Summary
Vi presenterar en metod som använder en generaliserbar områdesbaserad bildanalysmetod för att identifiera cellantal. Analys av olika cellpopulationer utnyttjade de signifikanta cellhöjds- och strukturskillnaderna mellan distinkta celltyper inom en adaptiv algoritm.
Abstract
Kvantifiering av celler är nödvändig för ett brett spektrum av biologiska och biokemiska studier. Konventionell bildanalys av celler använder vanligtvis antingen fluorescensdetekteringsmetoder, såsom immunofluorescerande färgning eller transfektion med fluorescerande proteiner eller kantdetekteringstekniker, som ofta är felbenägna på grund av brus och andra icke-idealiteter i bildbakgrunden.
Vi designade en ny algoritm som exakt kunde räkna och skilja makrofager och fibroblaster, celler av olika fenotyper som ofta samlokaliseras under vävnadsregenerering. MATLAB användes för att implementera algoritmen, som differentierade distinkta celltyper baserat på höjdskillnader från bakgrunden. En primär algoritm utvecklades med hjälp av en arealbaserad metod för att ta hänsyn till variationer i cellstorlek/struktur och såddförhållanden med hög densitet.
Icke-idealiteter i cellstrukturer redovisades med en sekundär, iterativ algoritm som använde interna parametrar såsom celltäckning beräknad med hjälp av experimentella data för en given celltyp. Slutligen genomfördes en analys av samodlingsmiljöer med hjälp av en isoleringsalgoritm där olika celltyper selektivt uteslöts baserat på utvärderingen av relativa höjdskillnader i bilden. Detta tillvägagångssätt visade sig exakt räkna celler inom en 5% felmarginal för monokulturerade celler och inom en 10% felmarginal för samodlingade celler.
Introduction
Programvara implementeras rutinmässigt under bildanalystekniker för att säkerställa att resultaten är korrekta, effektiva och opartiska. För cellbaserade analyser är ett vanligt problem felidentifiering av celler. Bilder med felaktiga fokal- och kontrastinställningar kan leda till celloskärpa, där gränsen för enskilda celler blir svår att identifiera1. Förekomsten av främmande bildfunktioner som porer, bubblor eller andra oönskade föremål kan hindra räkningsprocedurer genom att sakta ner räkningsprocessen och leda till felidentifiering. Dessutom kan cellräkning vara betungande, och att räkna hundratals replikat kan vara extremt tidskrävande. Dessutom finns en inneboende subjektiv bias under manuell räkning, och därför är beslutsfattandet om cellidentifiering ofta felaktigt2. Automatiserad programvara erbjuder spännande potential att kringgå alla dessa problem genom att snabbt och exakt skilja celler från främmande objekt, inklusive objekt långt bortom mänsklig kapacitet för exakt upptäckt, baserat på väldefinierade identifieringskriterier som minskar påverkan av utredarens partiskhet. Vanliga tekniker för att identifiera celler med hjälp av automatiserad programvara involverar två huvudmetoder: segmentering och tröskel3. Här visar vi ett generaliserbart områdesbaserat protokoll som möjliggör snabb, exakt och billig cellräkning inom ett allmänt tillgängligt programvaruramverk.
Segmenteringstekniker, såsom kantdetektering, försöker isolera enskilda celler genom att använda intensitetsskillnader i en bild. Intensitetsförändringar som skiljer en cell från resten av bilden består oftast av skarpa förändringar i ljusstyrka4. Kantdetektering innebär ett regulariserande filtreringssteg, följt av ett differentieringssteg där intensitetsförändringar detekteras. Differentieringsprocessen identifierar kanter och konturer inom bilden av högintensiva förändringar, och dessa kanter och konturer är korrelerade med cellnärvaro. Även om bilder med brus kan köras genom denoisingalgoritmer4, används kantdetekteringstekniker idealiskt för att analysera bilder med lågt bakgrundsbrus. Processen fungerar optimalt när cellgränserna är tydligt och lätta att urskilja och inte hindras av ljusstyrkekonturer som inte är relaterade till cellnärvaro, celloskärpa, främmande objekt eller definierade interna cellstrukturer 1,2. Om en bild är särskilt bullrig kan celler särskiljas ytterligare genom fluorescerande färgning eller transfektion med fluorescerande proteiner 2,5. Även om detta avsevärt förbättrar noggrannheten i segmenteringstekniker, kräver det extra kostnader och ytterligare tidsinvesteringar för att förbereda cellkulturer för avbildning.
