral, se midieron/cuantificaron los cambios dependientes del tiempo en el tamaño de los esferoides en respuesta a la solución estimulante del crecimiento y se compararon con los controles no tratados(Figura 2). Las fotomicrografías de la Figura 2E muestran el crecimiento secuencial dependiente del tiempo (24-120 h) de un esferoide MCF-7 representativo. El gráfico de líneas de la Figura 2F representa el cambio en el área de los esferoides MCF-7 a lo largo del tiempo cuando se tratan con o sin un estimulador del crecimiento. El tamaño de los esferoides aumentó de ~100 μm a ~200 μm durante 5 días; además, se observó una mayor tasa de crecimiento en los esferoides tratados con el estimulador del crecimiento (Figura 2F). Debido a que el tratamiento a largo plazo (168 h) resultó en una reducción de la viabilidad de MCF-7, potencialmente debido a condiciones hipóxicas en el centro de los esferoides(Figura 3),se estudió el crecimiento de la estructura 3D hasta las 96 h. Los esferoides formados con células MCF-7 y HUVEC muestran un menor número de células muertas a las 168 h en comparación con los esferoides formados con MCF-7 solo.
En los experimentos iniciales, solo se observó un pequeño crecimiento en el tamaño de los esferoides después de 4 días de cultivo. Se planteó la hipótesis de que esto podría deberse al alto número de células sembradas para formar esferoides. En las placas de cultivo del fondo en U, el crecimiento de los esferoides podría haber sido limitado por la forma cóncava del pozo. Dado que el crecimiento dependía del número inicial de células sembradas, se utilizaron diferentes números de células para formar esferoides para probar y establecer condiciones que serían óptimas para monitorear el crecimiento de los esferoides. Como se muestra en la Figura 4,los hallazgos sugieren que para los estudios de crecimiento de esferoides, la siembra de 500 células / pozo para formar esferoides fue confiable y reproducible para monitorear el crecimiento de los esferoides durante 4-6 días en respuesta a factores moduladores del crecimiento. Los esferoides más adecuados para observaciones histológicas o inmunohistológicas se obtuvieron el día 4, después de la siembra de 5 x 103 células/pozo. Esta misma concentración inicial se utilizó para extracciones de proteínas celulares o ARN. El aumento de la concentración celular inicial en más de 7,5 x 103 células/pozo no mejoró la formación de esferoides, y las células no se agregaron adecuadamente y asumieron estructuras irregulares (Figura 4).
Para evaluar la composición celular, la proliferación y el estado de la apoptosis, se examinaron secciones histológicas de esferoides formados con células de cáncer de mama más células endoteliales utilizando anticuerpos H&E y Ki67 (dilución 1:300) y Caspasa-3 escindida (dilución 1:500). El proceso para la preparación final de la muestra requiere cuidado/atención y precisión. La Figura 5A muestra el flujo de trabajo para la recolección e incorporación de esferoides en la agarosa para la seccionamiento. Las fotomicrografías de la Figura 5B-C demuestran la diferencia en la formación de esferoides MCF-7 en presencia(Figura 5B)y ausencia(Figura 5C)de Lipofectamina (concentración final del 0,17%), un agente de transfección de uso común. Las imágenes microscópicas de campo brillante de secciones histológicas muestran una estructura circular y compacta de una mezcla homogénea de dos tipos de células(Figura 5D-G). La estructura de los esferoides y la forma de sus células no mostraron anomalías después de la transfección con oligonucleótidos de control en presencia de lipofectamina(Figura 5D). Además, las células que expresan el marcador proliferativo, Ki67, se distribuyeron homogéneamente en los esferoides; sin embargo, también se observó un anillo de células proliferativas en la superficie de los esferoides (Figura 5E). La tinción de Caspasa-3 escindida mostró células apoptóticas después de 4 días de cultivo (Figura 5F). Las secciones histológicas son útiles para evaluar la distribución de las células epiteliales y endoteliales en los esferoides utilizando marcadores específicos. Utilizando CD31 como marcador específico para las células endoteliales, es posible determinar su distribución dentro de la estructura 3D. Dado que todas las células están teñidas con hematoxilina (tinción azul del núcleo de la célula), el cálculo de la expresión de CD31 podría proporcionar el área de los esferoides que contienen células endoteliales después del tratamiento o la transfección (sección 4.2.7.1 del protocolo). Además, al realizar un ensayo de tinción dual, es posible tener aún más información, por ejemplo, como se muestra en la Figura 5G,CD31 tiñe las células endoteliales (rojo) y Ki67 tiñe las células proliferativas (marrón). Siguiendo la sección del protocolo 4.2.7.2, la Figura 5G reveló que el 55% son células epiteliales, el 45% son células endoteliales y el 25% de las células están proliferando.
