Un metodo di inoculazione efficace per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero

Il pepe nero (Piper nigrum L.) è un rampicante legnoso e una delle più importanti colture di spezie. È conosciuto come il "Re delle spezie"¹ ed è coltivato in oltre 40 paesi e regioni in Asia, Africa e America Latina. Il marciume radicale di Phytophthora è la malattia più devastante del pepe nero ed è causata dall'oomicete Phytophthora capsici. Questo agente patogeno infetta anche cucurbitacee, melanzane, peperoncini e pomodori ^2,3. Con il pepe nero, un intero raccolto a volte può essere decimato da questa malattia. L'espansione delle aree di piantagione di pepe è limitata a causa dell'indisponibilità di varietà resistenti, che ha ostacolato in modo significativo lo sviluppo dell'industria cinese del pepe nero. Un'inoculazione efficace e un preciso sistema di campionamento per Phytophthora capsici sulle piante di pepe nero sono essenziali per studiare questa interazione pianta-patogeno.

L'identificazione e lo screening della resistenza nelle risorse del germoplasma è il requisito fondamentale per la ricerca della patogenicità dell'agente patogeno e l'allevamento e l'utilizzo di varietà resistenti. Un approccio ampiamente utilizzato consiste nell'utilizzare una varietà di metodi di identificazione basati su specie vegetali e gruppi patogeni. Gli attuali metodi di identificazione includono l'identificazione della popolazione, l'identificazione individuale, l'identificazione degli organi, l'identificazione dei tessuti, l'identificazione cellulare, l'identificazione biochimica e l'identificazione molecolare, che sono stati sviluppati negli ultimi anni ^4,5. C'è stato successo in questi settori, ma ci sono anche molti problemi. Indipendentemente dal metodo scelto, i requisiti di base per l'identificazione della resistenza delle piante sono coerenti, inclusi obiettivi chiari, risultati affidabili e metodi semplici, rapidi e facili da standardizzare. Questo principio deve essere seguito anche nell'identificazione della resistenza al pepe nero.

In condizioni di campo naturale, l'identificazione della resistenza alle malattie può essere influenzata da molti fattori ambientali. Pertanto, è stato proposto di utilizzare in laboratorio foglie staccate e radici irrigate per identificare la resistenza alle malattie. Le foglie giovani di piante sane sono state inoculate in vitro in laboratorio e l'area delle foglie malate è stata misurata inoculando l'agente patogeno al fine di identificare la resistenza alle malattie delle piante⁶. Tuttavia, l'inoculazione fogliare in vitro può essere utilizzata solo per l'identificazione generale della resistenza e non per studi di interazione molecolare. Nonostante ciò, lo stato di resistenza alle malattie si presenta spesso nell'inoculazione della radice irrigata, causando incertezza nello studio di follow-up dell'allevamento molecolare per la resistenza alle malattie. Pertanto, i metodi di rilevamento interni rapidi e semplici sono essenziali. Questo studio mira a fornire un metodo per l'identificazione della resistenza in laboratorio.

1. Preparazione di piante da taglio del pepe nero per l'infezione

1. Prendi un taglio a cinque nodi, lungo circa 40 cm con un diametro di 0,5 cm, da un ramo ortotropico sano e vigorosamente crescente di pepe nero usando un coltello da potatura disinfettato o secateurs. Potare i tre nodi inferiori dei rami plagiotropici, con i due nodi superiori rimasti con circa 10 foglie intatte.
2. Preparare il substrato di radicazione contenente terreno e letame animale (sterco di mucca o sterco di pecora) con un rapporto di 1:1. Autoclave del substrato di radicazione a 121 °C per 20 min.
3. Inserire le talee nel substrato di radicazione con un angolo di circa 50°, con il terzo nodo che tocca solo la superficie del substrato e la gemma ascellare su questo nodo sopra il substrato.
   NOTA: La borsa qui utilizzata ha le seguenti dimensioni: altezza di 40-60 cm, diametro di 25-30 cm.
4. Versare 10-20 L di acqua sulle radici della pianta. Posizionare le talee in una serra con ombra al 90% a una temperatura di 25-30 ° C per il radicamento e la crescita.

