Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kvantifiering av den potentiella effekten av glyfosatbaserade produkter på mikrobiom

Published: January 10, 2022 doi: 10.3791/63109
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 2,3,4
1Biodiversity Unit, University of Turku, 2Department of Biology, University of Turku, 3Nutrition and Health Unit, Eurecat Technology Centre of Catalonia, 4Department of Biochemistry and Biotechnology, Rovira i Virgili University

Summary

Glyfosatbaserade produkter (GBP) är de vanligaste bredspektrumherbicider över hela världen. I den här artikeln introducerar vi allmänna riktlinjer för att kvantifiera effekten av GBP på mikrobiom, från fältförsök till bioinformatikanalyser.

Abstract

Glyfosatbaserade produkter (GBP) är de vanligaste bredspektrumherbicider över hela världen. Målet för glyfosat är enzymet 5-enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntas (EPSPS) i shikimatvägen, som är praktiskt taget universell i växter. Hämningen av enzymet stoppar produktionen av tre essentiella aminosyror: fenylalanin, tyrosin och tryptofan. EPSPS finns också i svampar och prokaryoter, såsom arkéer och bakterier; Således kan användningen av GBP påverka mikrobiomsammansättningen hos jordar, växter, växtätare och sekundära konsumenter. Denna artikel syftar till att presentera allmänna riktlinjer för att bedöma effekten av GBP på mikrobiom från fältförsök till bioinformatikanalyser och ge några testbara hypoteser. Två fältförsök presenteras för att testa GBP på icke-målorganismer. Först samplas och analyseras växtassocierade mikrober från 10 replikerade kontroll- och GBP-behandlingsplottar som simulerar beskärning utan jordbearbetning. I det andra experimentet erhölls prover från experimentella tomter befruktade av antingen fjäderfägödsel innehållande glyfosatrester eller icke-behandlad kontrollgödsel. Bioinformatikanalys av EPSPS-proteinsekvenser används för att bestämma mikrobernas potentiella känslighet för glyfosat. Det första steget i att uppskatta effekten av GBP på mikrobiom är att bestämma deras potentiella känslighet för målenzymet (EPSPS). Mikrobiella sekvenser kan erhållas antingen från offentliga förvar eller med hjälp av PCR-förstärkning. I de flesta fältstudier har emellertid mikrobiomkompositionen bestämts baserat på universella DNA-markörer såsom 16S rRNA och den interna transkriberade distansen (ITS). I dessa fall kan känsligheten för glyfosat endast uppskattas genom en probabilistisk analys av EPSPS-sekvenser med användning av närsläktade arter. Kvantifieringen av organismernas potentiella känslighet för glyfosat, baserat på EPSPS-enzymet, ger en robust metod för ytterligare experiment för att studera mål- och icke-målresistenta mekanismer.

Introduction

Den stora användningen av bekämpningsmedel i det moderna jordbruket är helt klart en viktig bidragande orsak till minskningen av den biologiska mångfalden1. Detta dokument fokuserar på glyfosat eftersom glyfosatbaserade produkter (GBP) har blivit de mest använda bekämpningsmedlen globalt på grund av deras effektivitet och överkomliga pris 2,3. Förutom att döda ogräs i jordbruksfält används GBP ofta i skogsskötsel, stadsmiljöer och hemträdgårdar; Dessutom har de proklamerats som giftfria för icke-målorganismer om de används i enlighet med tillverkarens anvisningar. Ett ökande antal nyligen genomförda studier har dock visat att rester av glyfosat och dess nedbrytningsprodukter kan behållas och transporteras i marken och därmed ha kaskadeffekter på icke-målorganismer 4,5,6,7,8 . Effekterna av glyfosat är inte bara begränsade till växter - shikimatvägen är också närvarande i många svampar och prokaryoter. Glyfosat riktar sig mot enzymet 5-enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntas (EPSPS) i shikimatvägen, även känd som aroA9. Detta enzym är i mitten av shikimatvägen i syntesen av de tre essentiella aromatiska aminosyrorna (fenylalanin, tyrosin och tryptofan), och det finns i de flesta prokaryoter, växter och svampar10,11. Vissa mikrobiella arter har utvecklat partiell eller absolut resistens mot glyfosat med hjälp av flera mekanismer, inklusive mutationer i EPSPS-sekvenserna. Således har det föreslagits att användningen av GBP kan ha en direkt effekt på växt- och djurmikrobiom, inklusive människans tarmmikrobiom 12,13,14. Användningen av GBP kan dock ha en negativ inverkan på praktiskt taget alla ekosystem funktioner och tjänster som är beroende av mikrober och mikrob-underlättade processer. De därav följande hoten kan gälla biokemiska markprocesser, pollineringsbiologi och djurs och människors välbefinnande. Detta kräver en mer omfattande förståelse för hur glyfosat påverkar shikimatvägar och metoder för att bedöma mikrobernas känslighet för glyfosat.

I detta protokoll presenterar vi en pipeline för att testa effekten av glyfosat och GBP på mikrobiomet, från fältförsök till bioinformatikanalyser. Vi beskriver i detalj en nyligen publicerad bioinformatikmetod som kan användas för att bestämma organismernas potentiella känslighet för glyfosat12. Såvitt forskarna vet är detta det första och hittills enda bioinformatikverktyget för att bedöma enzymet EPSPS inneboende känslighet för den aktiva komponenten i GBP. Denna bioinformatikmetod är baserad på detektion av kända aminosyramarkörer i glyfosatmålenzymet (EPSPS)12. Rörledningen är uppdelad i fem huvudsakliga arbetsfaser (figur 1): 1) en kort introduktion till två fältexperiment för att testa effekten av GBP, 2) en kort sammanfattning av mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS och EPSPS-gen ), 3) insamling av EPSPS-sekvenser från offentliga förvar, 4) bestämning av organismernas potentiella känslighet för glyfosat och 5) bedömning av EPSPS-klassen från universella mikrobiella markörer (16S rRNA och ITS).

Protocol

1. Två fältförsök för att testa effekten av GBP

OBS: Detta protokoll presenterar två exempel på fältexperimentella mönster för att testa effekten av GBP på växtassocierade mikrober. Båda experimenten utfördes på avsatta fält utan tidigare historia av herbicid- eller jordbruksanvändning vid Åbo universitets Runsala botaniska trädgård i Finland (60º26'N, 22º10'E). Marken är sandig lera med en hög andel organiskt material.