Tröskeltekniker innebär uppdelning av en bild i två kategorier: förgrunden och bakgrunden, med celler tilldelade förgrunden3. Dessa tekniker använder färg- / kontrastförändringar för att definiera den uppenbara höjden på ett objekt; objekt som rutinmässigt är "högre" än bakgrunden kan lätt identifieras som celler. Vattendelaren-transformering fungerar på detta sätt genom att associera ytor med ljusa pixlar som förgrund och de med mörka pixlar som bakgrund 6,7. Genom höjdbaserad identifiering kan tröskeltekniker rutinmässigt skilja brus från önskade objekt, förutsatt att de finns inom samma fokalplan. När den paras ihop med en områdesbaserad kvantifiering kan en vattendelare-transform exakt identifiera grupper av objekt i miljöer där typiska segmenteringstekniker som kantdetektering skulle vara felaktiga.
Watershed-transforms kombineras vanligtvis med segmenteringstekniker för att förbereda bilder för en renare analys, vilket resulterar i högre noggrannhet i cellräkningen. För denna process används vattendomstransformationen för att markera potentiella regioner av intresse före segmentering. En vattendelare-transform ger unika fördelar genom att identifiera celler i förgrunden av bilder, vilket kan förbättra noggrannheten i segmenteringsanalysen genom att ta bort potentiella falska positiva för celler, såsom ojämna fläckar av bakgrund. Svårigheter kan dock uppstå när man försöker anpassa cellbaserade bilder till en vattendelare-transform. Bilder med hög celldensitet kan plågas av undersegmentering, där aggregat av celler identifieras som en singulär grupp snarare än som enskilda komponenter. Förekomsten av brus eller skarpa intensitetsförändringar kan också resultera i översegmentering, där algoritmen överisolerar celler, vilket resulterar i överdrivna och felaktiga cellantal8.
Här beskriver vi en metod för att minimera de primära nackdelarna med vattendomstransformationen genom att införliva komponenter i en tröskelanalys inom en områdesbaserad kvantifieringsalgoritm, som visas i figur 1. I synnerhet implementerades denna algoritm med öppen källkod och / eller allmänt tillgänglig programvara, och tillämpningen av detta cellräkningsramverk var möjlig utan dyra reagenser eller komplexa cellberedningstekniker. RAW264.7 makrofager användes för att demonstrera metoden på grund av deras kritiska roll för att reglera bindvävsunderhåll och sårläkningsprocesser9. Dessutom analyserades NIH / 3T3 fibroblaster på grund av deras nyckelroll i vävnadsunderhåll och reparation. Fibroblastceller samexisterar ofta med och stöder makrofager, vilket genererar behovet av att skilja dessa fenotypiskt distinkta celltyper i samodlingsstudier.
Cellantal från bilder med hög viabla celldensitet (VCD) kan kvantifieras på ett tillförlitligt och effektivt sätt genom att beräkna det område som täcks av cellerna och det genomsnittliga området som upptas av en singulär cell. Användningen av tröskel i motsats till segmentering för cellidentifiering möjliggjorde också mer komplexa analyser, såsom experiment där olika celltyper i kokulturer analyserades samtidigt. NIH / 3T3-fibroblaster, som ofta visar sig samlokalisera med RAW264.7-makrofager inom ett sårläkningsställe, befanns växa vid ett fokalplan som skilde sig från fokalplanet för makrofager10. Följaktligen kördes flera tröskelalgoritmer för att definiera bakgrunden och förgrunden beroende på vilken celltyp som analyserades, vilket möjliggjorde exakt räkning av två olika celltyper inom samma bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellodling och bildförvärv
- Odling RAW264,7 makrofager vid 37 °C och 5 % CO2 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % penicillinstreptomycin, 1,5 g/l natriumbikarbonat och 5 μM β-merkaptoetanol.
- För monokulturavbildning, odla RAW264.7-celler med en densitet av 25 000 celler / cm2 i en 5 ml cellodlingskolv med 1 ml medium.
- Odling NIH/3T3-celler vid 37 °C och 5 % CO2 i DMEM kompletterat med 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin11.
- För samodlingsavbildning, odla RAW264.7 makrofager och NIH / 3T3 fibroblaster tillsammans i olika förhållanden, med en total densitet av 25 000 celler / cm2. Använd coculture medium som är 1 del RAW264.7 medium (DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1.5 g / L natriumbikarbonat och 5 μM β-merkaptoetanol) och 1 del NIH / 3T3 medium (DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin).
- Efter sådd inkubera celler vid 37 °C och 5 % CO2 för att nå en livskraftig celldensitet på 80 % cellkonfluens.