La estructura de los esferoides también se puede estudiar mediante análisis de inmunofluorescencia después del etiquetado de células con colorantes vivos. Los cultivos 2D confluentes de células HUVEC y MCF-7 se tiñeron por separado con colorantes azules (HUVEC) y verdes (MCF-7). Posteriormente, las células teñidas se recolectaron y mezclaron en una proporción de 1: 1 y se sembraron en pozos para la formación de esferoides. Las imágenes de células fluorescentes teñidas se tomaron inmediatamente después de la siembra (Figura 6A) y después de 3 días de cultivo (Figura 6B). Con el objetivo de evaluar el porcentaje de células vivas y muertas, se tiñeron esferoides de 4 días de edad con calceína-AM (verde) y con homodímero de etidio (rojo)(Figura 6C). Los esferoides formados con MCF-7 y HUVEC no pudieron congelarse / conservarse con éxito utilizando los protocolos estándar para congelar células (medio de crecimiento complementado con 10% DMSO y 10% FCS) para congelar células. En los esferoides congelados y descongelados, la ruptura de los agregados celulares y el aumento de la pérdida de viabilidad celular fueron evidentes. La imagen representativa de la Figura 6D muestra un esferoide recién descongelado teñido de células muertas y vivas. Muestra que los esferoides son muy sensibles a las condiciones de congelación.
Después de 5 días de cultivo en condiciones experimentales, fue necesaria la lisis de alrededor de 100 esferoides para recolectar suficiente proteína (~ 3 μg / ml) o ARN (~ 60 ng / μL) para el análisis. La Figura 7 representa un flujo de trabajo desde la recolección de esferoides (generada con el método de gotas colgantes) hasta la lisis celular para la extracción de proteínas para realizar western blotting o aislamiento de ARN para futuros ensayos o análisis de Microarrays por RT-PCR. El aislamiento de ARN/ADN de una población celular heterogénea en un esferoide para el análisis de microarrays puede aportar información útil. Sin embargo, para identificar mecanismos clave específicos de la célula o interacciones célula-célula, las células esferoides se pueden separar después de la disociación enzimática (tripsina o accutasa), utilizando el análisis FACS y el ARN de células específicas utilizadas para el análisis de microarrays. Además, las líneas celulares resistentes a los antibióticos (por ejemplo, mediante el uso de EGFP y / o líneas celulares de resistencia a la puromicina) podrían usarse en esferoides para abordar el papel de un tipo celular específico de interacción célula-célula. Además, las herramientas de silenciamiento de genes se pueden utilizar para diseñar las células para abordar problemas específicos de interacción célula-célula.
Figura 1: Flujo de trabajo de formación de esferoides. Las células MCF-7 y HUVEC o LEC en cultivos 2D se cultivan por separado y se recolectan después de varios tratamientos deseados. Los esferoides se generan posteriormente mediante la mezcla directa de células en placas de fondo en U de(A)96 pocillos, que promueven la formación de la estructura 3D mediante la agregación de célula a célula, o mediante el uso de(B)cultivo de gota colgante que apoya la formación de esferoides a través de la fuerza de la gravedad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Formación y desarrollo de esferoides a lo largo del tiempo. Las imágenes muestran la formación de un esferoide por las células MCF-7(Panel A),la falta de formación de esferoides por las células endoteliales o linfáticas (HUVEC; (Grupo B)) chapados a la misma densidad, y formación de esferoides por células MCF-7 más HUVEC o LECs mezclados en una proporción de 1:1(Paneles C,D). También se representa el crecimiento en tamaño de un esferoide a lo largo del tiempo (24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h). Este esferoide se formó a partir de una mezcla de MCF-7 más HUVEC en una proporción de 1: 1 y se sembró a una densidad de 500 células / pozo de una placa de fondo en U de 96 pocillos(Panel E), (barra de escala = 200 μm, 40x). El gráfico de líneas(Panel F)muestra el crecimiento dependiente del tiempo del control (CTR) frente a los esferoides estimulados por el crecimiento (Tratamiento). Las áreas de esferoides se midieron y compararon entre esferoides no tratados y tratados. Los resultados representan ± SEM, *** p < 0,001 en comparación con el control respectivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivo y viabilidad de losesferoides a largo plazo. La fotomicrografía muestra la viabilidad celular en esferoides formados con células MCF-7 solas a las 96 h(Panel A)y 168 h(Panel C),mientras que los Paneles B y D representan la viabilidad celular en esferoides hechos con MCF-7 más HUVEC (relación 1:1) a 96 h(Panel B)y 168 h(Panel D)(barra de escala = 100 μm). Las células se tiñeron con Calceína (glóbulos rojos, muertos) y homodímero de Etidio (células verdes, vivas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Densidad de siembra celular y perfil de crecimiento dependiente del tiempo de MCF-7 más esferoide HUVEC. Las HUVEC y las células MCF-7 mezcladas en una proporción de 1:1 se sembraron a densidades crecientes (102-104 células/pozo), y el crecimiento de los esferoides se monitoreó durante 24-96 h. Se tomaron imágenes microscópicas de campo brillante (barra de escala = 200 μm, 40x) para evaluar el crecimiento de los esferoides a lo largo del tiempo. Las células con una densidad de 500 células/pozo proporcionaron un tamaño óptimo para estudiar el crecimiento de los esferoides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Incrustación de esferoides para seccionamiento y tinción histológica. Panel A: Caricatura que representa el flujo de trabajo para la recolección e incorporación de esferoides HUVEC/MCF-7 en la agarosa. Después de la incrustación de parafina de los esferoides en un tapón de agarosa y la seccionamiento de bloques de parafina, las muestras se utilizaron para la tinción histológica estándar. Los paneles B y C muestran mcF-7 representativo más esferoides HUVEC tratados sin y con Lipofectamina 2000, respectivamente (barra de escala = 200 μm, 40x). Los paneles D-G muestran imágenes representativas de secciones esferoides teñidas con marcadores específicos. El panel D muestra los esferoides teñidos con hematoxilina-eosina para evaluar la estructura del esferoide (barra de escala = 100 μm). La tinción en el Panel E representa células proliferantes teñidas positivamente con Ki67. El panel F muestra células apoptóticas en un esferoide teñido positivamente con caspasa escindida-3 (barra de escala = 50 μm). El panel G representa secciones esferoides con tinción dual: CD31 (marcador de células endoteliales) y Ki67 (marcador proliferativo) (barra de escala = 100 μm). El seccionamiento de esferoides y tinción fueron realizados por Sophistolab (info@sophistolab.ch). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de fluorescencia de esferoides MCF-7/HUVEC que muestran la distribución celular y la viabilidad. Los paneles A y B representan esferoides representativos con HUVEC teñidos con un tinte azul y células MCF-7 teñidas con un tinte verde. La localización de HUVEC y MCF-7 dentro del esferoide varía inmediatamente después de la siembra (A) y después de la formación de esferoides (B) (barra de escala = 250 μm). Los paneles C-D muestran esferoides teñidos con Calceína/Homodímero de Etidio para identificar células vivas (verdes) y muertas (rojas) en las estructuras 3D en condiciones normales de cultivo(C)y después de la congelación(D)(Barra de escala = 100 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Representación esquemática de la colección de esferoides para el análisis bioquímico. Caricatura que muestra el esquema para cosechar esferoides, separar o liberar células y suspenderlas en solución de lisis para análisis de proteínas o extracción de ARN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En comparación con los cultivos celulares 2D, la revolucionaria tecnología de cultivo de esferoides 3D es una herramienta mejor y más poderosa para reconstruir el microambiente de un órgano, las interacciones célula-célula y las respuestas a los medicamentos in vitro. Este es el primer protocolo que describe la formación de esferoides a partir de líneas celulares multicelulares (epiteliales y endoteliales) para la investigación del cáncer de mama. Este protocolo garantiza el crecimiento esferoidal en 3D de los esferoides durante un máximo de 5 días, y los esferoides se pueden examinar después de la incrustación de parafina, el seccionamiento y la tinción histológica. Curiosamente, los elementos celulares dentro del esferoide todavía expresan receptores que promueven el crecimiento celular y responden a estímulos proliferativos y apoptóticos. El protocolo descrito genera suficiente material biológico para el análisis de proteínas o ARN/ADN. El sistema de cocultivo anterior, fácilmente logrado en condiciones de laboratorio y a bajo costo, podría ser una ventaja para futuras aplicaciones, especialmente en la terapia del cáncer de mama y para las pruebas de sensibilidad a los medicamentos. Además, este protocolo se puede aplicar a diferentes tipos de células epiteliales y endoteliales.