  1. Experiment 1
    OBS: Detta experiment var utformat för att simulera de allmänna jordbruksmetoderna för jordbruk utan jordbearbetning med GBP-applikationer före och efter växtsäsongen för att bekämpa ogräs.
    1. Dela upp försöksfältet i 10 replikerade kontroll- och GBP-behandlingsdiagram (23 m x 1,5 m) med buffertremsor av vegetation mellan tomterna ( i denna studie våren 201415) (Figur 2).
    2. Se till att tomterna bearbetas med en roterande rorkult till ett djup av 5 cm och behandlas två gånger om året. Här behandlades tomterna i början (maj) och slutet (oktober) av växtsäsongen.
    3. Behandla kontrolltomterna med kranvatten (5 L/tomt) och GBP-tomterna med kommersiell GBP (glyfosatkoncentration 450 g· L-1, appliceringshastighet 6,4 L·ha-1 i 5 L kranvatten per tomt) för att efterlikna den maximala tillåtna glyfosatdosen i jordbruksmetoder (3 kg·ha-1).
    4. Applicera behandlingarna med en handmanövrerad tryckbehållare som har en manuell spruta. Två veckor efter GBP-ansökan, så havre (Avena sativa), fababönor (Vicia faba), raps (Brassica rapa subsp. oleifera) och växtpotatis (Solanum tuberosum) i tomterna enligt jordbruksmetoder.
    5. Under växtsäsongen, hand-weed tomterna för att hålla växtkonkurrensen och markstrukturen så lika som möjligt i kontrollen och GBP-behandlade tomter.
    6. Prova mikrobioten från experimentella växter. I denna studie provtogs mikrobiotan i följd från 2017 till 2020 i både GBP-behandlade och kontrollbehandlingsplottar en gång per växtsäsong under studiens gång.
    7. Samla tio replikat av växtproverna (rot och blad) från fältet, lägg dem omedelbart på is och ta dem till laboratoriet för vidare bearbetning, enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.
  2. Experiment 2
    OBS: Detta experiment utformades för att testa risker i samband med den cirkulära livsmedelsekonomin. Mer exakt utformades det för att undersöka konsekvenserna av GBP-rester i gödsel som applicerades som gödselmedel på grödor2 (figur 3).
    1. Samla sängkläder, inklusive träspån, avföring och lite spillt foder, från vaktlar som matas på GBP-förorenade eller kontrollfoder i ett 12-månaders aviary experiment16,17.
      OBS: Det GBP-förorenade fodret bestod av ekologiskt foder för värphöns i kombination med motsvarande 160 mg glyfosat/kg, vilket motsvarar ett dagligt intag på 12–20 mg glyfosat per kilo kroppsmassa hos vuxna japanska vaktlar16,17.
    2. För validering, skicka proverna till ett ackrediterat laboratorium för mätningar av glyfosatkoncentrationen i sex fodersatser.
    3. Dessutom mäta glyfosatresterna i vaktelutsöndringsprover efter 12 månaders exponering. Kontrollgruppen utfodades med samma ekologiska foder utan tilläggpå 16,17 GBP.
    4. Under aviary-experimentet, byt sängkläderna två gånger i veckan. Samla in de använda sängkläderna regelbundet från 8-12 månaders exponering från GBP-behandling och kontroller, pool per behandling och förvara i slutna behållare i ett torrt, mörkt förråd vid 6 ° C innan du använder som gödningsmedel.
    5. Sprid 12 L av sängkläderna manuellt på var och en av de 18 GBP och 18 kontrolllotterna (storlek 1 m x 1 m) i ett 6 x 6 schackbrädenät i experimentfältet vid två tidpunkter. I denna studie spreds sängkläderna i augusti 2018 och i maj 2019.
    6. Skicka ströproverna till ett ackrediterat laboratorium för mätningar av glyfosatkoncentrationen direkt efter att det spridits (i denna studie i maj 2019).
    7. Plantera fleråriga gräs- och jordgubbsväxter i varje tomt för att studera deras rot- och bladmikrobiota.
      OBS: I denna studie planterades fyra fleråriga gräsväxter (Festuca pratensis) och två jordgubbsväxter (Fragaria x vescana) till varje tomt och studerades för deras rot- och bladmikrobiota.

2. Mikrobiomanalyser (16S rRNA, ITS och EPSPS-gen )

OBS: De flesta mikrobiomstudierna är baserade på analysen av 16S rRNA-genen för bakteriella och interna transkriberade spacerregioner (ITS) för svampsamhällen med hjälp av nästa generations sekvenseringsteknik. Således har papperet inte information om typen av EPSPS. EPSPS-sekvenser från tusentals arter finns tillgängliga i offentliga arkiv (protokollavsnitt 3) (figur 4).

  1. 16S rRNA-gen
    1. Från de fristående blad- och rotproverna som samlats in i experimenten som beskrivs ovan, identifiera de endofytiska mikroberna (dvs mikrober som lever inuti växtvävnader).
    2. Tvätta växtproverna med kranvatten och sterilisera dem sedan för att avlägsna de epifytiska mikroberna (dvs mikrober på ytan av växtvävnader). Sterilisera med 3% blekmedel i 3 min, följt av en 70% etanollösning i 1 min och tvätta tre gånger med autoklaverat ultrarent vatten i 1 min vardera.
    3. Frys proverna vid -80 °C tills genomisk DNA-extraktion.
    4. Utför genomisk DNA-extraktion med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt växt-DNA-extraktionssats enligt tillverkarens protokoll.
    5. Rikta in dig på de variabla regionerna V6-V8 i 16S rRNA-genen från extraherade DNA-prover med hjälp av ett kapslad metod med diskriminerande primers som binder specifikt till bakteriellt DNA18, vilket minimerar amplifieringen från värdväxt-DNA.
    6. Efter tre omgångar av polymeraskedjereaktion (PCR), märker målgenen med streckkod och adaptersekvenser för att förbereda den som mall för sekvensering. Följ steg 2.1.7-2.1.11 för PCR-förstärkning
    7. Förbered PCR-masterblandningen för det erforderliga antalet prover så att varje reaktion har 30 μLof total volym och består av 30 ng DNA, 1x PCR-buffert, 0,2 mM dNTP, 0,3 μM av varje primer och 2000 U / ml DNA-polymeras. Följ samma steg för den andra och tredje omgången av PCR.
    8. För den första omgången av PCR, använd primers 799F19 och 1492R (modifierad från20) (tabell 1). Ställ in förstärkningsprofilen på termocyklisten (3 minuters initial denaturering vid 95 °C, följt av 35 denatureringscykler vid 95 °C i 45 s, glödgning vid 54 °C i 45 s och förlängning vid 72 °C i 1 min). Utför den slutliga förlängningen vid 72 °C i 5 min.
    9. Som mall för den andra omgången av PCR, verifiera förstärkning genom elektrofores (5 μL av PCR-produkterna på 1,5% agarosgel) och späd sedan resten 25 μL av PCR-produkten i autoklaverat ultrarent vatten i förhållandet 1:10.
    10. Upprepa PCR med de utspädda PCR-mallarna och primrar uni-1062F21 och uni-1390R22 (tabell 1). Bibehåll samma PCR-reaktionsbetingelser och förstärkningsprofil (steg 2.1.8) förutom att minska antalet cykler till 25.
    11. Späd de resulterande PCR-produkterna i autoklaverat ultrarent vatten i förhållandet 1:1. Utför den tredje omgången PCR för att märka produkterna med streckkoderna och P1-adaptersekvensen med 8 cykler av samma PCR-profil som nämns i steg 2.1.8.
  2. Förberedelse av biblioteket
    1. Kontrollera koncentrationen och kvaliteten på PCR-produkter på en bioanalysator och slå samman volymerna som utgör 30 ng DNA för varje prov i ett 1,5 ml rör för att förbereda ett ekvimolärt bibliotek.
    2. Välj amplikonerna i storlek 350-550 bp efter storleksfraktionering med hjälp av ett automatiserat DNA-storleksvalssystem på en agarosgelkassett. Observera att detta också eliminerar icke-specifika amplicons och PCR-reagenser från biblioteket. Samla eluten bestående av amplikoner av den angivna storleken i en injektionsflaska i kassetten, vilket resulterar i ett renat 16S rRNA-genbibliotek.
    3. Pipettera ut elutten i ett 1,5 ml rör och verifiera renheten och koncentrationen på bioanalysatorn. Späd DNA-biblioteket med autoklaverat ultrarent vatten till en slutlig koncentration av 26 pM; provet är klart för sekvensering.
  3. DESS
    OBS: ITS-regionen förstärks med ITS-specifika primers (tabell 1), och den resulterande PCR-produkten är märkt med streckkoder och en P1-adaptersekvens för sekvensering.
    1. Förbered PCR-mastermixen enligt samma protokoll som nämns i avsnitt 2.1 med ITS-primers .
    2. Ställ in förstärkningsprofilen på termocyklisten som 5-minuters initial denaturering vid 95 °C följt av 35 cykler av denaturering, glödgning och förlängning vid 95 °C i 30 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 1 min respektive slutlig förlängning 72 °C i 7 min.
    3. Analysera 5 μL av PCR-produkten på 1,5 % agarosgel och späd resterande 25 μL till 1:10 med autoklaverat ultrarent vatten. Använd den utspädda PCR-produkten som mall för den andra omgången PCR.
    4. Förbered PCR-mastermixen för det önskade antalet prover (se steg 2.1.6) med streckkodsmärkta framåtriktade primers och P1-adaptermärkta omvända primers. Förstärk med samma förstärkningsprofil som i steg 2.3.2, förutom att använda 8 cykler.
    5. Förbered de resulterande PCR-produkterna för sekvensering enligt de protokoll som nämns i avsnitt 2.2.
  4. EPSPS-gen
    1. Sekvens och analysera MIKROBERNAS EPSPS-gener .
      OBS: För att ta reda på om GBP-exponering förändrade sammansättningen av glyfosatkänsliga och resistenta mikrober i samhället måste mikrobernas EPSPS-gener sekvenseras och analyseras. Således samlades 353 sekvenser av EPSPS-gener från en bred samling mikrobiella taxa i ATGC-databasen (Alignable Tight Genomic Clusters) och alla proteinsekvenser justerades22. Dessa anpassningar finns tillgängliga på ATGC-databas23 och kan användas för att generera primers från bevarade regioner. Ett lättanvänt bioinformatikverktyg är utformat för att identifiera bevarade regioner från en multipel sekvensjustering, och detta finns tillgängligt på Pere Puigbo forskningssida24. Det ligger dock utanför ramen för denna publikation att ge en detaljerad beskrivning av denna webbserver. Ändå tillhandahålls ett prospektivt protokoll för att använda dessa primers för amplifiering av EPSPS-genen för att hitta mikrobiomets känslighet för glyfosat i figur 4.

3. Samla EPSPS-proteinsekvenser från offentliga förvar

  1. EPSPS-sekvenser som ska användas i makroevolutionsstudier
    1. Samla EPSPS-proteiner från offentliga förvar som PFAM23 (en databas med proteinfamiljer25), GenBank24 (en databas med gener, genom och proteiner26 ), COG25 (Kluster av ortologa grupper27; en databas med ortologa proteiner från arkéer och bakterier); och PDB26 (Protein Data Bank28; en databas över proteinstrukturer).
      OBS: En nyligen genomförd studie utförd av forskarna visade att dessa proteiner kunde användas för att utföra mikroevolutionära och jämförande analyser av den potentiella effekten av glyfosat på organismer som har shikimatvägen12. Författarna har utvecklat en användarvänlig webbplats som samlar information om tiotusentals EPSPS-proteinsekvenser29, inklusive en manuellt kuraterad dataset av proteiner från människans tarmmikrobiom12. Informationen i dessa förräknade dataset inkluderar den aktuella EPSPS-klassificeringen i förmodade känsliga och resistenta mot glyfosat, taxonomisk information om arter, anteckningar från EPSPS aktiva webbplats och länkar till PDB- och NCBI-databaser. Dessutom innehåller webbservern EPSPS ID-koder och länkar till flera externa databaser (tabell 2).
  2. EPSPS-sekvenser som ska användas i mikroevolutionsstudier ATGC
    OBS: Allmänna förvar av proteinsekvenser är användbara för att genomföra jämförande studier bland relativt avlägsna organismer; Den potentiella effekten av glyfosat är dock relativt ny ur evolutionär synvinkel. I vissa studier är det därför nödvändigt att jämföra närliggande arter (t.ex. olika stammar från samma bakterieart) för att bestämma effekten av glyfosat14. I dessa fall är databasen för Alignable Tight Genomic Clusters (ATGC)30, som innehåller en omfattande lista över närbesläktade arkeala och bakteriella genom, en mer lämpad resurs. ATGC-databasen innehåller information om flera miljoner proteiner från tusentals genom organiserade i hundratals kluster30. Varje genomkluster är inriktat (genom delar synteny över ≥85% av deras längder) och tätt (med en synonym substitutionshastighet under mättnad). Forskarna använde ATGC-datasetet i en nyligen genomförd studie för att analysera mikroevolutionära förändringar i EPSPS-proteiner14. Följande steg behövs för att identifiera EPSPS-proteinsekvensen i ATGC:
    1. Ladda ner hela databasen med ATGC från länk31 och alla proteiner i COG0128 (kod motsvarande EPSPS-proteiner i databasen)32 till ett lokalt projekt.
      OBS: Om forskarna/experimenterna är baserade i Finland tillhandahåller CSC-IT Center for Science33 lagrings- och programvarufaciliteter. Det är viktigt att samla alla sekvenser i FASTA-format.
    2. Byggde en blastdatabas av COG0128 som innehåller ortologgar av EPSPS-proteinet i en representativ uppsättning arter av prokaryoter. CSC har sprängprogrammet34 förinstallerat, vilket möjliggör användning av kommandot makeblastdb -in COG0128.fa -dbtype prot för att skapa en referensdatabas med EPSPS-sekvenser.
    3. Mappa ATGC-databasen till COG0128.fa (EPSPS-proteiner) med hjälp av en iterativ blastsökning med kommandot blastp -query [ATGC_X.fa] -db [COG0128.fa] -max_target_seqs 1 -outfmt 6 -out tmpfile -evalue 1e-150.
    4. Som ett resultat skapar det en datauppsättning med EPSPS-proteinsekvenser inom var och en. En förräknad datauppsättning med närbesläktade EPSPS-proteinsekvenser från ATGC-databasen finns tillgänglig29.

4. Algoritm för att bestämma organismernas potentiella känslighet för glyfosat (EPSPSClass webbserver: ingångar, bearbetning och utgångar)

OBS: Forskarna har implementerat en lättanvänd server som är fritt tillgänglig vid 29 för att bestämma klassen av EPSPS-proteinsekvenser12,35. Servern kräver endast en inmatning av proteinsekvens i FASTA-format för att bestämma identitetsprocenten för var och en av EPSPS-klasserna och deras potentiella känslighet för glyfosat. Dessutom kan användare använda webbservern för att testa sina egna referenssekvenser och aminosyramarkörer. Först justerar algoritmen (figur 5) frågesekvenser och referenssekvenser med hjälp av ett multipelsekvensjusteringsprogram35 för att bestämma aminosyrapositioner. Sedan söker den efter närvaron av aminosyramarkörer för att identifiera EPSPS-klassen (I, II, III eller IV) i frågesekvensen.

  1. Introducera en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format i textrutan för indata för att identifiera enzymets klass (figur 6A) och tryck på Skicka.
  2. Utvärdera frågesekvensens potentiella känslighet för glyfosat (bild 6B-E) från serverns angivna utdata:
    Utdata 1: Fraktion av aminosyramarkörer (dvs. identitet) som finns i frågesekvenserna (klass I, II och IV) och antalet motiv (klass III).
    Utdata 2: Justeringar av fråge- och referenssekvenser baserat på markörrester.
    Utdata 3: Fullständiga parvisa justeringar av fråge- och referenssekvenserna.
    Utgång 4: EPSPS-referenssekvenser: Vibrio cholerae(vcEPSPS, klass I), Coxiella burnetii(cbEPSPS, klass II), Brevundimonas vesicularis(bvEPSPS, klass III), Streptomyces davawensis(sdEPSPS, klass IV).
  3. I slutet av utdatasidan hittar du länkar till externa verktyg som sprängning och bevarade domäner för att ytterligare analysera EPSPS-frågesekvensen (figur 6F).

5. Bedömning av EPSPS-klassen från universella mikrobiella markörer (16S rRNA och ITS )

OBS: De flesta mikrobiomstudier är baserade på analysen av 16S rRNA och / eller ITS36. I sådana fall är det inte möjligt att utföra en direkt analys av EPSPS-sekvensen. Således är ett probabilistiskt tillvägagångssätt för att uppskatta organismernas potentiella känslighet för glyfosat nödvändigt. Denna analys är enkel och ger en rimlig uppskattning av typen av EPSPS-sekvenser i ett mikrobiomprojekt. Processen är uppdelad i tre steg (figur 7 och figur 8):

  1. Identifiera EPSPS-sekvenser från offentliga lagringsplatsen. EPSPS-klassen för en omfattande datauppsättning med representativa sekvenser har sammanställts och förräknats från PFAM37, GenBank38, COG39, PDB40, ATGC30. Få åtkomst till dessa datauppsättningar från EPSPSClass-serverns huvudsida, som innehåller taxonomisk information och EPSPS-klassen med över 50 000 sekvenser (figur 7).
  2. Mät höjden på försöksplantorna varannan vecka under växtsäsongen och väga växternas biomassa ovan jord i slutet av fältsäsongen för att jämföra växternas tillväxt i GBP och kontrollera tomter.
    OBS: Mikrobiotanalyserna från fältexperimenten har ännu inte analyserats fullständigt.
  3. Använd ett kalkylblad för att kartlägga bakteriella OTU: er (baserat på 16S rRNA eller ITS) från mikrobiomexperiment till förberäknade dataset.
    OBS: Tidigare studier har visat att EPSPS-klassen (dvs. den inneboende känsligheten för glyfosat) är mycket bevarad inom en fylogenetisk grupp14. Således är det relativt säkert att anta att närbesläktade arter från högkonserverade taxoner kan ha liknande EPSPS-svar på glyfosat (figur 8).
  4. I samma kalkylblad beräknar du den inneboende känsligheten för glyfosat, baserat på en probabilistisk poäng (S = s / (s + r + u) där S: Sensitivity Score; s: antal potentiellt känsliga sekvenser; r: antal potentiellt resistenta sekvenser; u: antal oklassificerade sekvenser) beräknade från kända EPSPS-sekvenser i offentliga databaser.
    OBS: Denna poäng sträcker sig från 0 (inga känsliga EPSPS-sekvenser finns i ett taxon) till 1 (alla sekvenser i ett taxon är känsliga för glyfosat) (Figur 8). Dessutom finns det mellanvärden, dvs. arter med känsliga, resistenta eller okända stammar.

Representative Results

Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en allmän pipeline, från fältförsök till bioinformatikanalyser, som kvantifierar organismernas potentiella känslighet för herbiciden glyfosat. I experiment 2 var den genomsnittliga glyfosatkoncentrationen i vaktelfodret 164 mg/kg och den genomsnittliga glyfosatkoncentrationen av utsöndringsproverna (urin och fekal materia tillsammans) var 199 mg/kg. Sängkläder som samlats in från vaktlar som utfodrats med GBP-förorenat foder hade i genomsnitt 158 mg/kg och kontrollsängkläder som mätte 0,17 mg/kg glyfosat (tabell 3). I fältförsöken reagerade växtarter annorlunda på glyfosatrester i marken (avsnitt 1). Biomassan av havre- och raps var större i kontrolljord jämfört med GBP-behandlade jordar. Fababönor och potatis verkade dock dra nytta av GBP-behandling i slutet av växtsäsongen15. Glyfosat i fjäderfägödsel minskade växttillväxten i gräs (Festuca pratensis) och jordgubbar (Fragaria x vescana) (avsnitt 1). Mikrobiotanalyserna från fältförsöken har ännu inte analyserats fullständigt och presenteras inte här (avsnitt 2). Resultaten av detta protokoll, när de läses antingen direkt (som visas i avsnitten 3 och 4) eller indirekt (avsnitt 5), ger ett mått på andelen potentiellt känsliga och resistenta organismer mot glyfosat i en dataset (figur 9). Användningen av denna metod testades med en samling EPSPS-proteinsekvenser från mikrobiella arter av kärnmikrobiomet i människans tarmbiom som erhölls från offentliga förvar12. I studien analyserades 890 stammar från de 101 vanligast förekommande bakteriearterna med EPSPSClass-metoden för att kvantifiera andelen känsliga och resistenta bakterier. Resultaten visade att 54% av arterna i kärnmikrobiomet i människans tarm är potentiellt känsliga för glyfosat12. Denna trend observeras också i större delen av den prokaryota världen; Dessutom är andelen potentiellt känsliga arterännu högre i eukaryoter (främst växter och svampar). Dessutom har vi använt denna metod för att kvantifiera förändringar i känslighet i EPSPS-proteinet på mikroevolutionär nivå (figur 10)14. Vi identifierade förändringar i känslighetsstatus hos 12 av 32 närstående grupper av prokaryoter som analyserades (tabell 4)14. Således kan den kontinuerliga användningen av GBP producera mikrobiell dysbios (dvs. en obalans mellan känsliga och resistenta bakteriearter) i växt-, djur- och jordmikrobiom. Dessutom har det antagits att en ökning av glyfosatresistenta bakterier kan främja multiresistenta mikrobiom 14,41,42. Således belyser detta protokoll tolkningen av alla dessa scenarier, eftersom EPSPS-klassificeringsmetoden ger en direkt uppskattning av mikrobiomens inneboende känslighet för glyfosat. På grund av EPSPS-proteinets inneboende känslighet för att glyfosat är fylogenetiskt bevarat14 är det möjligt att extrapolera resultaten från befintliga dataset till okända mikrobiom (Figur 8).

Figure 1
Figur 1: Allmän pipeline Detta är en allmän pipeline för att analysera känsligheten för GBP från fältexperiment till bioinformatikanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Fältförsök 1 för att testa effekterna av GBP-rester på växtassocierade mikrober. Experimentfältet består av alternerande 10 kontrolltomter och 10 GBP-behandlingstomter (23 m x 1,5 m) med 1,5 m buffertremsor mellan tomterna. Två gånger om året sedan 2014 behandlades GBP-tomterna med kommersiell GBP (glyfosatkoncentration 450 g L-1, appliceringshastighet 6,4 L ha-1 i 5 liter kranvatten per tomt) och kontrolltomterna med samma mängd kranvatten utan glyfosat. Behandlingarna applicerades med en handmanövrerad tryckbehållare med en plasthuv i sprinklerspetsen för att skydda GBP från att sprida sig utanför behandlingsplanerna. Efter en två veckors säkerhetsperiod efter GBP-ansökan såddes havre (Avena sativa), fababönor (Vicia faba) och raps (Brassica rapa subsp. oleifera) och potatis (Solanum tuberosum) planterades på tomterna. Mikrobiotaprover från de studerade grödorna, löv och rötter, samlades in flera gånger sedan experimentets början 2014. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Fältförsök 2 testade konsekvenserna av GBP-rester i gödselgödsel för två fleråriga grödor och deras tillhörande mikrobiota. Sängkläder som samlats in från ett 12-månaders aviary experiment med japanska vaktlar matade med kontroll eller GBP-förorenat foder användes som gödselgödsel i ett fältexperiment. Experimentfältet bestod av 18 kontroll- och 18 GBP-tomter (1 m x 1 m) arrangerade i ett 6 x 6 schackbrädenät. Sängkläderna spreds på försöksfältet två gånger, i augusti 2018 och maj 2019 (25 L / tomt). Kontrolltomter befruktades med sängkläder som samlats in från vaktlar som matades med kontrollfoder och GBP-tomter med sängkläder från vaktlar som matades med GBP-förorenat foder. Glyfosatrester i kontrollströ var 0,17 mg/kg glyfosat och i GBP-strö var mängden 158 mg/kg glyfosat. Två endofyt-symbiotiska (E+), två endofytfria (E-) Festuca pratensis och två Fragaria x vescana planterades per tomt i september 2018, ungefär en månad efter spridningen av de första sängkläderna. Mätningar av växtens prestanda och kondition samt provtagning för rot- och bladassocierad mikrobiota genomfördes under två på varandra följande växtsäsonger (2019 och 2020). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Analys av de mikrobiella taxa med användning av 16S rRNA-gen/ITS-region och mikrobioms känslighet för glyfosat med hjälp av EPSPS-genen . (A) Analys av 16S rRNA eller ITS-sekvenser för att identifiera mikrobiella taxa. (B) Analys av EPSPS-sekvenser för att identifiera mikrobers känslighet för glyfosat (GS-glyfosatkänslig/GR-glyfosatresistent) Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Algoritm för att identifiera klassen av EPSPS-proteinsekvenser. Ingången är en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. Algoritmen utför jämförelser med kända aminosyramarkörer i referensproteinsekvenser som bestämmer den potentiella känsligheten för glyfosat. Algoritmen implementerades på den fritt tillgängliga webbservern EPSPSClass29. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Grundläggande in- och utgångar från EPSPSClass-webbservern. (A) Indata: en EPSPS-proteinsekvens i FASTA-format. (B) Utgång 1 - identitet: fraktion av aminosyramarkörer som finns i frågesekvenserna (klasserna I-IV) och motiv (klass III). (C) Utdata 2 – identitet: anpassningar av fråge- och referenssekvenserna. (D) Utdata 3 - parvisa justeringar av fråge- och referenssekvenserna. E) EPSPS-referenssekvenser: Vibrio cholerae (vcEPSPS, klass I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klass II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klass III), Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klass IV). (F) Länkar för att utföra tilläggssprängningssökningar och identifiering av bevarade domäner Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Bild 7: Tillgång till förräknade datauppsättningar med EPSPS-sekvenser. Följ anvisningarna i figuren för att komma åt den förräknade datauppsättningen för EPSPS-sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Exempel på hur man uppskattar den potentiella känsligheten i mikrobiomprojekt utan EPSPS-sekvenser. I exemplet används värden från databasen för Alignable Tight Genomic Clusters30, som innehåller sekvenser från prokaryota arter. Hypotetiska arter från ett mikrobiomprojekt är Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci och Sulfolobus islandicus. Känslighetspoängen för glyfosat beräknas som Number_Sensitive_Sequences/Total_Number_Of_Sequences. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Schema för tolkningen av resultaten från detta protokoll och hypotetiska evolutionära scenarier. (A) I ett mikrobiom är andelen potentiell känslighet (i grönt) och resistens (i rött) bakterier ungefär 50:50. Svarta prickar betecknar mikrobiella arter som inte är klassade; således är deras känslighet för glyfosat okänd. I vissa mikrobiom är andelen känsliga bakterier något högre, som i människans tarmmikrobiom12. (B) Med tiden kan användningen av glyfosat leda till mikrobiell dysbios (dvs. en obalans i andelen känsliga och resistenta bakterier) som leder till olika hypotetiska scenarier. (C) Hypotetiskt fall 1 (inget urval): Användningen av glyfosat påverkar inte mikrobiomet. således förblir andelen känsliga och resistenta bakterier konstant. (D) Hypotetiskt fall 2: Användningen av glyfosat avlägsnar bakterier som är känsliga för glyfosat från populationen. Vi spekulerar i att detta scenario kan vara dosberoende. (E) Hypotetiskt fall 3: Selektionstrycket från användningen av glyfosat ökar mutationer i EPSPS-genen som förändrar bakteriernas känslighetsstatus. Således blir hela den mikrobiella befolkningen resistent mot glyfosat. I detta scenario kan det dessutom finnas en ökning av multiresistenta bakterier. (F) Hypotetiskt fall 4: Användningen av glyfosat förändrar sammansättningen av vissa bakteriearter, vilket ger en obalans gentemot resistenta bakterier, medan vissa bakteriearter förblir oförändrade, möjligen på grund av ytterligare resistenta mekanismer såsom effluxpumpar eller genom överuttryck av EPSPS-genen 13. Detta scenario kan också leda till en ökning av glyfosatresistenta bakterier, liksom en ökning av bakteriell resistens mot ytterligare antibiotika. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Fördelning av den förutsagda känsligheten för glyfosat över artträdet. Cirkeldiagram anger andelen arter som är föraningskänsliga (gröna) eller resistenta (röda) mot glyfosat och oklassificerade (svarta). Denna siffra har anpassats med tillstånd från Rainio et al.14. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Bild 11: Indata och utdata från EPSPSClass-webbservern för att testa användarens egen referenssekvens. (A) Indata 1: frågesekvens. (B) Ingång 2: referenssekvens. C) Ingång 3: aminosyramarkörer i referenssekvenserna. (D) Utdata: identitet: fraktion av aminosyramarkörer i frågesekvenserna (klass I–IV och användarens egna referenssekvenser). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Lista över primers för PCR-amplifiering av 16S rRNA-gen och ITS-region i mikrobiomanalys Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Koder för enzymet 5-enolpyruvylshikimat-3-fosfatsyntas (EPSPS) i olika databaser Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Genomsnittlig glyfosatkoncentration Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 4: Sammanfattande tabell över procentandelen arter som är känsliga/resistenta mot glyfosat. Denna tabell har anpassats med tillstånd från Rainio et al.14. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 5: Placeringar av aminosyramarkörerna i referenssekvenserna Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Detta protokoll ger allmän vägledning om hur man kvantifierar effekten av GBP på mikrobiom baserat på analysen av EPSPS-proteinet. Protokollet har tre viktiga kritiska steg: (i) Kvantifiering av EPSPS-proteinet från mikrobiomdata. Detta steg är kritiskt eftersom EPSPS är herbicidens direkta målenzym. Således kan arter som har en kopia av EPSPS-genen påverkas av användningen av GBP. Icke desto mindre kan även arter som saknar en kopia av EPSPS-genen påverkas av herbiciden genom alternativa icke-målmekanismer43,44. (ii) Om analysen av EPSPS-genen inte ingår i utformningen av studien är det möjligt att få en bra uppskattning genom att analysera 16S rRNA (bakterier) eller ITS (svampar). I detta fall är det viktigt att förlita sig på en omfattande referenstabell (t.ex. tillhandahåller ATGC-databasen sekvenser av EPSPS-proteinet från flera när besläktade arter). iii) EPSPS-proteinet är uppdelat i potentiellt känsligt eller resistent mot glyfosat beroende på vissa aminosyrarester från EPSPS aktiva stället. Mutationer som påverkar en enda aminosyra kan dock förändra denna klassificering45 och övergångar mellan klasser kan ske under en relativt kort tidsperiod14.

Organismernas potentiella känslighet för glyfosat kan bestämmas genom referensgenom, aminosyramarkörer och sekvensjusteringar. i) Referensgenom: EPSPS-enzymet kan klassificeras som potentiellt känsligt (klass I [alfa eller beta]46,47) eller resistent (klasserna II48,49, III50 och IV51) mot glyfosat baserat på förekomsten av aminosyramarkörer och motiv (i fråga om klass III). Dessa aminosyramarkörer och motiv är baserade på placeringen av aminosyrarester i EPSPS-proteinet i Vibrio cholerae (vcEPSPS, klass I), Coxiella burnetii (cbEPSPS, klass II), Brevundimonas vesicularis (bvEPSPS, klass III) och Streptomyces davawensis (sdEPSPS, klass IV). ii) Aminosyramarkörer: Glyfosat interagerar med EPSPS-enzymet och konkurrerar med fosfoenolpyruvat (PEP, det andra substratet för EPSPS-enzymet)52,53. Hos vissa arter ger små aminosyraförändringar i EPSPS-sekvensen en högre affinitet för PEP och en resistens mot glyfosat 12,14,52,54,55. I andra sekvenser binder glyfosat EPSPS-sekvensen i en icke-hämmande konformation 45. Även om många resistenta 12,14,48,49,52,54,55 och toleranta 56,57 EPSP-sekvenser mot glyfosat har beskrivits, är det nuvarande klassificeringssystemet för EPSPS indelat i fyra huvudklasser (I-IV)12 (tabell 5 ). iii) Sekvensjusteringar: För att klassificera ett EPSPS-enzym utförde vi parvisa justeringar, med ett multipelt sekvensjusteringsprogram-standardparametrar35-, av frågesekvensen mot var och en av referenssekvenserna (vcEPSPS, cbEPSPS, bvEPSPS och sdEPSPS). Dessa justeringar är nödvändiga för att identifiera positionerna för aminosyramarkörerna i frågesekvensen. Som ett resultat klassificeras ett enzym enligt beskrivningen12-klass I, II och / eller IV baserat på närvaron av aminosyramarkörer och klass III-baserade motivmarkörer.

Protokollet är baserat på fyra kända typer av EPSPS: en typ är känslig, de andra tre är resistenta). Cirka 10 % av EPSPS-sekvenserna i prokaryoter är dock ännu oklassificerade (16 % i arkéer och 8 % i bakterier)12. Således bör ytterligare forskning analysera dessa sekvenser för att bestämma glyfosatkänslighet. EPSPSClass-servern ger möjlighet att testa nya genetiska markörer. Identifieringen av kända klasser i EPSPS är enkel, såsom visas i avsnitt 4.4. och figur 5. I de fall där användarna vill jämföra sina egna fråge- och referensproteiner ger servern dessutom möjlighet att manuellt inkludera en referenssekvens och en uppsättning aminosyramarkörer (figur 11). Detta alternativ kan användas för att identifiera nya klasser av EPSPS, samt för att testa andra herbicider och målsekvenser.

Analysen av EPSPS-klassen bestäms genom sekvensanalys och närvaron/frånvaron av aminosyramarkörer. Detta är en preliminär uppskattning som kan användas för hypotesprövning inom området. Aminosyramarkörer har bestämts i litteraturen baserat på empiriska och observationsstudier 46,47,48,49,50,51. Referensproteinsekvenser för att bestämma EPSPS-klass har dock endast testats på ett begränsat antal arter och kan ibland misslyckas med att förklara resistens mot glyfosat. Effekten av kompensationsmutationer och EPSPS-associerade domäner (främst i svampar) kan också påverka känsligheten för glyfosat58. Denna uppsatss analys är baserad på fyra EPSPS-klasser. En undersökning av bakterier i människans tarmmikrobiom visade att cirka 30% av dem var oklassificerade (dvs. EPSPS-proteiner från dessa arter tillhör inte någon av de kända klasserna), och ytterligare studier behövs för att identifiera andra EPSPS-klasser. Det bör också noteras att EPSPS-proteinsekvensen i bakterier och växter är oföregen, medan svamp-EPSPS-proteiner innehåller flera domäner59. Således kan ett proteinveck i svampar leda till ett annat svar från EPSPS-enzymet på glyfosat. Dessutom beaktas inte ytterligare icke-målbaserade resistensmekanismer (t.ex. effluxpumpar och överuttryck av EPSPS-genen 13) eller känslighet för glyfosat (t.ex. effekten av glyfosat på mitokondriell transportkedja12).

Även om GBP har funnits som herbicid sedan 1974 och har använts i stor utsträckning sedan 1991, är detta den första bioinformatikmetoden för att bestämma organismernas potentiella känslighet för glyfosat. Metoden är baserad på identifiering av kända aminosyrarester i målsekvensen. Således ger vår metod en baslinjeuppskattning av den potentiella effekten av glyfosat på arten. Inom en snar framtid bör nya bioinformatikmetoder omfatta ytterligare klasser av EPSPS-proteinet för att bestämma den potentiella känsligheten för glyfosat av oklassificerade sekvenser 12,54,55. Dessutom, med tanke på att epsps-enzymets exakta beteende kan variera med enstaka aminosyraförändringar 12,14,52,54,55, bör vidare i silikoexperiment ta hänsyn till små variationer i vikningen av EPSPS-proteinet, liksom effekten av EPSPS-associerade domäner på proteinstrukturen i svampar58 . Dessutom har det visats att tolerans mot glyfosat kan framställas genom överuttryck av EPSPS-proteinet56,57; Således kan bioinformatikanalyser baserade på förbättringen av kodonanvändningen60 användas för att identifiera nya EPSPS-sekvenser som maximerar eller minimerar genuttryck.

Jordbrukare, politiker och beslutsfattare behöver snarast en grundlig förståelse för riskerna med den stora användningen av bekämpningsmedel. Således är både bioinformatiska verktyg som avslöjar organismernas potentiella känslighet för bekämpningsmedel och väl replikerade, randomiserade och fältrealistiska experimentella studier utförda i olika miljöer nödvändiga. Den presenterade bioinformatiska metoden som är utformad för att undersöka organismers känslighet för glyfosat kan moduleras för andra bekämpningsmedel. På samma sätt kan metoderna för experimentell ekologi tillämpas för att studera alla relaterade ekologiska frågor. Tillsammans kan metoderna användas för att påvisa olyckor mellan fältobservationer, genomdata och användning av bekämpningsmedel. Alla presenterade metoder är ovärderliga vid riskbedömning. Bioinformatiska metoder kan till exempel användas för att övervaka mikrobiella anpassningar till jordbrukskemikalier och för att tillhandahålla en kvantitativ metod för att testa potentiella andra därmed sammanhängande risker, såsom en ökning av patogenernas resistens mot jordbrukskemikalier, negativa effekter på mikrober som används som biologiska kontrollmedel i integrerat växtskydd (IPM) och antibiotikaresistens hos bakterier.

Disclosures

Intressekonflikter: ingen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av Finlands Akademi (anslag nr 311077 till Marjo Helander).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939B To check the concentration and quality of PCR products
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192 For PCR reactions
GoTaq G2 DNA Polymerase kit Promega M7848 PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification
Invisorb Spin Plant Mini Kit INVITEK Molecular 1037100300 Genomic DNA extraction from plant tissues
Ion Chip Minifuge ThermoFisher Scientific 4479672 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM System ThermoFisher Scientific 4462921 For targeted sequencing of microbial PCR products
Ion PGM Torrent Server ThermoFisher Scientific 4483643 For targeted sequencing of microbial PCR products
Pippinprep SageScience PIP0001 For size fractionation of PCR amplicons
Pressure tank Berthoud 102140 For sprayin glyphosate based products in field
Primers Sigma Aldrich Custom-made For PCR amplification
Rotary tiller Grillo 984511 For tilling the soil in experimental plots
S1000 ThermalCycler BIO-RAD 1852196 For PCR amplification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 31, 117-165 (2000).
  2. Muola, A., et al. Risk in the circular food economy: Glyphosate-based herbicide residues in manure fertilizers decrease crop yield. The Science of the Total Environment. 750, 141422 (2021).
  3. Helander, M., Saloniemi, I., Saikkonen, K. Glyphosate in northern ecosystems. Trends in Plant Science. 17 (10), 569-574 (2012).
  4. Fuchs, B., Saikkonen, K., Helander, M. Glyphosate-Modulated Biosynthesis Driving Plant Defense and Species Interactions. Trends in Plant Science. 26 (4), 312-323 (2021).
  5. Helander, M., Saloniemi, I., Omacini, M., Druille, M., Salminen, J. -P., Saikkonen, K. Glyphosate decreases mycorrhizal colonization and affects plant-soil feedback. The Science of the Total Environment. 642, 285-291 (2018).
  6. Bai, S. H., Ogbourne, S. M. Glyphosate: environmental contamination, toxicity and potential risks to human health via food contamination. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (19), 18988-19001 (2016).
  7. Cuhra, M., Bøhn, T., Cuhra, P. Glyphosate: too much of a good thing. Frontiers in Environmental Science. 4, (2016).
  8. de Brito Rodrigues, L., et al. Impact of the glyphosate-based commercial herbicide, its components and its metabolite AMPA on non-target aquatic organisms. Mutation Research. 842, 94-101 (2019).
  9. Steinrücken, H. C., Amrhein, N. The herbicide glyphosate is a potent inhibitor of 5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 94 (4), 1207-1212 (1980).
  10. Bentley, R. The shikimate pathway--a metabolic tree with many branches. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 25 (5), 307-384 (1990).
  11. Richards, T. A., et al. Evolutionary origins of the eukaryotic shikimate pathway: gene fusions, horizontal gene transfer, and endosymbiotic replacements. Eukaryotic Cell. 5 (9), 1517-1531 (2006).
  12. Leino, L., et al. Classification of the glyphosate target enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) for assessing sensitivity of organisms to the herbicide. Journal Of Hazardous Materials. 408, 124556 (2021).
  13. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase. BioRxiv. , (2020).
  14. Rainio, M. J., Ruuskanen, S., Helander, M., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Puigbò, P. Adaptation of bacteria to glyphosate: a microevolutionary perspective of the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase. Environmental Microbiology Reports. 13 (3), 309-316 (2021).
  15. Helander, M., Pauna, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I. Glyphosate residues in soil affect crop plant germination and growth. Scientific Reports. 9 (1), 19653 (2019).
  16. Ruuskanen, S., Rainio, M. J., Uusitalo, M., Saikkonen, K., Helander, M. Effects of parental exposure to glyphosate-based herbicides on embryonic development and oxidative status: a long-term experiment in a bird model. Scientific Reports. 10 (1), 6349 (2020).
  17. Ruuskanen, S., et al. female preference and adverse developmental effects of glyphosate-based herbicides on ecologically relevant traits in Japanese quails. Environmental Science & Technology. 54 (2), 1128-1135 (2020).
  18. Mäki, A., Rissanen, A. J., Tiirola, M. A practical method for barcoding and size-trimming PCR templates for amplicon sequencing. Biotechniques. 60 (2), 88-90 (2016).
  19. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L. Microbial Ecology. 41 (3), 252-263 (2001).
  20. Lane, D. J. 16S/23S rRNA sequencing. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. , John Wiley & Sons. New York. 115-175 (1991).
  21. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. Plos One. 8 (8), 71360 (2013).
  22. Zheng, D., Alm, E. W., Stahl, D. A., Raskin, L. Characterization of universal small-subunit rRNA hybridization probes for quantitative molecular microbial ecology studies. Applied and Environmental Microbiology. 62 (12), 4504-4513 (1996).
  23. JoVE Supplementary Material. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass/JOVE_SM (2021).
  24. Alignments Conserved Positions. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/primers (2021).
  25. Protein Families. , Available from: http://pfam.xfam.org (2021).
  26. NCBI GenBank. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/genbank (2021).
  27. COG Database. , Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/research/cog (2021).
  28. Protein Data Bank. , Available from: https://www.rcsb.org (2021).
  29. EPSPSClass. , Available from: https://ppuigbo.me/programs/EPSPSClass (2021).
  30. Kristensen, D. M., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. ATGC database and ATGC-COGs: an updated resource for micro- and macro-evolutionary studies of prokaryotic genomes and protein family annotation. Nucleic Acids Research. 45, 210-218 (2017).
  31. ATG_NCBI. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/kristensen/ATGC/atgc_home.html (2021).
  32. COG2020. , Available from: http://ftp.ncbi.nim.nih.gov/pub/COG/COG2020/data (2021).
  33. CSC - IT CENTER FOR SCIENCE LTD. , Available from: https://www.csc.fi (2021).
  34. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215 (3), 403-410 (1990).
  35. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  36. Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples. Microbiome. 6 (1), 110 (2018).
  37. El-Gebali, S., et al. The Pfam protein families database in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 427-432 (2019).
  38. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  39. Galperin, M. Y., Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Expanded microbial genome coverage and improved protein family annotation in the COG database. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 261-269 (2015).
  40. Burley, S. K., Berman, H. M., Kleywegt, G. J., Markley, J. L., Nakamura, H., Velankar, S. Protein data bank (PDB): the single global macromolecular structure archive. Methods in Molecular Biology. 1607, 627-641 (2017).
  41. Raoult, D., Hadjadj, L., Baron, S. A., Rolain, J. -M. Role of glyphosate in the emergence of antimicrobial resistance in bacteria. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76 (7), 1655-1657 (2021).
  42. Liu, J., Gefen, O., Ronin, I., Bar-Meir, M., Balaban, N. Q. Effect of tolerance on the evolution of antibiotic resistance under drug combinations. Science. 367 (6474), 200-204 (2020).
  43. Peixoto, F. Comparative effects of the Roundup and glyphosate on mitochondrial oxidative phosphorylation. Chemosphere. 61 (8), 1115-1122 (2005).
  44. Peillex, C., Pelletier, M. The impact and toxicity of glyphosate and glyphosate-based herbicides on health and immunity. Journal of Immunotoxicology. 17 (1), 163-174 (2020).
  45. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schönbrunn, E. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13010-13015 (2006).
  46. Light, S. H., Krishna, S. N., Minasov, G., Anderson, W. F. An unusual cation-binding site and distinct domain-domain interactions distinguish Class II Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. Biochemistry. 55 (8), 1239-1245 (2016).
  47. Firdous, S., Iqbal, S., Anwar, S., Jabeen, H. Identification and analysis of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) gene from glyphosate-resistant Ochrobactrum intermedium Sq20. Pest Management Science. 74 (5), 1184-1196 (2018).
  48. Barry, G. F., Kishore, G. M., Padgette, S. R., Stallings, W. C. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases. United States Patient. , US5627061A (1997).
  49. Priestman, M. A., Funke, T., Singh, I. M., Crupper, S. S., Schönbrunn, E. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate. FEBS Letters. 579, 728-732 (2005).
  50. Carozzi, N., Carr, B., Hammer, P. E. Identification of a new class of EPSP synthases. World Intellectual Property Organization Publ.of the Int.Appl. without Int.search. , REP. WO2006US13161 (2006).
  51. Lira, J. M., Cicchillo, R. M., Nair, S. K. Novel class of glyphosate resistance genes. US Patent. , US20130217577A1 (2013).
  52. Funke, T., et al. Structural basis of glyphosate resistance resulting from the double mutation Thr97 -> Ile and Pro101 -> Ser in 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 284 (15), 9854-9860 (2009).
  53. Schönbrunn, E., et al. Interaction of the herbicide glyphosate with its target enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase in atomic detail. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (4), 1376-1380 (2001).
  54. Stalker, D. M., Hiatt, W. R., Comai, L. A single amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate. The Journal of Biological Chemistry. 260 (8), 4724-4728 (1985).
  55. Eschenburg, S., Healy, M. L., Priestman, M. A., Lushington, G. H., Schönbrunn, E. How the mutation glycine96 to alanine confers glyphosate insensitivity to 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase from Escherichia coli. Planta. 216 (1), 129-135 (2002).
  56. Achary, V. M. M., et al. Overexpression of improved EPSPS gene results in field level glyphosate tolerance and higher grain yield in rice. Plant Biotechnology Journal. 18 (12), 2504-2519 (2020).
  57. Huang, Z., Liu, Y., Zhang, C., Jiang, C., Huang, H., Wei, S. Molecular basis of natural tolerance to glyphosate in Convolvulus arvensis. Scientific Reports. 9 (1), 8133 (2019).
  58. Tall, T. A census analysis of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase and EPSP-associated domains. , (2020).
  59. Tall, T., Puigbò, P. The glyphosate target enzyme 5-Enolpyruvyl Shikimate 3-Phosphate Synthase (EPSPS) contains several EPSPS-associated domains in fungi. ATLA Summary of Proceedings. 76 (1), 6 (2020).
  60. Puigbò, P., Guzmán, E., Romeu, A., Garcia-Vallvé, S. OPTIMIZER: a web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research. 35, Web server issue 126-131 (2007).

Tags

Miljövetenskap utgåva 179
Kvantifiering av den potentiella effekten av glyfosatbaserade produkter på mikrobiom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, … More

Mathew, S. A., Muola, A., Saikkonen, K., Saloniemi, I., Helander, M., Puigbò, P. Quantification of the Potential Impact of Glyphosate-Based Products on Microbiomes. J. Vis. Exp. (179), e63109, doi:10.3791/63109 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter