Summary
Det nuvarande protokollet optimerar leverns in situ-perfusion /decellularisering och tvåfotonmikroskopimetoder för att etablera en tillförlitlig plattform för att visualisera dynamiken i extracellulär matris (ECM) remodellering under alkoholfri steatohepatit (NASH).
Abstract
Icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) är den vanligaste kroniska leversjukdomen i USA och påverkar mer än 70 miljoner amerikaner. NASH kan utvecklas till fibros och så småningom till cirros, en signifikant riskfaktor för hepatocellulärt karcinom. Den extracellulära matrisen (ECM) ger strukturellt stöd och upprätthåller leverhomeostas via matricellulära signaler. Leverfibros är resultatet av en obalans i den dynamiska ECM-remodelleringsprocessen och kännetecknas av överdriven ackumulering av strukturella element och associerade förändringar i glykosaminoglykaner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas "kycklingtråd", som vanligtvis består av zon 3 perisinusformad / pericellulär fibros, baserat på funktioner som observerats av Massons trikroma fläck och Picrosirius röda fläckar. Dessa traditionella tunna tvådimensionella (2D) vävnadsglidbaserade avbildningstekniker kan emellertid inte visa de detaljerade tredimensionella (3D) ECM-strukturella förändringarna, vilket begränsar förståelsen för den dynamiska ECM-ombyggnaden vid leverfibros.
Det nuvarande arbetet optimerade ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga ECM-strukturen i levern via decellularisering för att ta itu med ovanstående utmaningar. Möss matades antingen med chow eller snabbmat diet i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion, och tvåfotonmikroskopiteknikerna tillämpades för att avbilda och analysera förändringar i den ursprungliga ECM. 3D-bilderna av normal- och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi gav en praktisk och pålitlig plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Introduction
Icke-alkoholhaltig fettleversjukdom (NAFLD) är den vanligaste leversjukdomen och drabbar 20% -25% av den vuxna befolkningen. 25% av NAFLD-patienterna utvecklas till alkoholfri steatohepatit (NASH), där risken för cirros, leversvikt och hepatocellulärt karcinom ökar1. Under de kommande 20 åren beräknas NASH stå för 2 miljoner leverrelaterade dödsfall i USA2. Eftersom det inte finns några godkända behandlingar finns det ett akut behov av att dechiffrera de mekanismer som orsakar leverfibros hos NASH-patienter och utveckla riktad behandling3.
Den extracellulära matrisen (ECM) är en dynamisk, komplex mikromiljö som utövar dubbelriktad kommunikation med celler för att reglera vävnadshomeostas4. Leverns ECM består av strukturella element såsom proteoglykaner, kollagener, fibronektin, elastin och andra icke-strukturella proteiner (t.ex. olfactomedin och trombospondin) för att ge fysiskt och strukturellt stöd4.
Leverfibros är ett kroniskt sårläkningssvar på leverskador av olika etiologier, inklusive NASH3. Det beror på en obalans i den dynamiska ECM-matrisremodelleringsprocessen och kännetecknas av överdrivna strukturella proteiner i den skadade levern4. Fibrogenes beror på den dynamiska cell-cellkommunikationen mellan olika levercelltyper. Hepatiska stellatceller (HSC), när de aktiveras, differentieras till glatt muskulatur alfa 2 Actin-uttryckande, migrerande och prolifererande myofibroblastliknande celler och syntetiserar ECM-proteiner som en sårstängande verkan. Aktiverade HSC är de centrala kollagenproducerande cellerna i levern1.
Den molekylära mekanismen för ECM-remodellering, fibrosmönster och deras förhållande till cellulära händelser är inte klarlagda. En bättre förståelse av den tredimensionella (3D) ECM-strukturen behövs fortfarande, även om masspektrometritekniker har hjälpt till att analysera ECM-proteinsammansättning4. Traditionellt har Massons trikroma fläck, Picro Sirius Red-fläckar och andra harmoniska generationens (SHG) avbildning utförts på tvådimensionella (2D) tunna leversektioner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas "kycklingtråd", som sträcker sig till zon 3 och är perisinusformad / pericellulär fibros 5,6. Det har dock saknats studier som fokuserar på 3D-strukturen hos den inhemska levern, särskilt de som inte involverar vävnadssnitt. Robusta avbildningsmetoder för att identifiera mönster och egenskaper hos fibros under dynamisk ECM-remodellering vid leverfibros skulle avsevärt stärka förståelsen för NASH-mekanismer och identifiera nya terapeutiska mål.