Es extremadamente difícil imitar in vitro un tejido complejo que existe in vivo. Esto se debe a que los tejidos in vivo consisten en muchos componentes que interactúan, incluidos los nervios, los vasos sanguíneos, el mesénquima y las células inmunes30,42. El objetivo de este protocolo es superar algunas de estas limitaciones mediante el uso de un sistema de cocultivo 3D con dos tipos de células diferentes para abordar el estado real del tumor. Aquí, los esferoides se han formado con células tumorales epiteliales en combinación con células endoteliales o células linfáticas para imitar la situación in vivo tanto como sea posible, incluidas las interacciones célula-célula, la susceptibilidad a los factores apoptóticos liberados en los espacios intercelulares por las células moribundas y las condiciones hipóxicas en el centro de los esferoides. Este protocolo ha sido optimizado para probar las respuestas celulares a los factores de crecimiento, factores de señalización y hormonas, que activan rápidamente las cascadas de señalización y se dirigen a la transcripción de genes y estimulan la expresión y el transporte de proteínas30,31. En los esferoides, pero no in vivo,las respuestas de las células tumorales a los estímulos se pueden evaluar rápida y frecuentemente.
En el presente estudio, las células endoteliales en los esferoides no parecen formar estructuras capilares. Dado que se ha demostrado que las células endoteliales forman capilares cuando se chapan a baja densidad y monocapas a alta densidad, es factible que la reducción de la proporción de MCF-7 a células endoteliales pueda resultar en la formación capilar dentro de los esferoides. Alternativamente, la adición de proteínas específicas de la matriz o matrigel puede promover la formación capilar. La falta de estructura capilar en el esferoide no diluye la ventaja de MCF-7 más células endoteliales frente a células MCF-7 per se, ya que los factores liberados por las células MCF-7 podrían promover la proliferación de células endoteliales y viceversa; tales interacciones permanecerían sin ser detectadas en los esferoides MCF-7 solamente.
Varios estudios han demostrado que 5 x 103 células/pozo era la concentración adecuada para sembrar células para formar esferoides43,44,45,46,47; sin embargo, en placas de fondo en U de 96 pocillos, este número de células limitó el crecimiento coordinado de esferoides en condiciones experimentales. Por lo tanto, en cada nuevo estudio, para cada nuevo tipo de célula, es importante monitorear el crecimiento del sistema 3D después del tratamiento farmacológico, para determinar los efectos del tratamiento sobre el tamaño de los esferoides.
La limitación del protocolo actual es que el cultivo de esferoides previamente formados no puede continuarse después de la congelación y descongelación por el método clásico DMSO. De hecho, cuando se descongelaron, la mayoría de las células estaban muertas. La vitrificación puede resultar ser una alternativa a mantener vivas las células48.
Es necesaria una cuidadosa atención a los detalles técnicos para evitar errores y producir y mantener esferoides bien formados. Uno de los desafíos es la preparación de la muestra para la inmunotinción (sección 4.1). Para facilitar la transferencia mediante el pipeteo de los esferoides en el tubo de 1,5 ml, es importante utilizar un corte de punta P200 con tijeras de modo que el área del orificio sea más grande que los propios esferoides. De lo contrario, la transferencia podría destruir las esferas. Otro desafío es cómo aspirar el medio después de que los esferoides se hayan asentado en el fondo de un tubo de ensayo. En este sentido, es mejor utilizar una pipeta P1000 en lugar de una bomba de vacío para evitar la aspiración de esferoides. Un paso importante y delicado en la preparación de los esferoides para la seccionamiento es agregar la agarosa a los esferoides granulados. Los esferoides, una vez suspendidos en agarosa, deben ser peletizados rápidamente al fondo del tubo de microfuge mediante centrifugación horizontal a temperatura ambiente y antes de que la agarosa polimerize.
En general, el esferoide de dos células hecho de MCF-7 y células endoteliales proporciona una alternativa viable para investigar las interacciones célula-célula y los mecanismos que impulsan el crecimiento de células cancerosas o células endoteliales dentro de un tumor. Los esferoides podrían servir como modelo para evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos dirigidos al crecimiento tumoral o canceroso. Es importante destacar que este modelo de dos células podría improvisarse aún más para incluir otros tipos de células relevantes en el crecimiento tumoral. En este contexto, se pueden incluir fibroblastos que constituyen el 80% de la masa tumoral de mama para formar un MCF-7, células endoteliales y esferoide fibroblastos. Además, el silenciamiento génico y las células genéticamente modificadas podrían usarse para abordar el papel de la interacción célula-célula, los receptores hormonales (estrógeno / progesterona), los factores de crecimiento y las vías de señalización en el crecimiento del tumor / cáncer, así como para probar la eficacia de nuevas moléculas anticancerígenas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la subvención KFS-4125-02-2017 de la Fundación para la Investigación del Cáncer / Liga Suiza del Cáncer y la subvención DK079307 del Instituto Nacional de Salud a EKJ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm × 20 mm tissue-culture treated culture dishes | Corning | CLS430167 | |
| 149MULTI0C1 | |||
| 35 x 10 mm Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile | Falcon | 357543 | |
| Adobe Photoshop | Version: 13.0.1 (64-bit) | ||
| Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Calcein-AM | Sigma-Aldrich | 17783 | |
| CD31 (cluster of differentiation 31) | Cell Marque | 131M-95 | monoclonal mouse ab clone JC70 |
| CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | Invitrogen | C7025 | |
| CK8/18 (cytokeratins 8 and 18) | DBS | Mob189-05 | monoclonal mouse ab, clone 5D3 |
| CKX41 Inverted Microscope | Olympus Life Science | Olympus DP27 digital camera | |
| Cleaved Caspase 3 | Cell Signaling | 9661L | polyclonal rabbit ab |
| Collagen (rat tail) | Roche | 11 179 179 001 | |
| Coulter ISOTON II Diluent | Beckman Coulter | 844 80 11 | Diluent II |
| Coulter Z1, Cell Counter | Coulter Electronics, Luton, UK | ||
| Dehydrated Culture Media: Noble Agar | BD Difco | BD 214220 | |
| Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo) | Lonza | CC-2516 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D6434 | |
| EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2 | Lonza | 190860 | |
| Ethidium homodimer | Sigma-Aldrich | 46043 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | SH30070 | |
| Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf) | Thermo Fisher Scientific | SH3006803 | |
| Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA | Leica Microsystems | ||
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050038 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175053 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| HUVEC – Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| ImageJ | National Institute of Health, USA | Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit) |
|
| Ki67 | Cell Marque | 275R-16 | monoclonal rabbit ab, clone SP6 |
| Leica fully motorized fluorescence stereo microscope | Leica Microsystems | M205 FA | |
| Leica Histocore Multicut Rotary Microtome | 149MULTI0C1 | ||
| Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Gibco | S003K | |
| MCF-7 cells – human breast adenocarcinoma cell line | Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich | Provived from Dr Andrè Fedier obtained from ATCC | |
| Nunclon Sphera 96U-well plate | Thermo Fisher Scientific | 174925 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010015 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protein Lysis Buffer | Cell Signaling, Danvers, USA | 9803 | |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | |
| RNA Lysis Buffer | Zymo Research | R1060-1-100 | Contents in Quick-RNA Miniprep Kit |
| Rotina 46R Centrifuge | Hettich | ||
| Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352003 | |
| Sonicator | Bandelin electronics, Berlin, DE | ||
| Tecan Infinite series M200 microplate reader | Tecan, Salzburg, AU | ||
| Tissue Culture Flasks 75 | TPP | 90076 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924 |
References
- Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary Pathology. 49 (3), 423-439 (2012).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Developmental Cell. 18 (1), 8-23 (2010).
- Goodman, T. T., Ng, C. P., Pun, S. H. 3-D tissue culture systems for the evaluation and optimization of nanoparticle-based drug carriers. Bioconjugate Chemistry. 19 (10), 1951-1959 (2008).
- Yang, L., et al. Tumor organoids: From inception to future in cancer research. Cancer Letters. 454, 120-133 (2019).
- Velasco-Velázquez, M. A., Popov, V. M., Lisanti, M. P., Pestell, R. G. The role of breast cancer stem cells in metastasis and therapeutic implications. The American Journal of Pathology. 179 (1), 2-11 (2011).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncology Reports. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285 (2017).
- Sakalem, M. E., De Sibio, M. T., da Costa, F., de Oliveira, M. Historical evolution of spheroids and organoids, and possibilities of use in life sciences and medicine. Biotechnology Journal. 16 (5), (2021).
- Zanoni, M., et al. Modeling neoplastic disease with spheroids and organoids. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 97 (2020).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. W.
- Ding, Y., et al. Three-dimensional tissue culture model of human breast cancer for the evaluation of multidrug resistance. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (9), 1959-1971 (2018).
- Little, M. H.
- Rimann, M., Graf-Hausner, U. Synthetic 3D multicellular systems for drug development. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 803-809 (2012).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Fong, E. L., et al. Modeling Ewing sarcoma tumors in vitro with 3D scaffolds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (16), 6500-6505 (2013).
- Hauptmann, S., et al. Integrin expression on colorectal tumor cells growing as monolayers, as multicellular tumor spheroids, or in nude mice. International Journal of Cancer. 61 (6), 819-825 (1995).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 920-926 (2018).
- Ashok, A., Choudhury, D., Fang, Y., Hunziker, W.
- Lehmann, R., et al. Human organoids: a new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Verjans, E. T., Doijen, J., Luyten, W., Landuyt, B., Schoofs, L. Three-dimensional cell culture models for anticancer drug screening: Worth the effort. Journal of Cellular Physiology. 233 (4), 2993-3003 (2018).
- Bombonati, A., Sgroi, D. C. The molecular pathology of breast cancer progression. The Journal of Pathology. 223 (2), 307-317 (2011).
- DeSantis, C., Ma, J., Bryan, L., Jemal, A.
- Solanki, M., Visscher, D. Pathology of breast cancer in the last half century. Human Pathology. 95, 137-148 (2020).
- Djomehri, S. I., Burman, B., Gonzalez, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2019).
- Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
- Yu, J., Huang, W. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 295-304 (2020).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. The Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2720 (2011).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Türker, E., Demirçak, N., Arslan-Yildiz, A. Scaffold-free three-dimensional cell culturing using magnetic levitation. Biomaterials Science. 6 (7), 1745-1753 (2018).
- Froehlich, K., et al. Generation of multicellular breast cancer tumor spheroids: comparison of different protocols. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 21 (3-4), 89-98 (2016).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: Current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), Dayton, Ohio. 1329-1340 (2018).
- Marconi, A., Quadri, M., Saltari, A., Pincelli, C.
- Saltari, A., et al. CD271 down-regulation promotes melanoma progression and invasion in three-dimensional models and in zebrafish. The Journal of Investigative Dermatology. 136 (10), 2049-2058 (2016).
- Yamauchi, M., et al. A novel in vitro survival assay of small intestinal stem cells after exposure to ionizing radiation. Journal of Radiation Research. 55 (2), 381-390 (2014).
- Jabs, J., et al. Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations. Molecular Systems Biology. 13 (11), 955 (2017).
- Arruabarrena-Aristorena, A., et al. FOXA1 mutations reveal distinct chromatin profiles and influence therapeutic response in breast cancer. Cancer Cell. 38 (4), 534-550 (2020).
- Carey, S. P., Starchenko, A., McGregor, A. L., Reinhart-King, C. A. Leading malignant cells initiate collective epithelial cell invasion in a three-dimensional heterotypic tumor spheroid model. Clinical & Experimental Metastasis. 30 (5), 615-630 (2013).
- Park, S., et al. Differential functions of splicing factors in mammary transformation and breast cancer metastasis. Cell Reports. 29 (9), 2672-2688 (2019).
- Truong, D. D., et al. A human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 79 (12), 3139-3151 (2019).
- Zhang, J., et al. Energetic regulation of coordinated leader-follower dynamics during collective invasion of breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (16), 7867-7872 (2019).
- Jeong, Y. H., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45 (2020).