2. Propagazione di Phytophthora capsici (P. capsici)

NOTA: Una scorta di coltura di Phytophthora capsici è mantenuta nel laboratorio di protezione delle piante del Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences⁷.

1. Spennellare e pulire i tuberi di patata sotto l'acqua corrente del rubinetto e quindi tagliare 200 g di patate a cubetti di 1 cm³. Mettere alcuni dei cubetti in un becher contenente 800 ml di acqua a doppio distillato (ddH₂O) e far bollire per 20 minuti.
2. Filtrare il brodo attraverso una doppia garza utilizzando la filtrazione a gravità. Preparare l'agar destrosio di patate (PDA) aggiungendo 20 g di destrosio e 15 g di agar al filtrato e completando il volume fino a 1 L con ddH₂O. Autoclave la miscela a 121 °C per 20 min⁸.
3. Versare 20 ml di PDA sterilizzato in forma liquida in una capsula di Petri rotonda di 9 cm di diametro all'interno di una cappa laminare a flusso d'aria. Lasciare le piastre PDA con i coperchi aperti all'interno della cappa a flusso d'aria laminare durante la notte come mezzo per prevenire la condensa.
4. Utilizzare un ciclo di inoculazione per raccogliere i miceli dal brodo di Phytophthora capsici all'interno di una provetta. Posizionare l'inoculo con il lato miceliale a contatto con il PDA in una capsula di Petri.

3. Infezione del pepe nero

1. Incubazione
   1. Identificare un'area a 5 cm sopra la superficie del substrato e vicino alle radici sul gambo per l'inoculazione.
   2. Estrarre un disco di micelio di 0,5 cm di diametro sul bordo crescente della coltura di Phytophthora capsici su PDA in una capsula di Petri utilizzando una piralide di stopper.
   3. Danneggiare lo stelo con un ago per siringa e praticare tre fori in un modello triangolare nell'area di inoculazione selezionata. Coprire ogni foro con un disco miceliale. Posizionare i fori l'uno vicino all'altro per garantire che l'area ferita sia completamente coperta con i dischi miceliali.
   4. Coprire i dischi miceliali con tamponi di cotone inumiditi sterilizzati come mezzo per prevenire l'essiccazione. Legare il tampone sullo stelo con una striscia di polietilene per mantenere la posizione dei dischi inoculanti.
      NOTA: A 8 ore dall'inoculazione, i fori inoculati sono diventati neri e la lesione si è estesa con il passare del tempo. Le foglie sono diventate gialle e sono cadute, e la pianta inoculata è morta 7-10 giorni dopo l'inoculazione. Nessuna lesione sviluppata negli impianti di controllo. La maggior parte dei geni si è espressa in modo diverso dopo l'inoculazione con Phytophthora capsici rispetto al gruppo di controllo. L'analisi istopatologica dei tessuti infetti ha dimostrato che Phytophthora capsici ha colonizzato nello xilema.
2. Campionare i materiali vegetali di interesse e conservarli a -80 °C in azoto liquido per l'uso in studi successivi.
   NOTA: azoto liquido, sacchetti di plastica, pennarelli, cesoie e altri materiali sono stati preparati prima degli esperimenti.
3. Dopo che i materiali vegetali specifici sono stati campionati per l'uso, autoclave tutti i materiali vegetali rimanenti, la coltura e il terreno di coltura di Phytophthora capsici rimanenti e tutti gli strumenti e gli articoli da laboratorio utilizzati in questo lavoro di inoculazione.

La Figura 1 mostra i sintomi delle foglie di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici . La Figura 2 mostra i sintomi degli steli di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici . L'agente patogeno ha infettato il pepe nero sul gambo basale; sintomi tra cui ingiallimento delle foglie, avvizzimento che appare, imbrunimento dello xilema e oscuramento dei vasi che appaiono gradualmente. La Figura 3 mostra la maggior parte dei geni espressi in modo diverso dopo l'inoculazione con Phytophthora capsici rispetto al gruppo di controllo. La Figura 4 ha dimostrato Phytophthora capsici colonizzata nello xilema mediante l'analisi istopatologica dei tessuti infetti.