För att ta itu med dessa utmaningar optimerades ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga lever-ECM via decellularisering7. Helleverdecellularisering är ett tillvägagångssätt för att avlägsna det hepatiska cellulära innehållet samtidigt som det ursprungliga 3D ECM-nätverket upprätthålls genom tvättmedelsperfusion. Möss matades antingen chow eller snabbmatdiet (FFD) i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion med milt rengöringsmedel och låga flödeshastigheter för att bevara trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturer. Tvåfotonmikroskopi användes för att analysera förändringar i kollagenstrukturer i ECM. 3D-bilderna av den ursprungliga ECM-strukturen i normala och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi ger en praktisk och prisvärd plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utförs enligt de experimentella förfaranden som godkänts av de institutionella djurvårds- och användningskommittéerna (IACUCs) vid Stanford University och Veterans Affairs Hospital i Palo Alto. 6-8 veckor gamla manliga C57BL / 6J-möss matades antingen chow eller en snabbmatdiet kompletterad med 4,2% majssirap med hög fruktos (se materialtabell) i dricksvatten i 14 veckor5. Mössen hölls i standardburar vid en 12 h mörk / ljus cykel.
1. Kirurgisk förberedelse och procedurer för leverperfusion
- Väg musen före proceduren.
- Bedöva musen genom att administrera ketamin (90 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) (se materialtabell) via en intraperitoneal injektion. Se till att musen är helt sövd genom tåklämning innan du fortsätter till nästa steg.
OBS: Isofluran behövs inte här eftersom detta är en icke-överlevnadsoperation. - Raka det ventrala området med en hårklippare och desinficera huden med 70% etanol. Placera musen på ryggen och immobilisera benen på operationskortet med tejp.
- Efter att ha bekräftat anestesidjupet med en tå-nypa, använd Mayo sax och Adson-pincett (se materialtabell) för att göra ett 3 cm snitt i sidled i underlivet och sedan ett 5 cm snitt vertikalt från lågbuken till xiphoidprocessen. Var försiktig så att du inte öppnar bröstkaviteten.
- Efter att ha öppnat bukhinnan, placera försiktigt tarmarna till djurets vänstra och höj leverns högra lob med en Rayon-tippad applikator (se materialförteckning) för att exponera portalvenen.
- Kateterisera portalvenen med en 24 G IV-kateter. För in katetern i den distala änden av portalvenen. Placera kateterspetsen innan portalvenen grenar ut i leverloberna.
- Dra ut nålen omedelbart när katetern kommer in i venen. Kontrollera att katetern är korrekt placerad inuti venen genom att perfusera levern med PBS med en 1 ml spruta via katetern.
OBS: Vid PBS-perfusion ska alla lober omedelbart blanchera. Om katetern är korrekt placerad kommer venöst blod snabbt att strömma genom katetern. - Använd Dumont mikropincett, en Castroviejo mikronålhållare och 4-0 sutur (se materialtabell) för att placera ett stygn under förgreningen av portalvenen och ett andra stygn 1 cm under för att säkra katetern.
2. Decellularisering av vävnad
- Anslut katetern till en silikonslang (~1 m längd, 3 mm innerdiameter och 4,1 mm ytterdiameter) med en Luer-kontakt. Anslut silikonslangen till en peristaltisk pump och en behållare som innehåller avjoniserat vatten (se Materialförteckning).
- Ta försiktigt bort luftbubblorna inuti röret och undvik att generera nya bubblor under perfusionen. Ställ in den peristaltiska pumpen på en flödesutgång på 0,2 ml/min (dvs. 288 ml/24 timmar).
- Perfusera först med avjoniserat vatten (~50 ml/mus) i 2 timmar. Färgen på levern kommer att förändras från rött till gult under perfusion.
OBS: Djuret kommer att löpa ut efter 10 minuters perfusion. - Byt perfusionslösningen till 0,5% (vikt/volym) natriumdeoxikolat (DOC, se Materialförteckning) och fortsätt över natten (18 timmar, ~250 ml/mus). Levern blir vit i slutet av perfusionen (figur 1).
- Byt perfusionslösningen till avjoniserat vatten (~50 ml/mus) och perfusera i 2 timmar.
- Använd Dumont mikropincett och mikrofjädersax (se materialtabell) för att samla den decellulariserade levern och tvätta den noggrant i en petriskål med PBS.
- Skär den decellulariserade vävnaden i små bitar för omedelbar avbildning eller frys vid -80 ° C för ytterligare biokemisk analys såsom tandemmasspektrometri, ELISA eller western blot.
3. Förberedelse av objektglas för avbildning (med ett multifoton/konfokalt fluorescensmikroskop)
- Överför en liten bit decellulariserad lever (<3 x 3 x 3 mm) till ett mikroskopglas och placera vävnaden i mitten.
- Tillsätt 10 μL antifade monteringsmedium (se materialförteckning) till vävnaden med en pipett för att undvika vävnadstorkning.
- Täck vävnaden med ett täckglas och applicera en liten kraft för att platta provet. Försegla kanterna på täckglaset med färglöst och transparent nagellack (figur 2).
OBS: På grund av inställningen av den upprättstående tvåfotonen genom mikroskopet användes ett täckglas på provet. Prover kan dock placeras annorlunda om ett inverterat mikroskop används.
4. Bildinsamling
- Placera en droppe nedsänkningsolja på toppen av täckglaset och placera bilden på mikroskophållaren. Sänk 20x oljeobjektivet tills det kommer i kontakt med nedsänkningsoljan.
- Byt till den violetta (405 nm) kanalen, slå på slutaren och fokusera på provet. Navigera och placera intresseområdet för avbildning. Stäng av slutaren innan du går över till bildinsamling med laserljus.
- Byt till datorkontrollen och starta tvåfotonlasern. Slå först på tvåfotonlasern (figur 3A) och slå sedan på laserstyrenheten med två foton (se Materialförteckning) och slutaren (figur 3B, C). Se till att uteffekten är högre än 2,5 W.
Minska lasereffekten för att förhindra fluorescenskylning. Välj och justera detektorer (både fotomultiplikatorer och hybrid) för att passa de valda fluoroforerna.
OBS: Tvåfotonavbildning utfördes vid en excitationsvåglängd på 860 nm. Två kanaler valdes för kollagen SHG respektive tvåfotonexciterad fluorescens (TPEF) bilder. En kanal motsvarande våglängdsområdet 415-445 nm detekterade den detaljerade strukturen av kollagen från SHG-signaler. En annan kanal täckte intervallet 465-669 nm för att samla in TPEF-signaler. - Välj samtidiga eller sekventiella bildförvärv. Justera pinhålet till det högsta värdet. Justera laservåglängder, förstärkning, effekt och förskjutning. Justera pixeluppehållstiden, pixelstorleken, medelvärdet och zoomen (bild 4A).
- Bläddra i datorns z-kontroller och ställ in z-dimensionerna, definiera start och slutpunkter och välj antalet bilder som ges inom en volym (z-stack). Hämta bilder.
OBS: Här valdes en volym på 20 μm Z och en storlek på 1 μm Z-steg (figur 4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kollagenfibrerna detekterades med andra harmoniska generationen och tvåfotonmikroskopi. Signalen kommer från de frangible trippel-spiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturerna. Specifika antikroppar användes inte för att analysera kollagensubtyper; Detta kan dock läggas till bildtekniken.
När levervävnaden studeras utan decellularisering är det utmanande att få högupplösta bilder av kollagennätverket (Figur 5A). I decellulariserad ECM verkar kollagenfibrer (gröna) parallella eller sammanvävda (figur 5B). Det fanns uppenbara skillnader i morfologin och rumsfördelningen av ECM-komponenterna mellan Chow- och FFD-lever. Kollagenfibrer hos möss på en chowdiet uppvisade ett sammanvävt och välorganiserat nätverk. Hos möss på FFD observerades dock kollagenbuntar med mindre anslutning (figur 5B).
För att ytterligare studera 3D-strukturen hos lever-ECM togs bilder av skivorna med en 20 μm Z-volym (tjocklek) och 1 μm Z-stegstorlek. Kollagenfibrer hos möss på chow diet visade ett välorganiserat nätverk men inte hos mössen på FFD (Figur 6). För att bekräfta kvaliteten på det fibrillära kollagenet i den decellulariserade ECM fixerades och inbäddades objektglasen i paraffin och färgades med hematoxylin och eosin (H&E) och Picrosirius röd (PSR) (se materialtabell). H&E visar att alla celler har tagits bort. PSR är en vanlig histologisk teknik för att markera kollagen i paraffininbäddade vävnadssnitt (figur 7).
Figur 1: Muslever under perfusion. Levern blir vit och halvtransparent i slutet av perfusionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Glidförberedelse för bildbehandling. Vävnaden är täckt med ett täckglas och en liten kraft appliceras för att platta provet. Täckglasets kanter är förseglade med färglöst och transparent nagellack. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Skärmbild av programvaran för tvåfotonlasern och startar tvåfotonlasern. (A) Först slås tvåfotonlasern på. b) (C) Laserstyrenheten med två foton och slutaren är påslagna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Skärmbild av tvåfotonlaserprogramvaran under bildinsamling. (A) Se till att ställa in nålhålet på det högsta värdet (röda pilar). Justera laservåglängder, förstärkning, effekt och förskjutning. Justera pixeluppehållstiden, pixelstorleken, medelvärdet och zoomen. (B) Ställ in Z-volymen på 20 μm och Z-stegstorleken på 1 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Decellulariserad ECM avbildad med tvåfotonmikroskopi . (A) SHG-bilder av kollagenfibrer från en 6 μm leverskiva (färskfryst) utan decellularisering. (B) SHG-bilder visar ett välorganiserat kollagennätverk i lever hos möss på normal kontroll, chow diet. Ombyggt kollagennätverk hos möss på snabbmatdiet (FFD). Pil, fibrosområde. Star, ombyggt kollagennätverk. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: 3D-struktur av leverkollagennätverk. Kollagenfibrerna hos möss på chowdieten visade ett välorganiserat nätverk men inte i snabbmatdiet (FFD) möss. Bilderna togs med en 20 μm Z-volym (tjocklek) och 1 μm Z-stegstorlek. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Färgning av hematoxylin och eosin (H&E) och Picrosirius röd (PSR) färgning av decellulariserad ECM. H&E visar att alla celler har tagits bort. I PSR-färgningsbilderna avslöjade ECM från de chowmatade mössen ett välorganiserat nätverk, och däremot visade möss på snabbmatdiet (FFD) tätare kollagenfibrer. Z-volym (tjocklek) = 6 μm. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande protokollet visar att decellularisering genom en låg flödeshastighet DOC in situ perfusion bevarar de frangible trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturerna, vilket ger en pålitlig och kostnadseffektiv plattform för att fånga dynamisk ECM-remodellering i NASH-leverfibros. Även om decellularisering utfördes i normala och fibrotiska lever innan ECM-komponenter identifierades eller biologiska byggnadsställningar genererades för cellodling, har dynamiken i ECM-remodellering vid leverfibros inte studerats väl 8,9,10. Denna metod gör det möjligt för utredare att göra jämförelser mellan olika fibrosmodeller.
För närvarande finns det sorter av perfusionsprotokoll som använder DNase, natriumdodecylsulfat (SDS) eller Triton X-10011. Kostnaden för DNase är hög eftersom stora volymer lösningar krävs. SDS är en hård denatureringslösning, ett anjoniskt tvättmedel som stör cellmembranen och denaturerar proteiner. Därför är det utmanande att bevara hela kollagennätverket efter SDS-perfusion. Däremot stör Triton X-100, som ett milt icke-denaturerat, icke-joniskt tvättmedel, lipid-lipid- och lipid-proteininteraktioner och bevarar protein-proteininteraktioner. Det har dock rapporterats att Triton X-100 stör ECM-ställningarna, vilket gör den decellulariserade lever-ECM olämplig för ytterligare masspektrometrianalys11.
Perfusionsprotokollet med DOC modifierades från föregående arbete7, vilket visar bättre bevarande av de trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturerna i de flesta vävnader. Kollagennätverket studerades med andra harmoniska generationens (SHG) mikroskopi utan antikroppar, vilket återspeglar de trippelspiralformade och nativa fibrillära kollagenstrukturerna. Den decellulariserade lever-ECM från FFD-möss testades också, och strukturella förändringar i NASH bekräftades.
De mest kritiska stegen i protokollet är kateterplacering och inställning av perfusionssystemet. Portalvenkateteriseringen är avgörande, men den sämre vena cava kan också användas om portalvenen är skadad. Bubblor i bufferten och rören måste undvikas eftersom de påverkar perfusion. Eftersom ett upprätt tvåfotonmikroskop användes var provstorleken begränsad. Detta kan modifieras om ett inverterat mikroskop ska användas.
Det finns ett ökande intresse för den ombyggda ECM i kroniska leversjukdomar och leverkarcinogenes12,13,14. Decellulariserade ECM-ställningar har använts inom kirurgisk reparation och regenerativ medicin som ett lämpligt biologiskt ställningsmaterial15,16,17. Denna milda decellulariseringsprocess har emellertid också begränsningar, eftersom vissa cellulära komponenter som DNA eller lipidrester kanske inte avlägsnas helt. Längre DOC-perfusionstid och en ökning av flödeshastigheten kan hjälpa till att få ultrarenade decellulariserade byggnadsställningar. Att tillsätta DNas i tvättlösningen efter DOC-perfusionen kan också hjälpa till att ta bort DNA. Protokollet kan justeras för humana leverbiopsier, vilket ökar förståelsen för ECM-förändringar under NASH-progression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter angående denna artikel.
Acknowledgments
Vi tackar Hyesuk Park för den tekniska hjälpen. Denna forskning stöddes av finansiering från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, till NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, till NJT). Vi tackar Jon Mulholland och Kitty Lee från Cell Sciences Imaging Facility i Beckman Center för teknisk hjälp med tvåfotonmikroskopiavbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 - 10 mL - vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R.
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
