Questo protocollo delinea il metodo del nastro su come costruire manualmente un microarray di tessuto utilizzando blocchi di donatori FFPE di diverse profondità.
Il tissue microarray (TMA) è un importante strumento di ricerca in cui molti campioni di formalina fissa di paraffina incorporata (FFPE) possono essere rappresentati in un singolo blocco di paraffina. Ciò si ottiene utilizzando nuclei di tessuto estratti dalla regione di interesse di diversi blocchi FFPE donatori e disponendoli in un singolo blocco di paraffina TMA. Una volta costruite, le sezioni del TMA completato possono essere utilizzate per eseguire studi di immunoistochimica, cromogenia, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e RNA ISH per valutare l’espressione proteica e le alterazioni genomiche e trascrizionali in molti campioni contemporaneamente, riducendo così al minimo l’utilizzo dei tessuti e riducendo i costi dei reagenti. Esistono diverse tecniche di costruzione TMA. Uno dei metodi di costruzione più comuni è il metodo ricevente, che funziona meglio con nuclei della stessa lunghezza per i quali si consiglia una lunghezza minima di 4 mm. Sfortunatamente, i blocchi di tessuto possono essere pesantemente resecati durante il processo diagnostico, spesso con conseguenti spessori di blocchi donatori “non ideali” inferiori a 4 mm. L’articolo e il video attuali si concentrano sul metodo del nastro biadesivo; un metodo alternativo manuale, a basso costo, facile da usare e rapido per costruire TMA a bassa densità (<50 core) che è altamente compatibile con questi blocchi donatori non ideali. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo su come costruire un TMA utilizzando questo metodo, con particolare attenzione all'importanza critica della revisione patologica e della convalida post-costruzione.
I tessuti ffPE (Formalin fixed paraffin embedded) sono ampiamente utilizzati negli studi morfologici e immunoistochimici sull’espressione proteica1. Tuttavia, la ricerca di scoperta richiede spesso l’esame di diversi marcatori su un gran numero di tessuti, che possono esaurire tessuti preziosi. Introdotto nel 1980, il tissue microarray (TMA) è un importante strumento di ricerca che assembla piccole regioni esemplari di interesse da molti diversi blocchi di tessuto FFPE in un singolo blocco di paraffina, consentendo l’esame di molti campioni di tessuto contemporaneamente2. Pertanto, le TMA evitano l’uso eccessivo di campioni di tessuto altamente preziosi e spesso rari, riducendo al contempo i costi associati all’esecuzione di applicazioni a valle su molti singoli campioni 3,4.
Esistono diverse tecniche per la costruzione di TMA5, compresi gli approcci automatizzati e semi-manuali 6,7. La maggior parte di questi ultimi approcci utilizza il metodo ricevente, in cui i nuclei di tessuto perforati dai blocchi del donatore vengono inseriti in uno stampo prefabbricato. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare blocchi donatori “ideali” di almeno 4 mm di spessore per questo metodo 6,7. Sfortunatamente, i blocchi dei donatori, in particolare quelli che sono stati ampiamente sezionati per scopi diagnostici clinici prima di essere resi disponibili per la ricerca, hanno spesso uno spessore inferiore a 4 mm, il che potrebbe escluderli dall’uso nella costruzione di TMA utilizzando il metodo ricevente, se il reincorporazione per raggiungere una profondità di 4 mm non è possibile o auspicabile. Inoltre, queste procedure possono spesso utilizzare un microarrayer di tessuti manuale da banco o costosi strumenti automatizzati che non sono facilmente accessibili o convenienti per il laboratorio di ricerca medio. Al contrario, il metodo del nastro biadesivo o metodo del nastro, è un metodo di costruzione TMA manuale compatibile con blocchi di donatori non ideali che utilizza microarrayer di tessuti portatili economici, ampiamente disponibili, riutilizzabili o usa e getta 8,9,10. Questo metodo inverte il processo di costruzione lanciando il blocco attorno a nuclei verticali invertiti che al completamento sono a filo con la parte superiore del TMA, indipendentemente dalla lunghezza del nucleo. Di conseguenza, tutti gli esempi sono presenti nelle sezioni TMA quando vengono sezionati per la prima volta, il che consente al costruttore di ottenere il massimo da questi blocchi non ideali fin dall’inizio. Pertanto, il metodo del nastro rappresenta un’alternativa economica e fattibile per i laboratori di ricerca non specializzati.