Figura 1: I sintomi delle foglie di pepe nero a seguito dell'inoculazione di P. capsici 7. CK: gruppo di controllo; Inoculato: dopo inoculazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il sintomo dei gambi di pepe nero dopo l'inoculazione di P. capsici 7. Inoculato: dopo inoculazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Profili di espressione dettagliati dei geni nelle radici del pepe nero. Le barre di errore nelle figure denotano l'errore standard dei livelli di espressione da tre repliche biologiche. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 e 48 sull'asse x si riferiscono a 8, 12, 24 e 48 h sul controllo e 8, 12, 24 e 48 h, rispettivamente, dopo l'inoculazione con P. capsici. L'asse y rappresenta il livello di espressione relativo rispetto all'ubiquitina. Ogni colonna rappresenta il valore medio più SD (deviazione standard) da tre repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi istopatologica dei tessuti infetti. Il confronto tra la colorazione O blu toluidina da sola (colonna di sinistra) e la doppia colorazione blu cotone e safraninA O (colonna destra) (20X). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In this study, the basal head was pinpricked to damage and provide an effective inoculation system in the black pepper plant. Mycelial pellets then covered the three holes to retain moisture and enable the pathogen to infect the plant well. Following inoculation, the leaves turned yellow and dropped off and the inoculated plants died. No lesions developed in the control plants. Most genes expressed differently following inoculation with Phytophthora capsici in comparison to the control group. Fungal diseases are responsible for structural and physiological disorders in a significant number of crops, leading to decreased productivity and economic losses for their producers. Structural studies employing histological techniques on the mode of penetration and colonization of plant tissues by fungi provide a detailed indication of the interactions between the pathogen and the plant tissue. These studies have revealed important aspects to help understand the monocycle of diseases. Histopathological analysis of infected tissues demonstrated Phytophthora capsici colonized in the xylem. This method provides a better means for solving the instability that is caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. An effective inoculation and precise sampling system for Phytophthora capsici on black pepper plants are essential for studying this plant-pathogen interaction. It also provides a promising means for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.

At the same time, this protocol represents a more efficient way of providing reference for the incubation of woody vine. In previous studies, pathogens were inoculated by root dipping with spore suspensions cultured in V8 medium⁹. It takes 7 days for the spore suspension to be ready, whereas the use of PDA to culture Phytophthora capsici takes just 5 days. The PDA plate was sealed using permeable surgical tape as a means of avoiding contamination from other bacteria and fungi. The cultures were kept at room temperature. The method used in this study can save more time and be performed more rapidly. Black pepper is a woody vine with many sugars and phenols¹⁰, and the zoospores produced by Phytophthora capsici generally occur in soils, making it difficult to infect black pepper vines and cause infection instability in the root¹¹. This protocol provides better results, enabling a strong interaction between vine plants and soil-borne pathogens. The detection of the dynamic process between plants and pathogens is visible and convenient.

The irrigating root method is fast and time-saving, but a problem remains unsolved for black pepper. Phytophthora capsici is a soil-borne pathogen that generally infects plant roots via sporangia and zoospores¹². In nature, the sporangia is able to spread via rain and irrigation. Once the zoospores become attached to the plant surface, the germ tubes may quickly develop and penetrate the plant tissue, which results in infection^13,14. This can cause uncertainty that choosing hyphae as an infection source will be similar to the spore suspension. The method used in this study starts with pinpricking the basal head of the black pepper plant to damage it. The damaged area is then covered with Phytophthora capsici and moisture is retained, ensuring that the pathogen can infect the plant well. This method is better at solving the instability caused by traditional inoculation methods including soil drench or root dipping. It is also a promising method for studying the mode of action between plants and other soil-borne plant pathogens in agricultural precision breeding.