- Bildceller med ett inverterat mikroskop utrustat med ett 40x mål. Hämta alla bilder i gråskala och exportera dem i den råa ".czi"-filen.
- Bestäm algoritmens kapacitet att exakt utvärdera bilder med en rad bildkvaliteter. Skaffa bilder med varierande fokus, vilket ger både "icke-bulbous" bilder (figur 2) och "bulbous" bilder (figur 3).
- Exportera och konvertera cellbilder till 8-bitars tiff(.tiff) bildformat med ImageJ med funktionen "Batch Convert" på de råa ".czi"-filerna före MATLAB-analysen. Lagra konverterade bilder i en lokal mapp och överför dessa bildfiler manuellt till relevant MATLAB-fack.
2. Bildanalys-monokultur med hjälp av filen "monoculture.m" främst
OBS: Följande steg utfördes med MATLAB. Tre filer användes för MATLAB-protokollet: "process.m" (Kompletterande kodningsfil 1), filen som innehåller algoritmen, "monokultur.m" (Kompletterande kodningsfil 2), filen som ska köras för att analysera monokulturbilder och "coculture_modified.m" (Kompletterande kodningsfil 3), filen som ska köras för att analysera samkulturbilder.
- Använd den områdesbaserade metoden för att få bilder av celler som visar relativa höjdvariationer. Bildutdata för varje delsteg genom att använda funktionen "imshow()" för varje underbild. Kopiera och klistra in bildfilen för analys i papperskorgen och ange filnamnet i följande kommando. Tryck på kör för att starta programmet.
imread('filnamn.tiff')- Analysera bilder genom att "öppna genom rekonstruktion" följt av "stänga genom rekonstruktion" med hjälp av källfunktioner8 för att förstora förgrunden från bakgrunden. Använd det första kommandot för att öppna genom rekonstruktion och den andra och tredje sekvensen för att stänga med rekonstruktion
"imopen()"
"imerode()"
"imrekonstruera()"
- Analysera bilder genom att "öppna genom rekonstruktion" följt av "stänga genom rekonstruktion" med hjälp av källfunktioner8 för att förstora förgrunden från bakgrunden. Använd det första kommandot för att öppna genom rekonstruktion och den andra och tredje sekvensen för att stänga med rekonstruktion
- Binarisera de rekonstruerade bilderna till rena svartvita pixlar med hjälp av ett percentilbaserat identifieringssystem. Observera att celler konverteras till ett rent vitt pixelvärde på "255" i detta system, medan bakgrundsobjekt och främmande (icke-cellulära) objekt konverteras till ett rent svart pixelvärde på "0".
- Skilj celler från bakgrunden genom att använda en percentilskillnad från den "maximala relevanta pixeln", det största pixelvärdet som omfattar minst 0,5 % av en viss bild.
- Analysera och utvärdera pixelvärdena för RAW264.7-makrofager. Om dessa värden ligger inom 4,5 % av den maximala relevanta pixeln markerar du pixeln som mobil.
OBS: Detta kommando kan utfärdas med ett enkelt if-uttalande. - För bilder som innehåller bulbous cellprofiler, såsom de som ses i figur 2, implementera ett iterativt förfarande för att korrigera för felaktig binarisering vid cellernas centrum (benämnt "öar", se nedan), enligt följande.
- Bestäm en första gissning för den totala celltäckningen; 60% användes för denna studie. Observera att antalet celler som finns i bilden bör vara beroende av celltäckningen - förhållandet mellan cellnummer och celltäckning kan därför bestämmas experimentellt. Använd detta förhållande, bestäm variablerna 'Alpha'och'kappa.'
OBS: "Alfa" representerar en 3 x 1 vektor som innehåller följande relativa höjdprocentiler: höjdprotencilen vid vilken celler identifierades, höjdprotencilen vid vilken bakgrunden identifierades och höjdprocentilen vid vilken öar-regioner där intensitetsvärdena var signifikant lägre än cellvärdena - vanligtvis bodde. "Kappa" representerar det totala området som täcks av celler i bilden. - Kör algoritmen, som (i) kommer att analysera bilder med hjälp av initiala uppskattningar av alfa och kappa för att fylla en del av öarna, och (ii) använda postanalysens cellantal och täckning för att räkna om kappa. Om kappa-värdet ligger inom 10% av den ursprungliga gissningen, fortsätt till nästa steg.
OBS: För bilder som innehåller RAW264.7- och NIH /3T3-celler befanns alfa vara [4.3, 5.5, 10]. Med andra ord bestämde en skillnad på 4,3% från den maximala relevanta pixeln höjdper percentilen vid vilken celler identifierades, en skillnad på 5,5% från den maximala relevanta pixeln bestämde höjdper percentilen vid vilken bakgrunden identifierades. En skillnad på 10 % från den maximala relevanta pixeln bestämde höjdper percentilen vid vilken öar vanligtvis bodde.
- Efter binarisering av bilden bestämmer du det genomsnittliga cellområdet automatiskt med hjälp av cirkelsökningsalgoritmen med öppen källkod, som utför en Hough-transformering på den binariserade bilden 12,13,14. Använd följande kommando för att få en vektor av alla mittplatser och radier av cirklar som finns i bilden.
"[centra, radier] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])"
'A' i detta kommando är den valda bilden, och [minradius, maxradius] är det radiområde som algoritmen kommer att försöka upptäcka.
OBS: Denna procedur för att bestämma det genomsnittliga cellområdet förutsätter att makrofagcellernas morfologi var både cirkulär och konsekvent bland celler10. Från experimentella data observeras makrofagernas radier oftast vara mellan 30 och 50 pixlar vid 40x förstoring. Detta pixelintervall definieras som det acceptabla intervallet för cirkelsökningsalgoritmen. Radierna kan vara signifikant olika för andra celltyper och skulle kräva bestämning med hjälp av experimentell analys.- Använd radieutgångarna för att beräkna den genomsnittliga cellarean genom medelvärde. Analysera minst 10 celler för att säkerställa korrekt områdesidentifiering.
- Bestäm det totala antalet celler i bilden med hjälp av det genomsnittliga cellområdet.
- Loop genom bildmatrisen och räkna det totala antalet cellpixlar. Bestäm den totala celltäckningen genom att dividera antalet cellpixlar med det totala antalet pixlar i bilden. Bestäm det totala antalet celler i bilden genom att dividera antalet cellpixlar med den genomsnittliga ytan på en cell.
3. Bildanalys-coculture med hjälp av filen "coculture_modified.m" främst
OBS: Följande steg utfördes med MATLAB.
- Använd den områdesbaserade metoden för att få bilder av celler som visar relativa höjdvariationer. Bildutdata för varje delsteg genom att använda funktionen "imshow()" för varje underbild. Kopiera och klistra in bildfilen för analys i papperskorgen och ange filnamnet i följande kommando. Tryck på kör för att starta programmet.
'imread('filnamn.tiff')'- Analysera bilder genom att "öppna genom rekonstruktion" följt av "stänga genom rekonstruktion" med hjälp av källfunktioner10 för att förstora förgrunden från bakgrunden. Använd det första kommandot för att öppna genom rekonstruktion och den andra och tredje sekvensen för att stänga med rekonstruktion.
"imopen ()"
"imerode()"
"imrekonstruera()"
- Analysera bilder genom att "öppna genom rekonstruktion" följt av "stänga genom rekonstruktion" med hjälp av källfunktioner10 för att förstora förgrunden från bakgrunden. Använd det första kommandot för att öppna genom rekonstruktion och den andra och tredje sekvensen för att stänga med rekonstruktion.
- Genomföra en analys av kokulturer innehållande RAW264.7- och NIH / 3T3-celler genom att använda två selektiva binariseringar, erhållna genom att utnyttja höjdskillnaderna mellan de två celltyperna.
- Experimentellt bestämma en parameter 'phi' med hjälp av bilder av RAW264.7 och NIH / 3T3-celler, med phi som representerar den proportionella höjdskillnaden mellan de två celltyperna. Gissa ett initialt phi-värde och iterera tills cellantal och täckning matchar nära manuella räkningar, specifika för RAW264.7 och NIH / 3T3-samkulturen.
OBS: Värdet för phi som användes i dessa studier visade sig vara 3,2. Phi används för att selektivt filtrera en bild så att den endast verkar innehålla RAW264.7-celler, vilket ses i figur 4C. - Bestäm RAW264.7-cellantal och total celltäckning på ett liknande sätt som för monokulturbilder.
- Experimentellt bestämma en parameter 'phi' med hjälp av bilder av RAW264.7 och NIH / 3T3-celler, med phi som representerar den proportionella höjdskillnaden mellan de två celltyperna. Gissa ett initialt phi-värde och iterera tills cellantal och täckning matchar nära manuella räkningar, specifika för RAW264.7 och NIH / 3T3-samkulturen.
- Analysera den vattendelartransformerade bilden igen utan phi-parametern och detektera både makrofager och fibroblaster. Förvärva NIH/3T3-fibroblastdata genom att selektivt subtrahera RAW264.7-cellpixlar, erhållna med hjälp av standardtröskel- och arealbaserade kvantifieringsmetoder som beskrivs i steg 2.
- När hela bilden har analyserats bestämmer du det totala antalet NIH/3T3-pixlar genom att subtrahera det totala antalet cellpixlar från antalet RAW264,7-pixlar. Beräkna täckningen av NIH/3T3- och RAW264.7-celler genom att dividera med antalet cellpixlar för varje cellinje med det totala antalet bildpixlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analys av icke-bulbösa RAW264.7-makrofager utfördes i monokulturmiljö vid 25 000 celler/cm2. Representativa bilder togs av cellkulturen och bearbetades i MATLAB efter konvertering till 8-bitars tiff i ImageJ. Algoritmutdata under hela processen registrerades och dokumenterades i figur 2 för den representativa bilden. I den här bilden räknade algoritmen 226 celler, och detta bildantal verifierades genom jämförelse med ett manuellt antal som identifierade 241 celler (6,2% fel). Algoritmutdata för minst 10 bilder av RAW264.7-cellantal hade ett genomsnittligt fel på 4.5 ± 1.9%.
Analys av bulbous RAW264.7 makrofager utfördes med hjälp av en iterativ algoritm. I de flesta bilder var den observerade bulbous effekten främst ett resultat av fokusering vid ett fokalplan som var något ovanför fokalplanet för substratet som cellerna var vidhäftande till. Följaktligen förvärvades de flesta bilder i icke-bulbous form, för vilken analys var signifikant lättare. Algoritmen som är nödvändig för att analysera bulbous bilder utvecklades för scenarier där suboptimal var omöjlig att undvika på grund av meniskeffekter eller annan optisk störning. Typiska algoritmutgångar under hela processen registrerades och dokumenterades i figur 3. I denna representativa bildanalys räknade algoritmen 221 celler i bilden, vilket verifierades med ett manuellt antal på 252 celler (12,3% fel).
Analys av kokulturer innehållande både RAW264.7 makrofager och NIH / 3T3 fibroblaster genomfördes för att bestämma förmågan att skilja mellan två distinkta celltyper inom en enda bild. På grund av de mycket varierande cellmorfologierna hos NIH / 3T3-fibroblaster kunde manuella / automatiska cellantal inte erhållas exakt, och celltäckningar för fibroblaster jämfördes istället kvalitativt med originalbilden. Representativa algoritmutgångar under hela processen registrerades och dokumenterades i figur 4. För den här bilden var antalet RAW264.7 makrofager 137, och detta antal verifierades med ett manuellt antal på 155 (11,6% fel). Algoritmutdata för minst 10 RAW264.7 makrofagantal hade i genomsnitt 7.8 ± 3.9% fel.
Robustheten hos cellräkningsalgoritmen verifierades också med hjälp av en blind studie för att jämföra automatisk cellidentifiering med manuella användarantal. Fem bilder valdes slumpmässigt, med varierande celldensiteter, och dessa bilder räknades blint av tre olika användare. De manuella räkningarna jämfördes med varandra och med resultaten från den automatiska cellräkningsalgoritmen. Jämförelsen av manuella och automatiserade räkneresultat visas i tabell 1. Dessutom testades segmenteringsnoggrannheten för denna metod genom att använda "ground truth" -bilder härledda med konventionella segmenteringstekniker. DICE-koefficienten 20,21 användes som ett prestandamått med en genomsnittlig parameter på 0,85 över fem bilder. Ett exempel på överlägg kan ses i figur 5.
Figur 1: Generaliserad områdesbaserad algoritm. En process där en bild förbereds för segmenteringsanalys genom vattendelartransformationerna för att bestämma regionala maxima och minima10. Denna föreslagna metod modifierar processen (originalprocessen i svart) genom att hoppa över bestämningen av vattendomens åslinje och efterföljande steg för att anta ett percentilbaserat system i kombination med en områdesbaserad kvantifieringsprocess (markerad med rött). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: RAW 264.7 icke-bulbous algoritmutgång. Figuren visar de mellanliggande bildbehandlingsstegen som leder till kvantifiering av icke-bulbous RAW264.7 makrofagantal. (A) Inledande bearbetning av Bild till gråskala i BildJ. Den ursprungliga bilden konverterades till 8-bitars tiff och gråskala i ImageJ. (B) Efterbehandling av gråskalebild. Efterbehandlingsbilden av A efter öppning och stängning genom rekonstruktion, enligt beskrivningen i steg 2.1.1. (C) Postbinarisering av bearbetad bild. Panel B efter binarisering, utförd enligt beskrivningen i steg 2.2. (D) Slutlig bild med representativa celler för beräkningar av genomsnittlig areal. Bilden med blå cirklar som anger de celler som används i Hough-transformen för att identifiera den genomsnittliga ytan av en cell, enligt beskrivningen i steg 2.3. Skalstaplar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: RAW264.7 bulbous algoritmutgång. Figuren visar de mellanliggande bildbehandlingsstegen som leder till kvantifiering av bulbous RAW264.7 makrofagantal. (A) Bild av bulbous RAW264.7 makrofager. Den ursprungliga bilden konverterades till 8-bitars tiff och gråskala i ImageJ. (B) Efterbehandling av gråskalebild. Efterbehandlingsbilden av A efter öppning och stängning genom rekonstruktion, enligt beskrivningen i steg 2.1.1. (C) Postbinarisering av bearbetad bild med tydliga öar. Den typiska utgången utan den iterativa algoritmen vid analys av bulbous bilder, med "öar" av svarta pixlar i mitten av cellerna. De blå cirklarna representerar de celler som används i Hough-transformen för att identifiera den genomsnittliga arealen för en cell, enligt beskrivningen i steg 2.3. (D) Slutlig bild med representativa celler, öar ifyllda med postoperativ algoritm. Bildpostens iterativa algoritm, enligt beskrivningen i steg 2.2.2. Skalstaplar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: RAW264.7 och NIH/3T3 coculture algoritm utdata. Figuren visar de mellanliggande bildbehandlingsstegen som leder till kvantifiering av samkulturbilder som innehåller RAW264.7 makrofager och NIH / 3T3 fibroblaster. (A) Bild av NIH/3T3- och RAW264.7-celler. Den ursprungliga bilden konverterades till 8-bitars tiff och gråskala i ImageJ. (B) Efterbehandling av gråskalebild. Efterbehandlingsbilden av A efter öppning och stängning genom rekonstruktion, enligt beskrivningen i steg 3.1.1. (C) Postbinarisering av bearbetad bild med tydligt urval av makrofager baserat på höjdbaserad isolering. Den selektiva isoleringen av RAW264.7-makrofager, enligt beskrivningen i steg 3.2.2. (D) Slutlig bild med kluster av makrofager och fibroblaster identifierade. Hela bilden innehåller både RAW264.7 makrofager och NIH/3T3 fibroblaster, enligt beskrivningen i steg 3.3. En provmakrofagcell skisseras med en grön cirkel och en provfibroblastcell skisseras med en röd oval. Skalstaplar = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: DICE-parametersegmenteringsprestanda, RAW264.7 makrofager. Bilden visar ett överlägg mellan segmenteringsmetoden "ground truth" och denna metod. De vita regionerna är celler som detekteras av både "marksanningen" och denna metod, medan de lila och gröna regionerna är falska negativa respektive falska positiva. Segmenteringen "grundsanning" erhölls genom vanliga segmenteringstekniker och använder verktyg av intresseområde för att korrigera för felaktig segmentering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Räknare 1 | Räknare 2 | Räknare 3 | Automatisk | Manuellt antal genomsnittliga (±STDEV) | Fel jämfört med automatisk | |
| Bild 1 | 151 | 148 | 145 | 142 | 148 ± 3.0 | 4.22% |
| Bild 2 | 164 | 166 | 168 | 173 | 166 ± 2.0 | 4.05% |
| Bild 3 | 255 | 253 | 245 | 239 | 251 ± 5.3 | 5.02% |
| Bild 4 | 153 | 152 | 157 | 166 | 154 ± 2.6 | 7.22% |
| Bild 5 | 103 | 106 | 100 | 111 | 103 ± 3.0 | 7.20% |
Tabell 1: Manuellt/automatiskt cellantal och robusthetstest.
Kompletterande information: Morfologiska skillnader i bildanalys av makrofag- och fibroblastkokulturer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: "process.m", MATLAB-filen som är nödvändig för att köra algoritmerna. Inga manuella åtgärder krävs men innehåller algoritmen i en separat fil. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: "monokultur.m", MATLAB-filen som används för att analysera monokulturbilder. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: "coculture_modified.m", MATLAB-filen som används för att analysera samkulturbilder. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utformade en allmän områdesbaserad procedur som exakt och effektivt räknade celler på grundval av cellhöjd, vilket möjliggjorde fläckfri kvantitation av celler även i samodlingssystem. Kritiska steg för denna procedur inkluderade genomförandet av ett relativt intensitetssystem genom vilket celler kunde differentieras. Användningen av en relativ höjdanalys tjänade två syften: behovet av externa parametrar gjordes onödigt, eftersom relativa parametrar var konstanta för den givna celltypen och parametern, och absolut ljusstyrka / kontrastnivåer behövde inte anges för varje bild. Dessutom möjliggjorde användningen av ett percentilbaserat system analys av flera celltyper inom samma bild, förutsatt att de olika celltyperna bodde på unika höjder i bilden.
Det percentilbaserade systemet definierades som en skillnad från det maximala pixelvärdet i motsats till genomsnittet. Detta gjordes för att förhindra skevning av algoritmen baserat på medelvärdet av intensitetsvärdet, vilket var beroende av antalet och sammanflödet av celler som finns i bilden. Dessutom infördes den "maximala relevanta pixeln" för att förhindra att extremvärden med maximal intensitet väsentligt påverkar data – maximalt relevanta pixlar skulle behöva representera minst 0,5 % av populationen – ett experimentellt värde. Ytterligare steg inkluderade användningen av ett områdesbaserat kvantifieringssystem snarare än att räkna enskilda enheter. Detta säkerställde att cellfragmentering eller felaktig binarisering skulle minimeras vid räkning av celler, eftersom det totala drabbade området var minimalt jämfört med cellens yta.
Olika felsökningsmetoder implementerades inom denna algoritm. De första ansträngningarna att kvantifiera bilder av cellmonokulturer krävde metoder för att exakt identifiera både bulbous och icke-bulbous celler. Ett unikt fenomen observerades för de bulbösa cellbilderna, genom att cellernas centra identifierades som bakgrund efter vattendomstransformationen, och dessa regioner uppträdde som öar i cellen. En grundlig analys avslöjade att bristen på cellcentra uppstod på grund av en alltför konvex struktur i bilden, vilket resulterade i en inversion i vattendomstransformationen. En lösning implementerades specifikt för bulbous bilder, vilket involverade en iterativ process som kallas plugging, där öarna fylldes i som sanna cellvärden. Detta fungerade genom ett förfarande där celltäckningen och omfattningen av öbildning användes för att bestämma bildens noggrannhet. I allmänhet användes celltäckningen för att bestämma omfattningen av öbildning, eftersom en ovanligt låg celltäckning oftast orsakades av en hög nivå av öbildning. Förhållandet mellan celltäckning och omfattningen av öbildning bestämdes genom experimentella data.
Ytterligare felsökning var nödvändig baserat på observationen att användning av ett tröskelvärde för "genomsnittlig pixel" (definierad som den genomsnittliga genomsnittliga pixelintensiteten i bilden) för att differentiera celler, snarare än en maximal pixel, ledde till inkonsekvenser. Bildens genomsnittliga intensitet visade sig öka som en funktion av antalet celler i bilden, vilket kan snedvrida resultaten baserat på densiteten hos celler i bilden. En alternativ iteration av algoritmen utformades med hjälp av ett riktmärke för maximal intensitet; Detta värde var emellertid också inkonsekvent, eftersom högintensiva extremvärden signifikant snedvrider data och ledde till opålitliga resultat. I slutändan antogs användningen av en maximal relevant pixel. Den maximala relevanta pixeln visade sig exakt ta hänsyn till högintensiva extremvärden, vilket ledde till de mest konsekventa resultaten när man differentierade monokultur- och samkulturbilder.
Flera begränsningar av algoritmen identifierades vid analys av samodlingsbilder med hjälp av det percentilbaserade systemet för att selektivt identifiera distinkta typer av celler. Ibland uppträdde NIH / 3T3-celler kontinuerligt med RAW 264.7-celler i ett flerskiktat aggregat, vilket gjorde bilden extremt svår att analysera. Även om detta mestadels observerades för samodlingsbilder, kan monokulturbilder av celler med onormala odlingsförhållanden eller höga sammanflödesnivåer också resultera i flerskiktscellaggregat. Medan algoritmen framgångsrikt kunde detektera flerskiktade aggregat som unika från bakgrunden, var det inte möjligt att erhålla exakt cellkvantifiering med hjälp av denna 2D-bildanalys på cellens flerskikt. Dessutom kan cellskräp i bilden hämma algoritmens noggrannhet. Användningen av en områdesbaserad analysalgoritm tjänade till att minimera felet i samband med felaktig upptäckt, eftersom små områden av cellskrot skulle påverka cellantalet mindre med hjälp av en områdesbaserad analys än segmentering.
Dessutom resulterade konverteringen av czi-bilder till 8-bitars TIFF, utförd för att säkerställa enkelhet och enhetlighet, i pixeltyper av uint8, en samling heltal från 0 till 255. Således kunde skillnader endast kvantifieras med en maximal precision på 1/256 eller 0,39%. I allmänhet täckte pixelspridningen endast mellan 210 och 250 pixlar, vilket resulterade i en realistisk precision på 2.5%. Även om detta visade sig vara tillräckligt för monokulturanalys där celler är extremt distinkta från bakgrunden, krävde det selektiva subtraktionssteget inom samkulturanalysen mycket mer precision. Även om rimligt exakta data fortfarande kunde erhållas från samkulturbilder, minskade den totala noggrannheten för samkulturanalys jämfört med analysens noggrannhet från monokulturbilder. Dessutom krävde användningen av ett områdesbaserat identifieringssystem ett genomsnittligt cellområde för att erhålla cellantal. Denna parameter är användbar när det gäller bullriga bilder eller med celler med enhetliga geometrier men skulle hindra kvantifiering för areavariabla celler.
Betydelsen av denna algoritm i motsats till befintliga metoder ligger i användningen av utvecklade metoder som vattendomstransformation och morfologiska bildoperationer för att analysera mono- och kokulturerade celler utan fluorescensfärgningsförfaranden. Även om flera tidigare studier har rapporterat metoder för att framgångsrikt urskilja och räkna celler i frånvaro av färgning, krävde dessa alternativa metoder ofta komplexa odlingsmetoder eller otillgänglig programvara16. Till exempel använde Yilmaz och kollegor automatiserade räkneanalystekniker för att kvantifiera immunceller genom biochips med immunomagnetiska pärlor på mikrokuddar15.
Vi utformade också nya och effektfulla metoder för att ta itu med icke-slumpmässiga brusmönster, till exempel "öar", som dök upp i cellernas centrum. Identifiering av olika cellinjer var också möjlig genom att använda cellernas varierande "höjdvärden", som kunde identifieras från intensitetspixlar. Användningen av relativa parametrar snarare än absoluta parametrar gav flera fördelar genom att möjliggöra automatisering av algoritmen och ge mer flexibilitet för förvärv av bilder, eftersom exakt ljusstyrka, kontrast eller färginställningar inte behövde bevaras. Den områdesbaserade identifieringen gav exakta resultat även när celler grupperades, vilket är vanligt med många celltyper. Däremot är manuell räkning och segmentering svår, felbenägen och kan kräva att en utbildad användare identifierar celler exakt och effektivt.
Framtida tillämpningar och utveckling av algoritmen kommer att fokusera på finjustering och ytterligare optimering av cellräkningsproceduren. Vidare kan användningen av experimentella parametrar för att särskilja olika celltyper med relativ intensitet verifieras genom testning av ytterligare samkulturer; till exempel identifiering av nervceller/astrocyter för neurotoxicitetsanalys17. Ytterligare tillämpningar kan göras inom sårläkningsfältet, där representativa proportioner av immunceller kan spela en framträdande roll i de inflammatoriska och antiinflammatoriska processerna. Förbättringar i cellkvantifiering av makrofager och fibroblaster kan ge ytterligare insikt i parakrin kontra juxtracrin cellsignalering effekter som är relevanta för utvärdering av främmande kroppsresponsresultat 18,19. I kompletterande information utforskar vi de möjliga mekanismerna för att införliva morfometriska parametrar i algoritmen för att hjälpa till med noggrannheten i cellidentifiering inom samodlingssystem.
Förlängningar kan också göras för mer komplexa samkulturer, som skulle fokusera på 3 eller fler olika celltyper i bilder, i motsats till bara binära blandningar. På grund av den begränsade precision som finns tillgänglig för 8-bitars bilder kan 16-bitars bilder krävas, vilket ger ytterligare information men kan avsevärt komplicera analysen på grund av mer dynamiska intensitetsområden och fördelningar. Målet med denna studie var att utveckla ett robust protokoll för automatiserad cellräkning som är optimerat för olika cellodlingsmiljöer. Algoritmen möjliggör exakta cellräkningar även i bulbous cellbildförvärv. Dess självkorrigerande iterativa kod är användbar för fläckfri ljusfältsmikroskopiavbildning av immunologiskt relevanta cellodlingssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades delvis av National Institutes of Health (R01 AR067247) och delvis av Delaware INBRE-programmet, med stöd av ett bidrag från National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) från National Institutes of Health och delstaten Delaware. Innehållet i manuskriptet återspeglar inte nödvändigtvis finansiärernas åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL - 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB - 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T.
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022).
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022).
- Atherton, T., Kerbyson, D.
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