La costruzione del TMA non è priva di sfide e si deve prestare attenzione quando si selezionano le regioni tissutali da cui estrarre i nuclei, rendendo la revisione patologica una parte critica del processo di costruzione della TMA11,12. Pertanto, questo protocollo mira a sottolineare la profonda importanza della revisione patologica nella costruzione della TMA evidenziando alcune delle insidie patologiche associate alla costruzione della TMA di cui gli individui che costruiscono e utilizzano TMA dovrebbero essere consapevoli e perché la revisione della patologia dovrebbe continuare per tutta la durata di un blocco TMA.
Questo protocollo delinea le misure adottate presso l’AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory per costruire TMA da blocchi di donatori non ideali utilizzando il metodo del nastro; dove l’ACSR è un biorepository finanziato dal NIH dedicato alla raccolta e all’equa distribuzione di biocampioni dai tessuti del cancro dell’HIV al fine di promuovere la ricerca sulla malignità dell’HIV.
Uno dei componenti più critici del processo di costruzione del TMA è la revisione patologica dei blocchi donatori FFPE da cui si otterranno i nuclei TMA4. Durante la revisione, un patologo certificato esamina una sezione rappresentativa di tessuto colorato H & E da ciascun blocco di donatore. È imperativo che l’H & E sia generato utilizzando una sezione di tessuto appena tagliata in modo che sia la migliore rappresentazione del suo corrispondente blocco donatore. L’uso di H&E più vecchi non è raccomandato dato che i tessuti FFPE sono strutture tridimensionali il cui profilo tissutale può cambiare significativamente con la profondità del blocco e il sezionamento esteso; ciò potrebbe essersi verificato da quando è stato generato l’H & E, rendendo potenzialmente imprecisa la sua rappresentazione del blocco FFPE. Il processo di revisione è essenziale per la selezione dei casi idonei e l’identificazione delle aree tissutali da cui dovrebbero essere ottenuti i nuclei, nonché per l’identificazione delle aree che dovrebbero essere evitate durante la raccolta dei nuclei. In assenza di revisione patologica, aumenta significativamente la probabilità di includere tessuti inadatti. L’inclusione di tali tessuti ha il potenziale di rendere la TMA costruita inefficace e inadatta allo scopo previsto. È importante sottolineare che l’uso inconsapevole di tali TMA inefficaci ha un enorme potenziale per portare a dati falsi e fuorvianti. Questo, combinato con la consapevolezza che il profilo dei tessuti FFPE, e quindi dei loro nuclei derivati, può cambiare in modo significativo con l’aumentare della profondità evidenzia l’importanza di una revisione continua della patologia per tutta la durata di vita di un blocco TMA costruito. Idealmente gli H&E dovrebbero essere generati utilizzando ogni 15° o 20° sezione per garantire che eventuali cambiamenti nei profili tissutali dei nuclei vengano catturati e registrati. Come minimo, gli H&E dovrebbero essere generati e rivisti all’inizio e alla fine di un progetto per monitorare questi potenziali cambiamenti. Alla luce di questi punti e dell’importanza del TMA come strumento di ricerca, è imperativo che la revisione patologica sia saldamente incorporata nel processo di costruzione della TMA e per tutta la vita del blocco TMA.
I blocchi FFPE sono spesso ampiamente sezionati durante l’elaborazione diagnostica di routine prima di essere rilasciati per scopi di ricerca. Di conseguenza, la profondità del blocco del donatore e quindi le lunghezze del nucleo del blocco del donatore sono spesso inferiori all’ideale del metodo ricevente di 4 mm. Qui abbiamo dimostrato come costruire TMA utilizzando il protocollo di costruzione del metodo a nastro, il cui vantaggio principale è la sua compatibilità con nuclei di blocchi di tessuto FFPE non ideali. Sebbene il metodo del nastro sia di grande valore di ricerca e offra un metodo economico, conveniente e accessibile per la costruzione di blocchi TMA, non è privo di sfide e limiti. Rispetto ai metodi di destinatario automatizzati e manuali, che possono ospitare 100-1.000 core in un singolo blocco TMA, si consiglia un massimo di 40 core per le TMA costruite utilizzando il metodo a nastro9. Un’altra limitazione è rispetto alla facilità di costruzione. Nel metodo ricevente, i nuclei perforati vengono semplicemente inseriti in uno stampo prefabbricato, che fornisce stabilità al nucleo racchiudendo ogni nucleo nel proprio pozzo individuale, impedendo così la migrazione del nucleo e promuovendo il posizionamento e la separazione del nucleo altamente regolari22. Inoltre, il metodo destinatario offre la comodità opzionale di essere completamente manuale, semi-manuale e completamente automatizzato. Al contrario, il metodo del nastro manuale richiede un posizionamento attento e delicato di ciascun nucleo a mano utilizzando un plettro ad ago. Sebbene l’assenza di uno stampo prefabbricato nel metodo del nastro precluda il posizionamento e la separazione altamente regolari sperimentati con il metodo ricevente, questa carenza viene superata attraverso l’inclusione di una griglia a scacchi. È importante che la griglia a scacchi sia fissata al centro del vassoio metallico per evitare il posizionamento del bordo del blocco, il che aumenta il rischio di perdita del nucleo se non c’è paraffina insufficiente che tiene il nucleo in posizione. Va inoltre notato che le piccole separazioni del nucleo possibili con il metodo ricevente non possono essere ottenute con il metodo del nastro a causa del posizionamento manuale del nucleo e della necessità che il plettro dell’ago si adatti tra nuclei adiacenti. I nuclei sono posizionati in modo eretto indipendente con la più piccola superficie o impronta del nucleo che contatta la griglia coperta DSST. Questa configurazione fornisce una stabilità del nucleo significativamente inferiore rispetto al metodo ricevente e conferisce un rischio maggiore di ribaltamento e/o migrazione del nucleo quando si versa la paraffina fusa. In effetti, uno dei passaggi più critici nel protocollo è versare la paraffina fusa. È essenziale che questo venga fatto rapidamente al momento della rimozione dal forno per garantire che la paraffina sia completamente liquida e che il versamento venga eseguito delicatamente con turbolenze minime. È interessante notare che Chen et al. hanno sviluppato un dispositivo ausiliario altamente nuovo, simile a uno stencil con fori di diametro 7 x 11 distribuiti uniformemente di 2 mm, che viene posizionato sopra un blocco di paraffina bianco per guidare gli aghi durante la creazione del blocco ricevente e quando si inseriscono i nuclei del blocco donatore23. Sebbene progettato per aiutare la costruzione del blocco ricevente, tale dispositivo potrebbe essere facilmente adattato al metodo del nastro per guidare il posizionamento, regolare la separazione e aumentare la stabilità del nucleo durante il processo di costruzione.
Uno degli effettori più significativi della stabilità del core è il numero di core inclusi in un metodo a nastro TMA. Questo perché con l’aumentare del numero di core, il diametro del core deve ridursi per adattarsi al numero crescente di core, che a sua volta riduce l’ingombro del core aderendo al DSST. Un diametro minimo del nucleo di 1 mm è raccomandato per la costruzione TMA con metodo a nastro, poiché abbiamo scoperto che i nuclei con diametri più piccoli sono particolarmente instabili e inclini a rovesciarsi anche con versamenti di paraffina molto delicati. Un recente studio che ha studiato due diversi metodi interni che utilizzavano aghi da 16 G (diametro del nucleo di 1,1 mm) e un punzone di diametro di 4 mm ha subito notevoli perdite di tessuto con i nuclei da 1,1 mm (26,5%) ma non i nuclei da 4 mm24. Questo sembra indicare che i piccoli nuclei possono essere problematici con cui lavorare e non solo durante la costruzione. Inoltre, diametri più piccoli potrebbero non rappresentare il blocco originale del donatore e nuclei più grandi, rendendo difficile l’interpretazione patologica e aumentando la probabilità di una rappresentazione imprecisa del tessuto del donatore.
L’inclusione e il posizionamento di blocchi di orientamento è di profonda importanza nella costruzione di TMA. Tuttavia, questo è di particolare importanza per le TMA costruite con metodo a nastro. Ciò deriva dal fatto che il metodo del nastro inverte il processo di costruzione aumentando così il rischio di disorientamento spaziale. Si consiglia di includere fino a tre nuclei di orientamento in ogni blocco e di posizionarli lontano dai nuclei campione per orientare al meglio il blocco. I nuclei di orientamento possono essere nuclei prelevati da blocchi di tessuto contenenti tessuti nettamente diversi dal tema del TMA costruito o strumenti di orientamento colorati privi di tessuti21, dove quest’ultimo è particolarmente utile per i non patologi. In combinazione con il posizionamento del nucleo a matrice non regolare, i nuclei di orientamento riducono al minimo il rischio di disorientamento.
La marcata differenza nella lunghezza del nucleo tra le TMA costruite utilizzando il nastro e i metodi riceventi deriva dall’inclusione della profondità del blocco del donatore nel processo decisionale durante la selezione del metodo di costruzione. Il protocollo qui delineato impiega una soglia in cui i TMA sono costruiti utilizzando i metodi del nastro e del ricevente quando i blocchi donatori hanno profondità rispettivamente di <4 mm e 4 mm. È importante notare che l'inclusione della profondità del blocco del donatore nella scelta del metodo di costruzione non è universale. Sebbene sia possibile costruire TMA utilizzando entrambi i metodi indipendentemente dalla profondità del blocco del donatore, i nuclei più alti possono interferire con, e o essere rovesciati o inclinati da, il posizionamento della cassetta di plastica durante la costruzione TMA utilizzando il metodo del nastro. La scelta di includere o omettere criteri nel processo decisionale dipende dai servizi disponibili per il laboratorio, dal costo e dal prodotto finale desiderato. Secondo i parametri di questo protocollo, il numero di sezioni TMA montate su slitta che possono essere ottenute da un TMA costruito con metodo a nastro è significativamente inferiore a quello ottenuto da un metodo ricevente costruito TMA. Sebbene sia possibile ri-bloccare i tessuti FFPE per aumentare la profondità del blocco del donatore e renderli compatibili con il metodo ricevente, la probabilità di ottenere lo stesso orientamento tissutale all'interno del re-blocco è bassa. A sua volta, ciò potrebbe richiedere un ampio blocco per ottenere una sezione a faccia intera, che probabilmente includerebbe una significativa perdita di tessuto. Dopo il rivestimento del blocco, un TMA costruito con il metodo del nastro produce circa 50 sezioni TMA montate su scorrimento con tutti i nuclei presenti. Tuttavia, il numero esatto varierà da blocco a blocco e dipende dalla lunghezza dei nuclei utilizzati per costruire il TMA e dallo spessore delle sezioni da tagliare (5 μm contro 4 μm). Inoltre, va anche notato che a causa delle loro diverse lunghezze del nucleo, i nuclei si esauriranno in momenti diversi man mano che il TMA viene progressivamente sezionato; un attributo che sottolinea nuovamente la necessità di una continua revisione patologica.
Sebbene il metodo del destinatario offra vantaggi e vantaggi significativi rispetto al metodo a nastro, inclusi processi di costruzione meno noiosi e più rapidi, il metodo del nastro non è rivolto a laboratori esperti ad alta produttività. Si rivolge al laboratorio medio, in particolare a quelli in ambienti con risorse limitate, con accesso a blocchi donatori di profondità variabile ma non ai servizi di costruzione TMA. Tuttavia, le applicazioni future potrebbero vedere l’automazione di questo metodo al fine di migliorare il pool di campioni idonei nei laboratori ad alta produttività ed eliminare la necessità di ri-bloccare i blocchi dei donatori. In conclusione, il protocollo di costruzione del metodo a nastro TMA descritto può essere facilmente stabilito in laboratori non specializzati senza la necessità di costose attrezzature. Tuttavia, si consiglia ai nuovi utenti di utilizzare blocchi di tessuto FFPE senza valore, strumenti di orientamento colorato privi di tessuto21 o anche blocchi di paraffina colorati senza tessuto all’inizio per familiarizzare con la tecnica del metodo del nastro prima di avanzare alla costruzione TMA utilizzando tessuti preziosi. Sebbene la loro costruzione non sia priva di potenziali insidie, di cui dovrebbero essere consapevoli sia coloro che costruiscono che utilizzano blocchi TMA, questo metodo di costruzione TMA “fatto in casa” apparentemente non lucidato può produrre TMA di alta qualità e biologicamente rilevanti per la ricerca. In effetti, le sezioni TMA derivanti da TMA costruite con metodo a nastro sono tra i campioni di tessuto più richiesti nel biorepository ACSR.
The authors have nothing to disclose.
Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal biorepository AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) finanziato dal NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
cellSens imaging software | Olympus | x | |
Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
DP72 camera | Olympus | DP72 | |
Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
Forceps | Various | x | |
Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
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Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
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Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
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Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |